圆二色光谱分析蛋白质构象的方法及研究进展

进展做一评述 %
"# 蛋白质的圆二色性及其测量
", !# 蛋白质的圆二色性 蛋白质是由氨基酸通过肽键连接而成的具有特 定 结 构的 生 物 大 分 子 % 蛋 白 质 一 般 有 一 级 结 构 $ 二
! #!! %( 超二级结构 $ 结构域 $ 三级结构和四 级 结 构 几 个 结 构 层 次 ’ % 在 蛋 白 质 或 多 肽 中" 主要的光 级结构 $
!# 引 ## 言
随着人们对生命科学的日益关注 " 分析化学的深 入发 展将 越 来 越 重 视 和 加 强 生 物 分 析 % 特 别 是 人 类基因测序工程完成后 " 因生物 $ 医学上的需要 " 使与蛋白质的相关研究成为生物分析中的重要课题 % 自5 射线技术 " 首次揭示肌红蛋白的折叠 结构以来 " 蛋白质 的研究 从氨 基 酸 残 基 序 7 3 R 6 7 G 采用 K & 列的测定 " 深入到空间结构 构象的确 定 % 近 年 来 " 人 们 发 现 疯 牛 病$ 克 雅氏病和震颤病等神经退行性 & & ’" %( 疾病是由 0 病蛋白所致 " 而构象变化在 病蛋白 的致病 因素中 起着 至关重 要的作 用 ’ % 这使 6 B + 3 0 6 B + 3 人们进一步认识到蛋白质的构象对其生理功能的巨大意义 " 要深入理解蛋白质的生物活性 " 就必须了解 确定蛋白质构象最准确的方法是 K \ 射 线晶体 衍射 " 但对 结构复 杂 $ 柔 它的构象及其相关变化 % 目前 " 性的生物大分子蛋白质来说 " 得到所需的晶体结构较为困难 % 二维 $ 多维核磁共振技术能测出溶液状态 下较小蛋白质的构象 " 可 是 对 分 子 量 较 大 的 蛋 白 质 的 计 算 处 理 非 常 复 杂%相 比 之 下" 圆二色! 2 B 6 ; N C E 6 光谱是研究稀溶液中蛋白质构象的一种快速 $ 简单 $ 较准确的方法 % R B ; @ 6 + B 8 4 简称 2 W# ’ "( 相关的研究方法陆续有报 ’ H -年" U 6 7 7 3 O B 7 C R最 早 用 2 W 光谱数据估计了蛋白质的构象 "
##D H 数据拟合计算蛋白质二级结构
#$ !#D H 数据拟合计算蛋白质二级结构的基本原理及常用方法 由于 % 螺旋结构的特征峰 & 早期就曾利用这两处的摩尔椭圆度 " % %和% # (3 4 是’ & "# "# % # (或 " % % % 来简
# "& ) H 单估计 ’ 螺旋的分量 " ! & "# " % (% $ % # # # # # #" " "# 8 % # ( N! ’ LM $ 其中 & 螺旋所占分量 & 即’ 螺旋所含的氨基酸残基与整个蛋白质氨基酸残基数的百分 比 ) 式 $ & & "% 8 ’ 是’ 中的常数是根据实验推出的经验值 ) 由于该方法只 考虑 了 ’ 螺 旋在单波 长的贡 献 & 而忽 略 了 蛋 白 质 中 &
## " ( -
通常近似为 !
