第十六章 标记抗体技术

第十六章标记抗体技术

1、免疫荧光标记技术的概念/所用荧光素的要求/基本原理/操作步骤/注意事项/实际应用

（一）概念：免疫荧光标记技术是指用荧光素对抗体或抗原进行标记，然后用荧光显微镜观察荧光以分析示踪相应的抗原或抗体的方法（二）荧光素要求：作为蛋白质标记用的荧光素须具备①有与蛋白质分子形成稳定共价键的化学基团，而不形成有害产物②荧光效率高，与蛋白质结合的需要量很小③结合物一般在储存条件下稳定，结合后不影响抗体的免疫活性④作为组织学标记，结合物的荧光必须与组织的自发荧光有良好的反衬，以便能清晰地判断结果⑤结合程序简单，能制成直接应用的商品，可长期保存。可用于标记的荧光素有FITC,RB200,四甲基异硫氰酸罗丹明。

（三）基本原理：将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应

（四）操作步骤：

①标本制备：

涂片或压印片：细菌培养物、感染动物的组织或血液、脓汁、粪便、尿沉渣

冰冻切片或低温石蜡切片：组织学、细胞学和感染组织

盖玻片：上面培养单层细胞

首要要求是保持抗原的完整性，并尽可能减少形态变化，抗原位置保持不变。标本要相当薄，有适当的固定处理方法

②固定：常用丙酮和95%乙醇，室温固定15-30min后，用PBS反复冲洗，干后即可染色。

目的：防止被检材料从玻片上脱落，消除抑制抗原抗体反应的因素。检测细胞内的抗原，用有机溶剂固定可增加细胞膜的通透性而有利于荧光抗体渗入。

③检测：

A、直接法：直接滴加2-4个单位的标记抗体于标本区，置湿盒中，于37度染色30min左右，然后置大量ph7-7.2PBS中漂洗15min，干燥、封载，显微镜镜检

B、间接法：将标本先滴加特异性的抗血清，置湿盒中，于37度作用30min，PBS漂洗5min后，再加入FITC标记的抗抗体，置湿盒中，37度作用30min，PBS漂洗5min，干燥、封载，显微镜观察

（五）注意事项：

①由于荧光容易淬灭，一般仅能维持几个小时，因此，荧光二抗应避光保存，即从加入荧光二抗以后的步骤中都要尽量避光操作。封片后应尽早照相，目前有市售的荧光增强剂，可使荧光在4度保存1-2周仍不淬灭

②常用的荧光素有以下几种：绿色荧光：FITC,Alexa Fluor488和GFP；红色荧光：TRITC,Cy3，Alexa fluor568&594和MitoTrackerRed；蓝色荧光：Hoechst，DAPI；黄色荧光：YFP,Fuo-3和Rhoda-mine123

③不同的荧光素激发的波长不同，因此，选用滤光片时要注意。一般紫外线的激发波长为334-365nm，蓝光的激发波长为435-490nm，绿光的激发波长为546nm左右

④荧光显微镜应提前至少15min打开汞灯预热，关闭30min后方可再开启

⑤免疫荧光的组织要求很高，载玻片即盖玻片要干净无杂质

（六）实际应用：

2、放射免疫分析的概念/所用放射性元素要求/基本原理/操作步骤/

注意事项/实际应用

（一）概念：是将放射性同位素测量的高度敏感性和抗原抗体反应的高度特异性结合起来而建立的一种免疫分析技术

（二）放射性元素的要求：①低序号的常见元素，便于置换化合物中的同种元素进行标记②放射强度低或中等，降低对操作人员的危害③半衰期适中，既能保持检测时间，又便于环境中的处理。常用3H,125I,32P,35S

（三）基本原理：

（四）操作步骤

液相放射免疫测定（放免通常指液相法）

① 试验基本过程：

（1）适量处理待测样品

（2）按一定要求加样，使待测抗原与标记抗原竞相与抗体结合（3）反应平衡后，加入分离剂，将B和F 分开

（4）分别测定B和F的脉冲数

（5）计算B/F值或B%，在标准曲线上查待测抗原的量

2 加样与反应

有平衡饱和法和顺序饱和法

平衡饱和法：将已知量的标记抗原*Ag和待测抗原相结合，然后加入抗血清（Ab），孵育一段时间，使反应达到平衡。

顺序饱和法：将待测抗原与限量抗血清混合，孵育一段时间后，再将标记抗原加入。因本法中待测Ag优先与Ab结合，故更敏感。

顺序饱和法：

标记抗原的量应按制作标准曲线的量加入。抗血清应稀释成能结合50%标准抗原的稀释度。孵育时间按不同检测物而异，一般用4℃24h。建立方法时应优化检测条件。

3 分离与测定

（1）吸附法活性炭表面吸附蛋白时，就不能吸附大分子抗原抗体复合物，只能吸附游离的F。离心，就可以将B与F分离。

（2）化学沉淀法PEG（聚乙二醇）可以将B沉淀，从而将B与F 分离。

（3）双抗体沉淀法：在反应液中加入一定的抗抗体，即可将B沉淀下来。

（五）注意事项

（1）编号：第一排是标准管：根据标准品浓度由低到高A，B，C，D，E，F，G……；第二排是被测样品1，2，3，4，5，6，……。（2）加样要准确，移液器的使用（两个档位，一档吸人，二档排出）吸头（一个标本一个吸头，避免互相污染）。加试剂：先看瓶签，再摇匀，最后吸人。（标记物一般为红色，一抗为兰色）。

（3）温育时间要保证：按说明书中所要求的时间温育，可以延长，不能缩短。

（4）分离剂加入：混匀静置时间，可以延长，不能缩短。保证抗原抗体复合物与第二抗体的充分结合。

（5）温度：注意观察水浴箱的水温，误差不能太大，为±1℃ ，室温21℃左右。

（6）离心时间：也应按说明书中所要求来操作，转速一般为3 500r/min。往离心机里放反应管时，尽量让它直立（因为倾斜可能会使液体流出）。吸上清液时，沉淀物在试管底部，真空泵的吸头头部不能直接插人到试管底部中央（会吸走沉淀物，而我们的目的是分离保留沉淀物），应该使吸头贴着试管管壁往下放，并且试管要稍微倾斜，但要在即将插到沉淀物边缘时停止，快速上升取出。少留一点点上清液也可。主要是保证沉淀物完整。