生物表面活性剂的优化生产及发展前景

第31卷生物表面活性剂的优化生产及发展前景

张林达，刘红玉*，曾光明，张利，贾彩云，张慧

（湖南大学环境科学与工程学院，湖南

长沙410082）

摘要：生物表面活性剂（Bio-surfactant ）是由微生物产生的具有高表面活性的生物分子。由于其对生态系统无毒害作用，且可生物降解，因此，在提高原油产收率和环境污染治理等各方面得到了广泛应用。然而能否大幅度提高生物表面活性剂发酵产量是其能否实现商业化的一个首要问题。为此文章纵观了目前提高产量的研究重点，并对应用诱变育种和构建基因工程菌手段提高产量的发展前景作了展望。

关键词：生物表面活性剂；生产；前景中图分类号：X17

文献标志码：A

文章编号：1003-6504(2008)12-0084-04

Prospect and Optimizing in Production of Biosurfactant

ZHANG Lin-da ，LIU Hong-yu *，ZENG Guang-ming ，

ZHANG Li ，JIA Cai-yun ，ZHANG Hui

（School of Environment Science and Engineering ，Hunan University ，Changsha 410082，China ）

Abstract ：Biosurfactant as a high surface active agent synthesized by microorganism is widely used due to its low toxicity to environment.However ，output of biosurfactant by fermentation is one of the key problems on how to make it into market.Means used in enhancing the production of biosurfactant are proposed and future development is prospected.Key words ：biosurfactant ；production ；prospect

生物表面活性剂（bio-surfactant ）是由微生物代谢

过程中分泌出的具有一定生物活性的次级代谢产物[1]，和合成表面活性剂一样，生物表面活性剂由亲水基和疏水基两部分组成，但生物表面活性剂比合成表面活性剂更具潜在的优势，如结构多样性、生物可降解性、对环境的温和性等，从而在医药、食品、化妆品、环境

保护等众多工业领域展示了其独特的应用前景；

人类环保意识的增强，更加快了生物面活性剂取代合成表面活性剂的发展进程[2]。然而目前，生物表面活性剂的应用远不如合成表面活性剂广泛，从与合成表面活性剂相竞争的角度而言，生物表面活性剂在商业上的应用程度取决于其成本与性质[3]，其中一个重要原因是生物表面活性剂产量太低[4]。

影响生物表面活性剂产量的主要因素有微生物菌种及其发酵条件。目前产生物表面活性剂菌株已经有大量报道，并对生物表面活性剂的产物结构和类型也都有了较深程度研究[5-7]。但生物表面活性剂的产生量小、结构和成分相对复杂、性能也有较大差异，使其

工业化生产与运用还存在一定的困难。目前为止，

国内外学者对生物表面活性剂及其生产菌进行了多方

面的研究，来提高产量、降低成本、生产出高性能的生物表面活性剂。本文对提高生物表面活性剂产量的各种方法进行了总结，并对其发展前景作了展望，为这方面的研究工作者提供一定的借鉴作用。1方法

1.1

产表面活性剂菌株的快速高效筛选模式的选择生物表面活性剂是20世纪70年代后期国际生物工程领域中发展起来的新课题。期间各国学者对产生物表面活性剂及其机理进行了深入的研究与分析，尤其是发现了生物表面活性剂相比合成表面活性剂有着无比优厚的有利条件和潜在的市场价值后，各国学者对产生物表面活性剂的菌株进行了广泛而深入的筛选，通过各种定性定量检测手段，获得了多种类型的生物表面活性剂和产生菌。已知的表面活性剂有五大类型，已筛选成功并通过菌种鉴定得到的，不仅有众多种类的细菌，还有放线菌和真菌等。

生物表面活性剂的产量首先依赖于生产菌[8]，而选择一种快速、准确、有效的筛选方法是获得高产菌株的关键。经过了三十多年的摸索，目前已有很多方法

收稿日期：2008-01-21；修回2008－03－11

基金项目：国家高新技术研究发展（863）项目（2004AA 649370）；湖南省自然科学基金（05JJ30021）

作者简介：张林达（1978-），男，硕士研究生，研究方向为生物表面活性剂的研究与应用，（手机）013467539532（电子信箱）wolinda ﹫ ；*通讯作者，从事环境分子生物学的研究，（电子信箱）hyliu ﹫ 。

Environmental Science &Technology

第31卷第12期2008年12月

Vol.31No.12

Dec.2008

第12期

如毛细上升法、威廉米吊片法、环法、压泡法及悬滴法等测定液体表面张力或液体之间的界面张力来确定生物表面活性剂的浓度，从而定性地判定环境中生物表面活性剂生产菌的存在。在此基础上，很多学者又摸索出了很多新的筛选方法，不仅更快速有效鉴定了生产菌的存在，还对其浓度进行了半定量甚至定量鉴定，从而建立了快速筛选模型，为筛选高产菌株奠定了基础。Bodour等[9]对Jain等报道的液体分散法进行了改进，不仅更有效的筛选出了生产菌，还定量的检测出了表面活性剂的浓度。宁长发等[10]利用生物表面活性剂具有溶血性和在生产过程中能使蓝色凝胶平板变色等特性，并通过对发酵液的排油活性、表面张力和乳化性能及对产物的色谱分析等定性定量检测手段的综合利用，建立了产表面活性剂菌种的快速筛选模型。