" $ % ^" " # # % "# ( ! 蛋白质的 2 即’ W 光谱一般分为两个波长范围 & $ (!% ) #3 4 为远紫外区 2 W 光谱 & % ) #!" % #3 4为 近紫外 区 2 W 光 谱) 远 紫 外 区 2 W 光谱反映肽键的 圆二色性 ) 在蛋白质 或 多 肽 的 规 则 二 级 结 构 中 & 肽键 排列的方向性决定了肽键能 是高度有规 律 排 列 的 & 级跃迁的 分 裂 情 况 ) 因 此 & 具有不同二级结构的蛋 白质或多肽所产生 2 吸收的强弱都 不 W 谱带的位置 *
谱研究蛋白质三级结构具有独特优点 " 发展了 用 远 紫 外 2 W 光谱辨认蛋白质三级结构的方法及相关程
" !!" H( 序’ & 此外 " 近紫外圆二色 ! 作为一种灵敏的 光谱 探针 " 可反映蛋白质中芳香氨基酸残 * 7 E 6 & /T 2 W# " $!" -( 二硫键微环境的变化 ’ %2 基$ W 光谱技术作为研究溶液状态下蛋白质或多肽构象的一种重要手段 " ( ! #!) # 已受到研究者的广泛关注 ’ % 本文就 2 实验 技术及 其研究 W 光谱技术分析蛋白质构 象的基 本原理 $
& & & @ 7 C B ; E C & 8 @ 7 7 ? & ? N 6 3E 3 R0 %; + 3 O ຫໍສະໝຸດ Baidu 6 4 E & ? B R 7 8 B 3 ? @ 7 ’ ) ) ? B + 3
$ 螺旋 $ ’$ 折叠$ % ’$ 转角$ !% & & @ 7 C B Z% & & 8 @ 7 7 ? & & ,% ’ ’ -% ) ) ) ) % ’ $ ( 脯 氨 酸& "% ? N 6 3 0 %$ #, ’4 + C F醋酸溶液中的聚 & G & + C & D P ( % ) FE ; 7 ? B ;E ; B R 6 + C B 3 7 B 3#, ’4 + C D
圆二色光谱分析蛋白质构象的方法及研究进展
% ’ % % 沈星灿’! # 梁 # 宏 $ # 何锡文 # 王新省
’ % ! 广西师范大学化学化工学院 " 生物无机研究所 " 桂林 ) # 南开大学化学系 " 天津 " # ! ’ # # ! # # # $ ’ ## !
摘 # 要 # 介绍了远紫外圆二色光谱数据计算蛋白质二级结构 " 辨认蛋白质三级结构类型的原理 $ 拟合方法 $ 实 研究蛋白质中芳香氨基酸残基 $ 二硫键微环境的变化作了简单介绍 % 验技术 % 对近紫外圆二色作为光谱探针 " 关键词 # 圆二色 " 蛋白质二级结构 " 蛋白质三级结构 " 评述
第" %卷 % # # !年"月 #### #######
分析化学 ! I J * K .L/1 K/ J# # 评述与进展 2 @ B 3 7 8 7M + N 6 3 E C + O1 3 E C ? B ; E C2 @ 7 4 B 8 ? 6 P P
第"期 #### ##### " ( (!" !
其它二级结构对 " 的贡献 & 具有误差 ) 但它的优点 是 可 以 快 速 地 收 集 这 两 点 的 数 据 & 特别是在动力学 "#
## " #
分 析 化 学
第" %卷
和热力学的研究中 ! 可作为光谱探针对 ’ 螺旋的变化做简单的推算 " & 利用 2 假设蛋白质在波长 * 处的 2 是蛋 W 数据更完全拟合计算二级结构的基本原理是 # W 信号 *! 白质中各种二级结构组分的线性加合 ! 则有等式 #
活性基团是肽链骨架中的肽键 $ 芳香氨基酸残基及 二硫 桥键 % 当 平面圆 偏 振 光 通 过 这 些 光 活 性 的 生 色 基团时 " 光活性中心对平面圆偏振光中的左 $ 右圆偏振光的吸收不相同 " 产生的吸收差值 " 由于这种吸收 差的存在 " 造成了偏振光矢量的振幅差 " 圆偏振光变成 了椭 圆偏 振 光 " 这 就 是 蛋 白 质 的 圆 二 色 性%圆 二 色性的大小常用摩尔消光系数差 ( 来 度 量" 圆二色性也可用摩尔椭圆度’ 来 度 量" 它 =\’ ); 4\’ # !! "( 与摩尔消光系数差之间的换算关系式为 * ! ) # #! ’ C 3 ’ # "(L ! ! G M 9# #
真空紫 外 2 光 路 必 须 使 用 大 通 量* 高纯度 * 一般选用光路径为 W 谱 的 测 试 要 求 很 高& % 洗 涤& 以减少光吸收 ) 此外 & 为减少光谱的失真 & 响应波长应小于 2 # o # )!’44 的圆形石英测试池 & W 峰半高 宽的 ’ ( $ 通常蛋白质是 ’ ) 采用慢的扫描速度和较长的响应时间可以提高 2 ’ # )3 4% W 的信噪比 ) 必要 时& 用数据平滑算法和傅里叶变换对谱图进行平滑处理 & 可得到较高质量的光谱图 )
