荧光显微镜的基本使用方法
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精品课件
思考题
1．根据你的观察，荧光显微镜和光学显微镜 除了使用同一个机架以外，还共用哪些部 件？
2．一台高质量的荧光显微镜在要求荧光信号 充分明亮的同时，还需要没有信号的视野 充分黑暗。请问视野的黑暗是怎样实现的 ？
3. 你在实验中观察叶绿体用的绿色激发光还
是蓝色激发光效果比较好？说明其中的原
因。
精品课件
根（显示 叶绿体）
叶片
线粒体GFP转基因拟南芥
精品课件
注意事项
激发光挡片的使用----减少淬灭
精品课件
注意事项
• 荧光的淬灭与激发光的照射时间成正比，因此应尽 量减少观察时间外激发光对样品的照射。激发光挡 片可以部分或完全阻断激发光光路。在正式观察样 品之前，激发光光路应该处于完全阻断状态。否则 ，在我们将样品放到载物台上，移动样品台将样品 调整到物镜位置，找到要观察的细胞并进行调焦的 过程中，样品上的荧光可能已经发生了相当程度的 淬灭。为了避免观察前不必要的淬灭，上述一系列 操作需要在透射光源下进行。
精品课件
1、 该镜可作为明视场显微镜使用，也可作为荧光 显微镜使用，根据需要，做相应的附件连接，开启 相应的电源。禁止乱调设置，以免影响他人正常使 用。
2、 作为明视场显微镜使用；A、接通电源后，打开 显微镜底座前的电源开关，按光亮需要调节底座右 侧的滑竿。B、根据需要，调节底座光栅和聚光器光 栅及其高度，可获得最佳的图象效果。C、需要图片 ，要把镜体上的相应拉杆拉到绿线位子。按下相应 附件上的照相按扭。
2. The mercury burner has a service life period of 200 hours (USH102D) or 300 hours (HBD103W/2). When the hour counter on the power supply unit indicates this value, set the main switch to “O ” (OFF) and wait for more than 10 minutes before replacing the mercury burner. Unlike electric bulbs, the mercury burner seals highpressure gas inside. If it continues to be used after the service life has expired, the glass tube may eventually explode due to accumulated distortion.
发射波长 456 450 465 520 590 550 565 572 615
精品课件
荧光显微镜的优点和用途
优点： 检出能力高 对细胞的刺激小 能进行多重染色 用途： 物体构造的观察 荧光的有无、色调比较进行物质判别 发荧光量的测定对物质定性、定量分析
精品课件
实验原理
激发滤色镜 光源
精品课件
激发光源
• 高压汞灯拥有313, 337, 365, 405, 436, 546, and 577 纳米的峰值谱。高压 Xenon灯有连续的可见光光 谱范围, 光源强度比较平均。
汞灯光谱
精品课件
激发滤色块
• 具有多套激发滤色块：激发滤色镜（Excitation Filter），分 光镜（Dichromatic Mirror），发射滤色镜（Emission Filter ）。
激发滤色块
精品课件 六孔激发块转盘
多用途型BX-RFA(适合多种科研要求)及通用型BX-URA2。可同时使用6种荧光激发 块， “轻拨式”激发块转换功能，使不同荧光激发之间的迅速转换非常方便， 并可消除震动，有利于复染样品的荧光观察。激发块标识在暗室环境中发光，在 暗室中也能很容易地选择需要的荧光激发块。另外，根据需要还可以选择6孔滤 色片滑块(U-RSL6/U-RSL6EM)安放激发滤色片和发射滤色片进行荧光观察。
• 组织内含有的奎宁、四环素等药物也呈现一定的 荧光。
• 嗜中性粒细胞中脱氢酶辅酶呈现一定的荧光。
精品课件
荧光素 DAPI AMCA Hoechst 33258 FITC Acridine Orange Acridine Yellow CY3 TRITC Propidium Iodide
激发波长 372 350 365 490 490 470 552 541 530
细胞生物学实验
荧光显微镜的基本使用方法
精品课件
实验目的
1. 了解荧光显微镜的基本原理； 2. 掌握荧光显微镜的基本结构和 使用注意事项；
精品课件
自发性荧光物质
• 神经细胞和心肌细胞等内的脂褐素呈棕黄色荧光 。
• 肝贮脂细胞和视网膜色素上皮细胞内的维生素A呈 绿色荧光。
• 某些神经内分泌细胞和神经纤维内的单胺类物质 （儿茶酚胺、5－羟色胺、组胺等）在甲醛作用下 呈不同颜色的荧光。
• 当眼睛离开物镜进行记录或将显微镜交给合作实验 者观察时，要随手阻断激发光光路。实践结果表明 ，熟练、规范和合理的观察操作可以将样品淬灭对 观察和记录造成的影响降低到最小限度。
• 荧光信号的淬灭还与激发光的强度成正比。因此， 在可以观察到荧光信号的情况下，应该尽量降低激 发光的强度。这样做还精品有课件利于降低背景。
精品课件
精品课件
BX51 在镜基上装有3个滤色 片（ND6，ND25，LBD），另 外，还可以选装第四个。镜 基侧面的拉杆可以很容易地 插入/取出滤色镜。
精品课件
Specimen color fading can be delayed by reducing the excitation light intensity with ND filters. Use the ND filters as far as they do not hinder observations. Insert the ND filters (U25ND6 and/or U-25ND25) with the marked side facing toward the observer.
