医学微生物学实验设计

医学微生物学实验设计

题目：志贺氏菌的检测

指导老师：庄东明

班级：xxxx级临床医学本科x班

姓名：XXX XXXXXXXXXX

XXX XXXXXXXXXX

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2012年12月

志贺氏菌的检测

XXX XXX XXX XXX XXX

（基础医学院临床医学XXXX级本科X班山东省泰安市 271000）

[研究背景]

志贺菌，革兰染色阴性，杆菌，无鞭毛，有菌毛；在肠道鉴别培养基上

形成无色,半透明的菌落；均能分解葡萄糖只产酸不产气,除宋内志贺菌迟缓

发酵乳糖外,均不分解乳糖；抗原构造与分类有O和K两种抗原.O抗原是分

类的依据,将志贺菌属分为四群(种)40余血清型(包括亚型)[1]。

细菌性痢疾(简称菌痢)是由志贺氏菌引起的一种急性肠道传染病，也是《中华人民共和国传染病防治法》规定的乙类传染病[2]。该病发病率高，其

急性中毒型菌痢容易误诊，危及生命。病人和带菌者是菌痢的主要传染源，

传播途径主要为粪-口传播,人群对菌痢普遍易感，病后免疫力持续时间较短，不同型别菌株之间无交叉免疫，短时间内也可能再次发生感染。

人体在感染后都可能出现恶心、呕吐、腹痛等症状,对于症状不典型者,

极容易被误诊为沙门菌、致泻性大肠埃希氏菌或霍乱弧菌感染,影响治疗而

导致慢性感染或带菌者,这一方面延误了患者的早期治疗,另一方面扩大了

病原体的传播。因此,迫切需要对病因进行准确而快速的诊断。目前,包括我

国在内的许多国家对这类致病菌的检验,大多仍沿用传统的细菌培养及鉴定

方法,步骤繁琐,检验周期长,远不能满足应对突发公共卫生事件上,及时诊

断、结果准确、敏感性和特异性高的要求。因此，建立快速、有效地检测和

鉴定志贺氏菌的方法显得尤为重要。

[实验目的]

1.志贺菌的分离培养、鉴定及药敏实验。

2.通过本设计性实验，进一步了解和掌握科学研究的基本思路和基本过程；并

通过实施，提高对科研的认识和兴趣，熟练掌握微生物学实验常用技术和仪器设备的使用。

[实验原理]

常规生化检测须经过增殖培养、分离纯化、生化试验、血清学实验等，

检应对市场需求的快速准确检验方法的要求。但这种方法具有直观、准确、

稳定性好且假阳性率低等特点，因此一直被沿用至今。国家标准方法[3]中采

用常规生化鉴定方法对志贺氏菌进行检测，整个过程需要4～5d。志贺菌属

都能分解葡萄糖，产酸不产气。大多不发酵乳糖，仅宋内氏菌迟缓发酵乳糖。

靛基质产生不定，甲基红阳性，VP试验阴性，不分解尿素，不产生H

S。

2

[实验材料与方法]

实验材料

粪便标本，琼脂平板，铁琼脂培养基，蛋白胨水培养基，尿素培养基，各种

糖发酵管，α-萘酚溶液，甲基红指示剂，吲哚试剂，各种抗生素纸片，接

种环，酒精灯，等。

实验方法

（一）、标本采集、保存、接收

采集留取粪便时应采集新鲜粪便的脓血部分、粘液部分、水样便或稀便。所采取的粪便标本应尽快送检。

送交分型分析菌株的接收要求：

(1)经过分纯的没有污染的菌株;

(2)分离菌株应该用甘油半固体保存

(3)与分离菌株相对应的患者的临床症状和流行病学资料。

（二）、粪便标本志贺菌的分离培养

（1）用接种环多点沾取标本病变部分，直接划线分离于琼脂平板。37℃培养24 h。

（2）挑选可疑菌落

从37℃培养 16～24 h 的分离培养基上，观察挑选可疑菌落，其形态为无色，半透明，圆形，湿润、光滑、突起，大小为1～2mm；

（3）增菌

挑选可疑菌落，接种 TSI和葡萄糖半固体，先划线后穿刺，做好标记，放37℃培养 16 h 以上，观察结果。

（三）、生化反应及鉴定

（1）志贺菌属在 TSI 上的生化反应：挑取平板上的可疑菌落，接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体各1管。一般应多挑几个菌落，以防遗漏，经36℃培养18~24h，

分别观察结果

（2）志贺菌菌落经革兰染色后镜检。

（3）糖发酵试验：取菌接种到糖发酵管37℃培养18~24h，观察结果。

（4）尿素酶试验：取菌种接种于尿素培养基中，37℃培养24h后，观察结果。（5）VP试验：取菌种接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，37℃培养24h后，观察结果。

（6）甲基红试验：取菌种接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，37℃培养24h后，观察结果。

（四）、药敏实验

(1) 取琼脂平板培养基，于其底部玻璃上标注所接种的菌株的名称（庆大霉素、头孢噻吩、四环素、利福平）。

(2) 以接种环接种菌株，在培养基表面作密集划线接种。

(3) 将镊子火焰灭菌，待冷后再取各药物纸片，分别牢贴于所有细菌的培养基表面相应位置，每次贴片后镊子均应经火焰灼烧灭菌。每张纸片间距不得少于24mm，纸片中心距平皿边缘不少于15mm，并分别做好标记。

(4) 37摄氏度孵育18至24小时后，分别测量各纸片抑菌环直径（包括纸片在内，mm），抑菌环的边缘以肉眼看不到明显生长为限。判断其敏感度。

[预期结果][4]

1．志贺菌属在 TSI 上的生化反应为：斜面红色，底层产酸黄色，不产气。

在葡萄糖半固体管内产酸为黄色，不产气，无动力。

2．挑选的可疑菌落经革兰染色后镜检为革兰阴性菌。

3. 糖发酵试验，菌落不产酸产气，阴性。

4. 脲酶试验不产生氨气，阴性。

5. VP试验不产生红色化合物，阴性。

6. 甲基红试验中甲基红指示剂呈红色，阳性。

7. 药敏实验中抑菌环直径：庆大霉素≥15mm ，头孢噻吩在10-15mm之间，

四环素利福平＜10mm 。

[结果讨论与分析]

结果分析

若与预期结果相似，则可初步判定该菌是志贺氏菌。