分子荧光分析法实验讲义

1.3 荧光定量
F = K﹒I0﹒φf﹒C
I0：光源强度； φ f：荧光量子产率； C：荧光体浓度）
4800 4200 3600 3000 2400 1800 1200 600 0 550
C
560
570
580
590源自文库
600
610
620
Wavelength(nm)
（☆注意：在一定浓度范围内适用）
? 问题：
☆ 分子相互作用研究； ☆代谢动力学跟踪； ☆ 显微成像（物理迁移与化学衍化的原位“显迹”）
二、维生素B2含量的荧光法测定
2.1 实验原理
维生素Ｂ２（核黄素）在一定波长的 激发光照射下会发射出绿色荧光，根据荧 光强度在一定浓度范围内与荧光物质浓度 成正比，用标准曲线法对样品进行定量分 析，在线性良好的情况下，也可用浓度直 接读出被测样品的浓度。
1.1 荧光的产生
2 S2 1 V=0
2 S1 1 V=0
VR
发生激发 态反应
激发态能量的跃迁与转 化的形式和速率： A1,A2 吸收: 10-15 s VR 振动松弛： 10-12 s ic 内转化： 10-11 s
ic
VR
isc
T1
2 1 V =0
A1
A2
F
P
isc 系间窜越： 10-6 ~ 10-2 s F 荧光： 10-9 ~ 10-6 s P 磷光： 10-6 ~ 100 s
3 S0 2 1 V =0
分子内的激发和衰变过程
1.2 荧光光谱
• 当固定激发光波长和强度不变， 而记录荧光强度随波长变化的曲线， 称为发射光谱。若固定荧光最强处的 荧光波长不变而改变激发光波长，记 录荧光强度随激发光波长变化的曲线， 称为激发光谱。
1.2 荧光光谱 任何荧光化合物，都具有两种 特征的光谱：激发光谱和发射光 谱。 发射光谱 激发光谱
2.2 实验流程
1、VB2的荧光光谱的绘制 2、标准工作曲线的制作 3、未知液的测定
1.开机： 打开RF-5301荧光分光光度计的电源开关，打印机开 关，开启电脑。预热仪器20分钟。 2. 配制系列维生素Ｂ２标准溶液： 取5个干净的50ml容量瓶，分别加入1.0, 2.0, 3.0, 4.0 , 5.0ml浓度为10.0μg/ml的维生素Ｂ２标准溶液用水稀释 至刻度，摇匀。 3.仪器自检： 预热仪器20分钟后，双击电脑桌面上“RF-530XPC” 图标，仪器在计算机的引导下开始自检，约3分钟完毕，此 时仪器操作软件打开。 若此时软件为“光谱测定”模式，则点击“Acquire Mode”主菜单，在下拉菜单中选择“Quantitative”，此时软 件转为“定量测定”界面模式。
试比较荧光法与紫外-可见分光光度法的分析性能。
1.4 荧光仪的基本构造
？问题：荧光光度计与紫外-可见分光光度计在光路设置
上有什么不同？为什么？
1.5 分子荧光分析法的应用简介
★ 常规分析应用：
☆ 定性分析：φf；λex；λem；峰形等 ☆ 定量检测： F = K﹒I0﹒φf﹒C ☆ 其它（略）
★ 高端生化研究：
4. 参数设定： “定量测定”界面模式下，点击“Configure”主菜单， 在下拉菜单中选择“Parameters”菜单，则会自动弹出 “Quantitative Parameters”窗口，在此窗口中，需要设 置以下五个参数： 在“EX Wavelength”中填 270， 在“EM Wavelength”中填 525， 在“Slit Width[nm] EX”中填 10， 在“Slit Width[nm] EM”中填 10， 在“Sensitivity: High Low” 中选 Low，其他参数 选默认值，不要调整它们，参数设置好后，按“OK” 此时软 件自动回到“定量测定”界面模式。此时仪器参数设置完毕。
《仪器分析实验》 实验4 分子荧光光谱法测定 维生素B2的含量
一、分子荧光分析法简介
原子光谱（略） 光 谱 分 析 分子 光谱 分子发光 UV-Vis（紫外-可见） 分子吸收
(对光的吸收)
IR（红外）
光致发光 荧光、磷光 其它发光形式 如：化学发光等
1.1 荧光的产生
• 当被测物质受到光照后，被测物分子吸收了 具有特征频率的辐射能，分子从基态上升到激发 态，分子在较高能级的激发态时，它可能处于激 发态中各种振动状态的一种。然而由于分子通过 与溶剂分子，同类分子或其他分子的碰撞，而失 去振动能级，降低至激发态时的最低振动能级， 在此过程中并不发光。但当分子从激发态的最低 振动能级，即第一电子激发态的最低振动能级降 落至基态的各个不同的振动能级时，则以光的形 式辐射出能量，所辐射出的光即是荧光。
Relative Fluorescence Intensity
800
组成、结构与衍化信息
☆ 物质的化学结构 ☆ 环境与介质条件
Ex.
600
400
☆ 与其它溶质的相互作用 ☆ 反应动力学
200
0 250 300
Wavelength (nm)
350
400
450
500
550
600
Fluorescence Intensity
2.3 注意事项：
☆系列标液的测定顺序 ☆即放即测，防光降解 ☆荧光仪的开关机顺序
2.4 数据处理
1. 2. 3. 从荧光光谱图上读出最佳激发（λex）和发射波长（ λem） 用标准工作曲线法算出所配实测试液的浓度 计算样品中维生素B2的含量。
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5.空白溶液测试： 设置好仪器的工作条件后，把装有去离子水的样品池置于试样 架内，在荧光光路上插入ＵＶ－35滤光片，合上样品室盖子，在计 算机屏幕上点击“AUTO ZERO”，观察屏幕右下脚的基线值接近 零时，再点击“READ”读数，得空白溶液数值。 6.系列维生素Ｂ２标准溶液的测试： 把各标准样品按从稀到浓的顺序置于试样架内，和空白溶液测 试方法相同，分别测定不同浓度标准溶液的相对荧光强度。 7. 未知试样的测定： 将已配制处理好的未知试样装入样品池置于试样架内，用测定 标准溶液相同的条件，测其相对荧光强度。 8. 关机： 先关计算机，再关仪器，打印机；清洗样品池，容量瓶等玻璃 仪器，整理好仪器。