) ’# 该方法的误差一般 可 达 到 )‘ " )更 精 确 的 方 法 有! 定 量 氨 基 酸 分 析’ 用 收信号与蛋白质的构象有关 & # ) % ) "# 缩二脲方法测量多肽骨架浓度 " 或测氮元素的浓度 " ’ 也可以在完全变性条件下测芳香氨基酸残基的 ) !& ) )# 吸收 & 来确定蛋白质的准确浓度 " )
% # # % & # & # $ 收稿 & % # # " & # % & ’ ( 接受 本文系国家自然科学基金 ! # $ 广西自然科学基金 ! 桂科青 # # 和高校优秀青年教师奖励计划资助项目 * + , % # % H ’ # # ’ " " # % %
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第"期
沈星灿等 ! 圆二色光谱分析蛋白质构象的方法及研究进展
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其中 ! 2 为第2 种二级结构在波长$ 处的 2 W 读数 ! 2 种 二级 结构所 占的分 量 " 若 忽略噪 声及 8 2 为第 $! 其它因素对 2 并假设溶液态蛋白质与晶体中的二级结构相同 ! 则可利 用已知 二级结 构的 W 光谱的影响 ! 蛋白质或多肽的 2 对 未 知 蛋 白 质 的 二 级 结 构 进 行 拟 合 计 算! 能得出’ 螺 旋& 折 W 光谱作为参考 数 据 ! & & ) 叠& 转角 & 无规线圈等结构所占的 分 量 8 螺 旋& 折叠结构还能分别计算出规则和扭曲两种不 & & & 2" 对 ’ ) ) 同结构的分量 " 已用于拟合的参考蛋白 质 共 有 ! 其精确结构主要是通过 K 射线晶体衍射或核磁 ( 种! &
!!’ %( % 特别是近十几年来 " 用远紫外圆 二 色 ! 数 据 分 析 蛋 白 质 二 级 结 构" 不但在计算方 道’ I E 6 & /T 2 W# ’ "!" #( 法和拟合程序上有了极大地发展 ’ " 而且随着 K 射线晶体衍射 与核磁 共振技 术的 提高 " 越来越 多的 & ’’!" !( 蛋白质的精确构象得到测定 " 为2 %研究者还发现用 2 W 数据的拟合 提 供了 更 精确 的数据 库 " W光
H# 相同 ) 如图 ’ 所示 " ! 螺旋结构在靠近’ & %3 4有 ’
一正的谱带 & 在% % %和% # (3 4 处 表现 出 两 个 负 的 特 征肩峰谱带 ’ 折叠的 2 & W 谱在 % ’ H3 4 有 一 负谱 带 & ) 在’ 转角在% ( )!% # #3 4 有一正 谱 带 ’ & # H3 4 附近 ) 有一正 2 而左 手 螺 旋 0 W 谱带 & %结构在相应的位置 远紫外 2 能反映出蛋白质或多肽链二级结构 的 W 谱& 信息 ) 尽管 & 处于不对 称 微 环 境 的 芳 香 氨 基 酸 残 基 * 二硫键也具 有 圆 二 色 性 & 但它们的 2 W 信号出现在 这些信息可以作为光谱探针 % ) #!" % #3 4 近紫外区 & 研究它们不 对 称 微 环 境 的 扰 动 & 对肽键在远紫外区 的2 W 信号并不造成干扰 ) ", "#D H 测量的样品准备及条件选择 由于 2 灵敏的光谱技术 ) 所以 & 样品的准备及测量条件的选择对 分析计 算蛋 白质 W 是一种定量的 * 尤其是一些蛋白质的构象信息出现 在低 ’ 对 试剂和 缓冲 构象的准确性至关重要 & )3 4 的真空 紫外区 & 体系的要求更高 ) 测试用的蛋白质样品中应避免含有 光吸 收的 杂质 & 缓冲剂和溶剂在配制溶液前最好 做单独的检查 & 透明性极好的磷酸盐可用作为缓冲体系 ) 蛋白质最佳浓度的选择和测定 & 决定 2 W 数据计算二级结构的准确性 )2 W 光谱的测量一 般在 蛋白 ( 的稀溶液中进行 & 溶液最大的吸收不 超过 %) 稀溶液 可减 少蛋白 质分子 质含量相对低 $ #, # ’!#, %9 F% 间的聚集 ) 但如果太稀 & 则导致蛋白质过多地吸附在容器壁上 & 影响实验的准确性 ) 确定蛋白质的精确 浓度是计算样品的二级结构的关键 & 一般蛋白质在 % 但此 处吸 ( #3 4 附近的 消光 系数可 用来计 算浓 度 &
图 ’#’ 螺旋 & 折叠 & 转角及 0 & & & % 结构多肽的 2 W谱 ) ) 有负的 2 根据所测得蛋白质或多肽 的 # W 谱带 ) 因此 &
I B , ’# 2 B 6 ; N C E 6R B ; @ 6 + B 8 4$ 2 W% 8 7 ; ? 6 E+ OD + C 7 & 9 D P D D