细胞核质蛋白分离

介绍
核蛋白抽提试剂可以从哺乳动物培养的细胞或组织中逐步分离和制备细胞质和细胞核提取物。

不变性的活性蛋白在不到两小时内纯化。

在细胞颗粒中加入前两种试剂会导致细胞膜破裂和细胞质内容的释放。

用离心法从细胞质提取液中提取完整细胞核后，用第三试剂从细胞核中提取蛋白质。

用这种产品提取的核和细胞质组分提取物一般污染率不到10%，这对于大多数涉及核提取物的实验来说是足够的纯度
核抽提物比起全细胞裂解物通常更适合于进行基因调控研究。

全细胞裂解液中的细胞成分对核蛋白的相互作用和稳定性有不利影响，核蛋白更集中于核提取物，而非全细胞裂解物。

核提取物/试剂与多种下游应用兼容（包括Western blotting，BCA蛋白定量分析（产品编号23225），凝胶移位（产品编号20148），报告基因和酶活性的测定）
重要产品信息
●此试剂盒适用于新鲜（未冷冻）的细胞或组织样品。

使用蛋白酶抑制剂维持提取物的完
整性和功能。

使用前，将蛋白酶抑制剂加入CRE I和NER浓缩物中以减少试剂稀释（浓缩蛋白酶抑制剂eg.100x）。

不需要添加蛋白酶抑制剂到CER II。

●如果在随后应用中需要大量的核提取物或出现问题，透析前用核提取物清除多余的盐。

试剂盒中的洗涤剂是不可透析的，但它主要是在细胞质中。

使用Thermo Scientific™Slide-A-Lyzer™小型透析装置进行透析。

另外，无回收蛋白或条块分割的不利影响下，NER 用于提取液的体积可以减小2倍可以得到更集中的核提取物。

●在4°C条件下执行所有离心步骤，保持细胞样本和提取物在冰上。

额外所需材料
●蛋白酶抑制剂
●磷酸盐缓冲盐水(PBS)
细胞培养制备
●贴壁细胞，用胰蛋白酶-EDTA消化，然后在500g离心5分钟。

对于悬浮细胞，通过离
心在500G 5分钟收获。

●用PBS重悬细胞颗粒冲洗细胞
●1-10×106细胞转移至1.5ml离心管，并在500G 离心2-3分钟
●使用吸管小心地去除和丢弃上清液，使细胞颗粒尽可能干燥。

●在细胞中加入冷的CRE I（表1）。

使用表1所示的试剂体积进行细胞质和核蛋白提取
不同细胞体积对应的试剂体积
红细胞压积(µL) CER I (µL) CER II (µL) NER (µL)
10 100 5.5 50
20 200 11 100
50 500 27.5 250
100 1000 55 500
*Hela细胞2×106细胞相当于20µL红细胞体积.
组织制备
●把20-100mg组织剪成小块并在放在微量离心管
●用PBS清洗组织。

5分钟，500g离心组织
●使用吸管，小心地去除和丢弃上清液，使细胞颗粒尽可能干燥。

●利用Dounce匀浆器或组织研磨机使组织在适当体积的CRE I中研磨（表2）进行细胞
质和核蛋白提取，使用表2所示的试剂体积。

不同组织量对应的试剂体积.
组织质量(mg) CER I (µL) CER II (µL) NER (µL)
20 200 11 100
40 400 22 200
80 800 44 400
100 1000 55 500
不同类型的组织可能需要更多或更少的试剂
最佳提取细胞质和核蛋白的重量。

细胞质和核蛋白提取
根据细胞体积（表1和表2）确定试剂比例。

保持CER CER II：NER试剂比在200:11:100µL。

1.设置最高涡流速度震荡试管15秒，使细胞颗粒完全悬浮。

在冰上培养管10分钟。

2.在试管中加入冰的CER II
3.设置最高涡流速度震荡试管5秒，在冰上培养管1分钟
4.设置高涡流速度震荡试管5秒，最大转速离心5min（~16000g）
5.立即将上清液（细胞质提取物）转移到干净的预冷管中。

把管子放在冰上直到使用或储
存（见步骤10）。

6.将含有核的第4步中产生的不溶性成分（颗粒）悬浮在冰的NER中。

7.设置最高涡流速度震荡试管15秒。

将样品放在冰上，每10分钟震荡15秒，，总共40
分钟
8.离心机在最大速度（~16000g）离心10分钟
9.立即将上清液（核提取物）转移到干净的预冷管中。

把管子放在冰上直到使用或储存
10.储存提取物- 80°C，直到使用。