发射滤色镜 （阻挡滤片）
分色镜
精品课件
实验原理
荧光显微镜的光路及主要部件
光源 激发光挡片 激发滤色镜 分色镜 发射Fra Baidu bibliotek色镜
精品课件
精品课件
精品课件
Microscopes with an upright-style frame are capable of producing fluorescence illumination either through episcopic or diascopic optical pathways, although the latter is rarely used today. Epiilluminators usually consist of a mercury or xenon lamphouse coupled to a vertical illuminator that is positioned above the main frame in a separate assembly. The microscope nosepiece and transmitted light components (diascopic illuminator, condenser, field diaphragm, filters, etc.) are built into the main frame, while fluorescence components are housed in the vertical illuminator. These illuminators often contain a revolving or sliding turret that houses four to six "cubes" that contain a mixture of interference filters including a barrier filter, dichroic mirror, and an excitation filter. As illustrated above, light emitted from the lamp positioned in the episcopic lamphouse passes through a collector lens and then the field and aperture diaphragms before entering the first interference filter in the cube set, the emission filter. This light is then directed through the objective and onto the specimen by a special dichroic mirror that reflects certain wavelengths while passing others. Secondary fluorescence, emitted by fluorophores residing in the specimen, travels back through the objective and the dichroic mirror before passing through a barrier
NOTES
1. The inside of the ultrahigh-pressure mercury burner is very hot and hazardous during lighting and for about 10 minutes after turning off. Do not open the lamp housing in this period.
3、 作为荧光显微镜使用；A、先关闭荧光通道，再 打开荧光激发器电源，等待15分钟。B、等待期间， 打开显微镜光源，找到需要观察的样品，选用合适 的物镜，调整焦距。C、关闭显微镜光源，打开荧光 通道。D、需要图片，要把镜体上的相应拉杆拉到绿 线位子。按下相应附件上精品的课件照相按扭。
细胞核与细胞质DNA的直接荧光染色
思考题
1．根据你的观察，荧光显微镜和光学显微镜 除了使用同一个机架以外，还共用哪些部 件？
2．一台高质量的荧光显微镜在要求荧光信号 充分明亮的同时，还需要没有信号的视野 充分黑暗。请问视野的黑暗是怎样实现的 ？
3. 你在实验中观察叶绿体用的绿色激发光还
是蓝色激发光效果比较好？说明其中的原
因。
精品课件
根（显示 叶绿体）
叶片
线粒体GFP转基因拟南芥
精品课件
注意事项
激发光挡片的使用----减少淬灭
精品课件
注意事项
• 荧光的淬灭与激发光的照射时间成正比，因此应尽 量减少观察时间外激发光对样品的照射。激发光挡 片可以部分或完全阻断激发光光路。在正式观察样 品之前，激发光光路应该处于完全阻断状态。否则 ，在我们将样品放到载物台上，移动样品台将样品 调整到物镜位置，找到要观察的细胞并进行调焦的 过程中，样品上的荧光可能已经发生了相当程度的 淬灭。为了避免观察前不必要的淬灭，上述一系列 操作需要在透射光源下进行。
精品课件
1、 该镜可作为明视场显微镜使用，也可作为荧光 显微镜使用，根据需要，做相应的附件连接，开启 相应的电源。禁止乱调设置，以免影响他人正常使 用。
2、 作为明视场显微镜使用；A、接通电源后，打开 显微镜底座前的电源开关，按光亮需要调节底座右 侧的滑竿。B、根据需要，调节底座光栅和聚光器光 栅及其高度，可获得最佳的图象效果。C、需要图片 ，要把镜体上的相应拉杆拉到绿线位子。按下相应 附件上的照相按扭。
2. The mercury burner has a service life period of 200 hours (USH102D) or 300 hours (HBD103W/2). When the hour counter on the power supply unit indicates this value, set the main switch to “O ” (OFF) and wait for more than 10 minutes before replacing the mercury burner. Unlike electric bulbs, the mercury burner seals highpressure gas inside. If it continues to be used after the service life has expired, the glass tube may eventually explode due to accumulated distortion.
