红细胞检验基本方法2(2014)

红细胞检验的基本方法2孔虹kongh@第三节巨幼红细胞贫血实验室检查(megaloblastic amemia，MgA)叶酸和/或维生素B12缺乏或某些影响核苷酸代谢的药物，导致细胞核脱氧核糖核酸（DNA）合成障碍，核发育障碍所致的贫血。

也称脱氧核苷酸合成障碍性贫血。

特点–呈大细胞性贫血–骨髓幼红细胞巨幼变–累及粒系和巨核系红细胞核苷酸代谢•叶酸和维生素B12在DNA合成中的作用•叶酸的代谢•维生素B12的代谢•叶酸主要由食物供给•叶酸结合蛋白（FBP）：对叶酸的吸收、转运、贮存有意义•体内叶酸贮存量：５-20mg,每天需要量200μg•叶酸及其代谢产物主要由肾排泄叶酸缺乏•摄入不足营养不良（绿叶蔬菜缺乏或过分烹煮），酗酒，婴儿未加辅食•需要量增加妊娠及哺乳，婴幼儿生长及青少年发育期，甲亢，溶血性疾病，恶性肿瘤，脱落性皮肤病（皮肤癌、银屑病）•吸收利用障碍空肠手术，慢性肠炎，热带口炎性腹泻，麦胶肠病及乳糜泻，药物干扰（叶酸拮抗剂、抗惊厥药物、抗疟药、抗结核药），先天性酶缺陷（缺乏5，10-甲酰基四氢叶酸还原酶等）•丢失过多血液透析维生素B12的代谢•来源：维生素B12来源于食物•体内维生素B12贮存量：４-５mg,每天需要量２-5μg•吸收与转运：维生素B12-内因子复合体促进维生素B12的吸收•影响其吸收因素：胃酸、胃蛋白酶减少，内因子缺乏，胰蛋白酶缺乏•参与体内多种生化反应：DNA合成，腺苷钴胺参与甲基丙二酰辅酶Ａ转变为琥珀酰辅酶Ａ的反应．•排泄途径：经尿液、粪便排出维生素B12缺乏•摄入不足营养不良（素食者、肉类食品缺乏）•吸收利用障碍–胃酸缺乏（萎缩性胃炎和胃切除后）–内因子缺乏（全胃切除、存在内因子抗体的恶性贫血、胃粘膜损伤和萎缩）–慢性胰腺疾病–寄生虫竞争（如绦虫病）–小肠细菌过度生长–回肠疾患（炎症、手术切除、肿瘤、结核、热带口炎性腹泻、麦胶肠病及乳糜泻）发病机制叶酸缺乏，DNA合成障碍，细胞核发育障碍，细胞分裂减慢，与胞浆的发育不同步，细胞体积增大，呈现形态与功能均不正常的巨型改变，可涉及红、粒、巨核细胞三系，表现为成熟障碍，细胞无效应生成。

维生素B12缺乏，使甲基四氢叶酸不能形成四氢叶酸，间接影响DNA的合成。

实验室检查1、血象•大细胞性贫血：MCV MCH 均增高•网织红细胞计数可正常•重者全血细胞减少•血片：可见红细胞大小不一，中央淡染区小，有大椭圆形红细胞、点彩红细胞•中性粒细胞核分叶过多巨幼细胞贫血血象2、骨髓象•增生活跃或者明显活跃•红系增生显著•巨幼变（胞体大，胞浆成熟，核幼浆老）•粒系亦有巨幼变•成熟粒细胞多分叶•巨核细胞体积增大，分叶过多•骨髓铁染色增多巨幼细胞贫血骨髓象巨幼细胞贫血骨髓象3、叶酸和维生素B12的检验•血清和红细胞叶酸测定•血清维生素B12测定•血清维生素B12吸收试验•血清内因子阻断抗体测定血清和红细胞叶酸测定【原理】常用化学发光法，样本中叶酸(Folate)与叶酸-ALP结合物争夺一定数量叶酸结合蛋白上的结合位点。

产生的复合物再通过小鼠抗叶酸结合蛋白与固相结合。

反应完成后，结合在固相上物质置于一个磁场内被吸住，而未结合的物质被冲洗除去。

将化学发光底物AMPPD添加到反应管内，已与固相结合的ALP会使该底物发出光子并被光电比色计所检测，反应产生的光子与样品FOL的含量成反比。

【参考值】血清叶酸成年男性 8.61 ~ 23.8 nmol/L女性 7.93 ~ 20.4 nmol/L红细胞叶酸成人 340 ~ 1020 nmol/L红细胞临床意义(1)血清叶酸缺乏常见于巨幼细胞性贫血，血细胞的发育和成熟在叶酸缺乏时会受影响，引起细胞巨幼性改变，导致巨幼细胞性贫血发生。