通过对生物表面活性剂产生机制的研究发现：疏水性物质（尤其作为微生物的生长基质时）的长期存在对该生境中的微生物有诱导产生产表面活性物质的作用。为此，人们一方面也多在长期受油污污染的地方进行采样和富集培养；同时，在菌种分离筛选时，也是通过在筛选培养基中添加油性物质来实现。沈薇等[11]即在南京炼油厂原有污染的土壤中，通过对油污土壤的富集培养和筛选，筛选出2株能产降解原油的表面活性剂丝状真菌。

1.2菌种的重建改良

通过对表面活性剂生产菌株的结构改造也是一种获得高产菌株的有效手段。这里所谓结构改造指的是菌种细胞内部基因结构的改造，主要是改变目的基因序列，从而获得高产菌株。可以通过诱变育种技术和基因克隆来实现。

诱变育种，主要是采用紫外灯照射或加致突变剂等方法来使一些菌株发生基因突变，再通过选择筛选，可以获得正向突变株，即产量明显提高的菌株。Lin S C等[12]在研究中向2mL的B.licheniformis JF-2培养液中加入诱变剂N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍（MNNG），终浓度为0.1mg/mL，经过培养筛选后，得到一株突变菌株，发酵试验发现比原菌株的产量提高了12倍。Ohno A等[13]也通过类似的物理或化学突变的方式得到了预期效果。Zulfiqar Ali Raza等[14]利用植物油精炼厂废弃物作为发酵原料，得到一株铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）S8，经400Gyγ-射线诱变得到突变菌株EBN-8，鼠李糖脂产量高达8.5g/L。刘七等[15]通过使用紫外和甲基磺酸乙酯复合诱变，筛选出一株性能优良的变异新菌株，界面张力降低32.8%，能在72℃高温和30%矿化度下生长，有望用于微生物采油研究。沈薇等[16]采用UV-UV+LiCl 对铜绿假单胞菌的野生菌株进行诱变，筛选出一株糖脂产量较高的菌株，可将产量由4.1g/L提高至6.8g/L，并通过对其摇瓶发酵工艺的多因素正交优选实验，将产量提高到8.93g/L。

基因克隆（gene cloning），即DNA重组，是近十来年伴随分子生物技术发展起来的新兴技术。现在，我们可以充分利用现有的基因分析和操作方法，对目的基因结构和功能进行研究，并通过恰当的酶切和重组，再转入适合的受体菌种内，即可构建具有高产和抗性的基因工程菌。国内外学者对微生物产表面活性剂的分子结构和分子机制进行了广泛而深入的研究，发现Pseudomonas aeruginosa产糖脂类活性物质和Bacillus subtilis产表面活性素分别受到rhlA、rhlB、rhlAB、lasR和srfA、sfp、comP等相关基因的表达和调控[17-22]。Urs A等[23]率先利用基因克隆手段，将rhlAB 基因在大肠杆菌中得到了表达，产生了生产鼠李糖脂所必须的酶蛋白，虽然最后没有鉴定出鼠李糖脂的存在，但对通过分子生物手段构建基因工程菌，实现表面活性剂的高产起到了积极的引导作用。Dogan I等[24]将vgb基因插入到污泥戈登氏菌（Gordonia amarae）中，并使其进行稳定表达，发酵实验显示其产物海藻糖脂的产量提高了4倍多。Wei YH等[25]还通过在粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）基因序列中插入2kb 链霉素耐受性ΩDNA片段构建了同基因菌，使其产表面活性剂的量比原菌株提高了32%~50%。

1.3发酵条件的优化

除了生产菌种外，发酵的营养条件和培养条件对特定菌种生物表面活性剂的生产和产量也起着关键性的作用。研究发现，碳源对微生物表面活性剂的产量和结构有决定作用，烃类物质的存在尤其是烃链长度对培养基中产表面活性剂的浓度也会有着显著的影响[26-30]；限氮环境能显著提高的生物表面活性剂产量[27-28]；另外，培养基的C、N、P浓度，pH值、离子强度的各元素含量及之间的比例和接种菌的菌龄及接种量等都对生物表面活性剂的合成有影响[29]。由于表面活性剂是菌种生长的次级代谢产物，主要生产期在菌种对数生长后期或休止期，为此，接种适量的适龄菌种到培养基中进行发酵生产，也对提高表面活性剂的产量起到促进作用。

为此，人们在研究提高生物表面活性剂的发酵产量时，都采取了综合考察培养基中各种影响因子的办法。卢国满等[30]通过对从植物油油污中筛选获得的12株菌株中选定2株自然高产菌株，进行了单因素实验和多因素正交实验，得出了最佳发酵培养条件，使菌

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