发射波长 456 450 465 520 590 550 565 572 615
精品课件
荧光显微镜的优点和用途
优点： 检出能力高 对细胞的刺激小 能进行多重染色 用途： 物体构造的观察 荧光的有无、色调比较进行物质判别 发荧光量的测定对物质定性、定量分析
精品课件
实验原理
激发滤色镜 光源
精品课件
激发光源
• 高压汞灯拥有313, 337, 365, 405, 436, 546, and 577 纳米的峰值谱。高压 Xenon灯有连续的可见光光 谱范围, 光源强度比较平均。
汞灯光谱
精品课件
激发滤色块
• 具有多套激发滤色块：激发滤色镜（Excitation Filter），分 光镜（Dichromatic Mirror），发射滤色镜（Emission Filter ）。
激发滤色块
精品课件 六孔激发块转盘
多用途型BX-RFA(适合多种科研要求)及通用型BX-URA2。可同时使用6种荧光激发 块， “轻拨式”激发块转换功能，使不同荧光激发之间的迅速转换非常方便， 并可消除震动，有利于复染样品的荧光观察。激发块标识在暗室环境中发光，在 暗室中也能很容易地选择需要的荧光激发块。另外，根据需要还可以选择6孔滤 色片滑块(U-RSL6/U-RSL6EM)安放激发滤色片和发射滤色片进行荧光观察。
• 组织内含有的奎宁、四环素等药物也呈现一定的 荧光。
• 嗜中性粒细胞中脱氢酶辅酶呈现一定的荧光。
精品课件
荧光素 DAPI AMCA Hoechst 33258 FITC Acridine Orange Acridine Yellow CY3 TRITC Propidium Iodide
激发波长 372 350 365 490 490 470 552 541 530
细胞生物学实验
荧光显微镜的基本使用方法
精品课件
实验目的
1. 了解荧光显微镜的基本原理； 2. 掌握荧光显微镜的基本结构和 使用注意事项；
精品课件
自发性荧光物质
• 神经细胞和心肌细胞等内的脂褐素呈棕黄色荧光 。
• 肝贮脂细胞和视网膜色素上皮细胞内的维生素A呈 绿色荧光。
• 某些神经内分泌细胞和神经纤维内的单胺类物质 （儿茶酚胺、5－羟色胺、组胺等）在甲醛作用下 呈不同颜色的荧光。
• 当眼睛离开物镜进行记录或将显微镜交给合作实验 者观察时，要随手阻断激发光光路。实践结果表明 ，熟练、规范和合理的观察操作可以将样品淬灭对 观察和记录造成的影响降低到最小限度。
• 荧光信号的淬灭还与激发光的强度成正比。因此， 在可以观察到荧光信号的情况下，应该尽量降低激 发光的强度。这样做还精品有课件利于降低背景。
精品课件
精品课件
BX51 在镜基上装有3个滤色 片（ND6，ND25，LBD），另 外，还可以选装第四个。镜 基侧面的拉杆可以很容易地 插入/取出滤色镜。
精品课件
Specimen color fading can be delayed by reducing the excitation light intensity with ND filters. Use the ND filters as far as they do not hinder observations. Insert the ND filters (U25ND6 and/or U-25ND25) with the marked side facing toward the observer.
发射滤色镜 （阻挡滤片）
分色镜
精品课件
实验原理
荧光显微镜的光路及主要部件
光源 激发光挡片 激发滤色镜 分色镜 发射Fra Baidu bibliotek色镜
精品课件
精品课件
精品课件
Microscopes with an upright-style frame are capable of producing fluorescence illumination either through episcopic or diascopic optical pathways, although the latter is rarely used today. Epiilluminators usually consist of a mercury or xenon lamphouse coupled to a vertical illuminator that is positioned above the main frame in a separate assembly. The microscope nosepiece and transmitted light components (diascopic illuminator, condenser, field diaphragm, filters, etc.) are built into the main frame, while fluorescence components are housed in the vertical illuminator. These illuminators often contain a revolving or sliding turret that houses four to six "cubes" that contain a mixture of interference filters including a barrier filter, dichroic mirror, and an excitation filter. As illustrated above, light emitted from the lamp positioned in the episcopic lamphouse passes through a collector lens and then the field and aperture diaphragms before entering the first interference filter in the cube set, the emission filter. This light is then directed through the objective and onto the specimen by a special dichroic mirror that reflects certain wavelengths while passing others. Secondary fluorescence, emitted by fluorophores residing in the specimen, travels back through the objective and the dichroic mirror before passing through a barrier
NOTES
1. The inside of the ultrahigh-pressure mercury burner is very hot and hazardous during lighting and for about 10 minutes after turning off. Do not open the lamp housing in this period.
3、 作为荧光显微镜使用；A、先关闭荧光通道，再 打开荧光激发器电源，等待15分钟。B、等待期间， 打开显微镜光源，找到需要观察的样品，选用合适 的物镜，调整焦距。C、关闭显微镜光源，打开荧光 通道。D、需要图片，要把镜体上的相应拉杆拉到绿 线位子。按下相应附件上精品的课件照相按扭。
细胞核与细胞质DNA的直接荧光染色