(2)在细胞增殖性疾患，如急性白血病、慢性溶血及肿瘤时，叶酸的需要量增加，也会表现血清叶酸相对缺乏。

•红细胞与血清的叶酸浓度相差几十倍，体内组织叶酸缺乏但未发生巨幼细胞贫血时，对判断叶酸缺乏更有价值。

红细胞叶酸减低有助于诊断由于叶酸缺乏引起的巨幼细胞贫血。

•由于红细胞叶酸不受叶酸摄入情况的影响，红细胞叶酸测定能反映机体总体及组织叶酸水平，更能代表体内叶酸的实际情况。

血清维生素B测定12【原理】采用化学发光法，样本中的VB与内因子-ALP结12合物进行结合，以阻止结合物与固相抗内因子的结合。

反应完成后，结合在固相上物质置于一个磁场内被吸住，而未结合的物质被冲洗除去。

将化学发光底物AMPPD添加到反应管内，已结合的ALP会使该底物发出光子并被光电比色计所检测，反应产生的光子与样的含量成反比。

品中VB12【参考值】成人 148 - 660 pmol/L／L临床意义•维生素B12间接影响血细胞的发育和成熟，导致细胞巨幼性改变，故血清维生素B12缺乏见于巨幼细胞性贫血；而白血病患者、RBC增多症患者、某些恶性肿瘤患者VB12含量增高。

•维生素B12缺乏还影响神经鞘磷脂的形成，导致神经系统病变。

血清维生素B吸收试验12•【原理】空腹口服57钴标记的维生素B12 0.5μg，2小时后肌注未标记的维生素B12 1mg，收集24小时尿测定57钴排出量。

•【参考值】正常人应超过7％临床意义•正常人应超过7％，巨幼细胞性贫血低于7％,表示维生素B 12吸收不良，恶性贫血常在5％以下。

•如吸收不良，间隔5天重复上述试验，且同时口服60mg 内因子，如排泄转为正常，则证实为内因子缺乏，否则为肠道吸收不良。

如给病人服用抗生素后吸收有改善，提示肠道细菌过度繁殖与宿主竞争维生素B 12所致。

血清内因子阻断抗体测定【原理】一般采用放射免疫法。

用57Co标记的维生素B12与血清中的内因子结合，形成57Co标记的维生素B12－内因子复合物；当存在内因子抗体时,形成的复合物的量减少。

检测其放射活性，与阳性对照管进行比较，可得知内因子抗体的存在。

【参考值】正常成人为阴性，比值≤1.00±0.10阳性：比值≥阳性对照血清比值±0.10【临床意义】内因子阻断抗体阳性：多见于由维生素B12缺乏引起的巨幼细胞贫血、恶性贫血等第四节、溶血性贫血的实验室检查（hemolytic anemia）由于某一些原因使红细胞破坏增加或寿命缩短，超过了骨髓代偿能力所引起的一类贫血。

