GSTpulldown的原理以及具体操作流程

实验目的：体外检测蛋白质与蛋白质之间相互作用。

用于验证两个已知蛋白的相互作用，或者筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白。

实验原理：利用重组技术将探针蛋白与GST (Glutathione S transferase)融合，融合蛋白通
过GST与固相化在载体上的GTH( Glutathione )亲和结合。

因此，当与融合蛋白有相互作
用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离
试齐U： NaCl，KCl，Na2HPO4，KH2PO4，Trit on-100 , IPTG(Merck 分装)，
PMSF( Amersco)，
Cocktaier ( Merck 539134 ), Immobilized Glutathione ( PIERCE 15160 )
实验操作程序：
材料及试剂
探针蛋白与GST融合的原核蛋白，裂解的细胞蛋白，或者组织蛋白提取物
细胞蛋白裂解液，洗脱液：
PBS 及PBS+1%Triton-100
PBS (1L)
NaCl : 8g
KCl : 0.2g
Na2HPO4: 1.44g
KH2PO4 : 0.24g
加入800ml蒸馏水，用HCI调节溶液的pH值至7.4,最后加蒸馏水定容至1L即可，高温高压灭菌！ 4 C保存备用！
PMSF(苯甲基磺酰氟)MW:174.19工作浓度0.1-1mM，这里使用1mM，储存浓度100mM , 将
0.174g PMSF溶于10ml无水乙醇混匀即可！保持于-20 C或者4C
(以下流程仅供研究已知原核蛋白A和真核过表达蛋白B相互作用)
1:原核融合蛋白A的获得
1.1 :将编码蛋白A与GST的重组质粒化转BL21(DE3)菌株
1.2：挑取单个克隆到含有5mlLB(+100ug/mlAmp)的10ml试管里，37C培养过夜
1.3:将培养菌液转移到含有500ml LB(+100ug/mlAmp)的1L锥形瓶中，37C, 225rpm培养
至OD60B 1.0-1.5左右，加入适当浓度的IPTG，在适当温度下培养适当时间(诱导条件需要根据不同的蛋白做调整).6000g, 10分钟，4C离心收集细菌，去尽上清，将菌体至于-20 C 放置O/N
1.4 :室温冻融菌体，马上置于冰上，每500ml培养液加入10-20ml细菌裂解液 (PBS+1%Triton-100+PMSF ),吹打混匀
1.5:冰上超声破碎，开2秒，停9秒，总40-60分钟。

至裂解液充分清凉
1.6: 11000rpm , 15分钟，4C离心分离上清，-80C保存备用
2:真核融合蛋白B的获得
2.1:将编码B蛋白的碱基序列克隆到编码标签蛋白(如HA,或者myc)的真核表达载体上，进行细胞转染xq
3: 48小时后，取适量融合蛋白GST-A冰上冻融
4：取50-70ulGST-Beads (Immobilized Glutathione )至9 EP 管中，用800ul PBS+1%Triton-100 润洗一次，将冻融融合蛋白GST-A与之混匀，4C层析柜旋转结合1小时。

5: PBS+1%Triton-100 洗3 次，PBS 洗3 次。

留取20ul ( PBS+Beads)作Offer。

6:同时，裂解真核融合蛋白B,去尽培养基，用PBS(RT)洗一次，加入300ul裂解液(以
6well 为例，PBS+1%Triton-100+ Cocktaier ), 4C放置30 分钟。

7：吹打收集至1.5mlEP管，超声破碎。

13000rpm , 15分钟，4 C离心取上清。

& BCA蛋白定量（optional）留取20ul做Offer，其余样品加入到已纯化蛋白的EP管中，用PBS补足液体到600ul左右，以便蛋白之间能充分结合！4C旋转结合O/N9 : PBS+1%Triton-100 洗3 次，PBS 洗3 次。

10: 40ul 5X oading buffer溶解beads上的蛋白，煮沸3分钟，高速离心，Run -SDS PAGE 做Western Blot 检测。

用HA 或者myc Blot。

注意GST-pull down的对照问题。

（以A-GST和B-6*His为例）
1. 跑SDS-PAGE时点一个in put的蛋白（即B-6*His ）用于做阳性对照看一下western操作过程中，试剂，操作步骤有没有问题。

2. 谷胱甘肽琼脂珠上只固定GST蛋白，in put B-6*His，用于做阴性对照看一下是否GST 会与in put的蛋白相互作用。