以红细胞的破坏和活跃的红细胞生成并存为特征。

一、溶血性贫血的分类1．根据红细胞破坏的部位分类：①血管内溶血：RBC在血循环中破坏②血管外溶血:RBC在单核巨噬细胞系统内破坏。

2．根据病因分类：①免疫性。

②非免疫（机械、脾亢）3.根据发病急缓①急性②慢性◎红细胞内在异常遗传性1.膜缺陷遗传性球形、椭圆形红细胞增多症2.酶缺陷葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、PK缺陷症3.珠蛋白生成异常镰状细胞贫血、不稳定Hb病获得性 PNH◎红细胞外在异常1.免疫性 AIHA、新生儿溶血症、药物2.机械性 DIC、行军性血红蛋白尿3.化学与物理因素苯中毒、大面积烧伤4.感染与生物因素疟疾、蛇毒5.单核吞噬系统亢进脾功能亢进•确定有无贫血•肯定溶血的依据•确定主要溶血部位•寻找溶血原因需要做哪些实验室检查？确定有无溶血性贫血具体诊断步骤为：病史贫血、黄疸Ret计数增加溶血可能寻找溶血证据血清胆红素、尿胆原、尿胆红素、HP、Hb尿、Rous试验、骨髓涂片确定溶血病因血管外溶血血管内溶血免疫性非免疫性遗传性自身免疫性溶贫新生儿溶血血型不合输血药物免疫性溶血PNH微血管病性溶血物理、化学、生物脾功能亢进红细胞膜缺陷红细胞酶缺陷血红蛋白缺陷不稳定血红蛋白病红细胞破坏的过程:RBC 血管内 溶血Hb↓ LDH↑游离Hb↑骨髓红系代偿增生 Ret ↑ 2αβ二聚体Hb 尿与结合珠蛋白（HP ）结合HP↓ 高铁血红素白蛋白高铁血红素白蛋白+ 血红素结合蛋白高铁血红素血结蛋白血红素结合蛋白↓ 红细胞寿命缩短胆红素 血红素 Hb单核-巨噬细胞系统异常红细胞珠蛋白Fe +2血管外溶血 Ret↑异形红细胞骨髓红系代偿增生Hb↓血 液 总胆红素↑ 间接胆红素↑肾肝 粪胆原↑尿胆原↑ 血液血管内溶血和血管外溶血的实验室鉴别检查项目血管内溶血血管外溶血红细胞形态异常正常或轻微异常明显异常血浆游离Hb 明显增加正常或轻度增加高铁血红素白蛋白增加正常尿Rous试验阳性阴性Hb尿（尿隐血试验）常阳性阴性溶血性贫血的实验室检查–溶血的检验–红细胞膜缺陷的检验–红细胞酶缺陷的检验–血红蛋白异常的检验–PNH的检验–AIHA的检验（一）寻找溶血的证据●红细胞寿命测定●血浆游离血红蛋白检测●血清结合珠蛋白检测●血浆高铁血红蛋白检测●尿含铁血红素试验●尿卟啉检测【原理】 常用51Cr 标记RBC 来测定RBC 寿命，其原理为：用 51Cr 标记RBC ，6价阳离子的51Cr 能穿透红细胞膜，与RBC 内Hb 的珠蛋白结合，基本上可不改变其在体内原有特性。

因此，可观察同位素标记的RBC 在血液循环中的消失情况，就可得知RBC 的寿命，51Cr 浓度降低越快，说明RBC 破坏消失越快，其寿命越短。

1、红细胞寿命测定(Erythrocyte life span determination)【参考值】半衰期为25 ~ 32天【临床评价】•溶血性贫血红细胞寿命缩短，约为14天。

•再生障碍性贫血红细胞寿命缩短，约为15 ~ 29 天。

正常人RBC寿命为100～130天，平均125天左右，应用51铬标记红细胞在循环血液中减少50%，即T1/2半衰期作为临床指标，此法较简便，正常人为25～32天，20天以下为缩短，17天以下为明显缩短。

溶血性贫血患者RBC寿命明显缩短，如镰状红细胞性贫血缩短至5～15天，阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）缩短至10天左右。

真性红细胞增多症RBC寿命延长。

【原理】血管内溶血时，血红蛋白从红细胞内释放，血浆游离血红蛋白浓度增高。

此化验可反映血管内溶血的情况。

检测：过氧化物酶法H 2O 2 O 2 使联苯氧化为蓝紫色【参考值】 0 ~ 40 mg/L2、血浆游离血红蛋白检测 (Plasma free hemoglobin)临床评价1、正常情况下，血浆中血红蛋白大部分与结合珠蛋结合，仅有微量游离血红蛋白。

测定血浆游离血红蛋白可判断红细胞破坏程度。

2、血浆游离血红蛋白增高可表明存在血管内溶血，如PNH、阵发性寒冷性血红蛋白尿、冷凝集素综合征、行军性血红蛋白尿、微血管病性溶血性贫血、溶血性输血反应、体外循环等。

3、自身免疫性溶血性贫血、珠蛋白生成障碍性贫血可轻度到中度增高。

4、血管外溶血不增高。

3、血清结合珠蛋白检测（haptoglobin, Hp)【原理】在待测血清中加入一定量的血红蛋白液, 使之与待测血清中的结合珠蛋白(Hp)形成Hp-Hb复合物.电泳将Hp-Hb复合物与未结合的Hb分开,测定Hp-Hb复合物的量,可得血清中结合珠蛋白的量【正常参考值】正常值（0.5 ～ 1.5 g Hb / L）新生儿较低，男性略高于女性。