融合蛋白柔性linker的选择

融合蛋白柔性linｋer的选择

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蛋白融合Linkeｒ的设计与选择

接头序列(Linkｅr)设计是基因融合技术能否成功的关键技术之一。即通过一段适当的核苷酸序列将不同的目的基因连接起来, 使其在适当的生物体内表达成为

一条单一的肽链, 其中起连接作用的氨基酸称为Lｉｎｋeｒ[1］。融合蛋白中的两种成分能否分别形成正确的空间结构、更好的发挥生物学活性, 与连接融合蛋白中两种成分的接头序列密切相关。重组生成的融合蛋白要求插入融合蛋白中的ｌinｋeｒ不能影响目的蛋白各自的功能。因此，Liｎkｅr序列的设计和选择对融合基因的构建至关重要。

针对Lｉnker序列的设计和选择己有诸多相关的研究[2]。目前的研究主要有两种,即螺旋形式的Lｉnker肽如［Ａ(EAAＡK)nA]和低疏水性、低电荷效应的氨基酸组成的接头, 以后者应用较广泛。这种低疏水性、低电荷效应的氨基酸组成的多肽接头能够充分伸展以分开两种融合的组分, 使之能在互不干扰的

情况下充分折叠成各自的天然构象。Ryｏiｃhi等[3］在两种不同功能的融合蛋白之间插入了不同类型的linkｅｒ序列,包括可形成螺旋状的不同长度的肽链、柔性liｎkｅr以及葡萄糖球菌蛋白A(PA)。结果发现螺旋状的ｌinker同柔性lin ｋeｒ及ＰA一样，可以有效的将融合蛋白的两个结构域分开, 甚至可增强融合蛋白的功能。Linkeｒ的长度是融合基因构建的又一个重要的因素。如果Linke ｒ的长度过长，则使融合蛋白对蛋白酶比较敏感, 导致活性融合蛋白在生产过程中的产量下降;应用较短的Ｌiｎker, 可以克服重组蛋白酶分解的问题, 但可使两个融合分子相距太近导致蛋白功能的丧失。Lｉnker的长度不应小于３.5 ｎm , 这是由于相邻肽键的距离为0.３8nｍ, 因此连接肽至少应包含10个氨基酸。目前最为常用的是Hｕstｏn设计合成的（GGGGS)3序列。研究发现, 连接肽为（Gly4Ser）３的融合蛋白表现出较高的复性效率。这可能是(Gly4Ser)3连接肽较长且柔软, 在复性时能够降低融合蛋白的两组份间的空间位阻, 从而更有利于融合蛋白各个结构域的正确折叠。所以, Linkｅr 的长度不能过长也不能过短。

Linkｅr的选择, 还应考虑Linkｅr内部的氨基酸序列, 研究发现,Linkｅｒ组成相同但序列不同时,构建的融合蛋白的稳定性存在显著差异; 编码Ｌinkeｒ

的核苷酸组成, 调整编码Lｉｎｋｅr的核苷酸组成, 虽不改变原接头Ｌinker 的氨基酸序列, 但融合蛋白的表达存在显著差异。Ｌiｎｋｅr序列中有太多的α螺旋和β角结构会限制融合蛋白的伸缩性, 进而影响融合蛋白的生物学活性。总之, Lｉnker的选择不是一成不变的, 而要根据融合蛋白分子的大小和特性来决定。

细胞因子是由免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激而合成、分泌的一大类多功能、高活性的生物物质。它在介导机体多种免疫反应及对各类免疫活性细胞的分化、发育和活化中起着十分重要的作用。细胞因子融合蛋白（cyｔokine fusｉｏｎprotein)技术是当今免疫学研究的一个热点方向。该方法是基于这些细胞因子具有相同或相关的功能活性而各自作用靶点不同, 利用基因工程技术将两种或多种细胞因子融合在一起,其融合基因表达产物既具有

其组成因子独特的生物学活性或使其某些活性显著提高, 还可能会通过生物学活性的互补及协同效应发挥出较单一细胞因子简单配伍所不具备的复合生物学功能,甚至还可能会产生一些新的结构及生物学功能，这种新型的人工蛋白具有极高的应用价值和良好的发展前景。早在１986年Ｓeno等用含ＥｃoＲI的12个核苷酸（４肽)CCGGAＡTＴCＡTG为接头, 将IＦNγ和IＬ2片段加以连接, 结果发现产生的融合蛋白具有ＩFNγ与ＩＬ

２的双重活性。迄今为止, 国内外已相继报道了多种有价值的细胞因子融合蛋白。现就细胞因子融合蛋白技术的原则、构建类型、应用现状以及发展前景做一简要概述。

1 细胞因子蛋白融合技术

1.1蛋白融合的构建原则基因工程构建细胞因子融合蛋白须满足以下几个条件:(1)各融合分子的目的DＮA片段置于同一套调控序列(包括启动子、增强子、核糖体结合序列、终止子等)的控制之下。(2）融合分子间须以富含疏水性氨基酸的接头Linｋｅｒ连接,同时也要考虑接头序列的长度和核苷酸、氨基酸的组成、排列顺序等因素。如融合蛋白内部接头的不同, 可导致融合蛋白各部分化学结构的改变, 而影响到各融合分子的空间构象，导致其生物学活性差异。所以, 设计肽链之间的接头时，要尽可能不影响两端蛋白的自然折叠，使各融合成分互不干扰。（３)为了保证融合蛋白的生物学活性, 还需考虑构成融合蛋白各成份本身的特性及其相互作用机制。如肿瘤坏死因子(TNF）和α干扰素(ＩFNα)在抑制肿瘤细胞、增强抗病毒活性等方面有协同作用。有学者构建了TNF和IFN α的融合蛋白,但发现该融合蛋白的抗病毒和抗肿瘤活性与单独应用TＮF和ＩFNα相比, 抗病毒活性降低24倍, 抗肿瘤活性降低15倍，与构建融合蛋白的初衷相背。分析原因，可能是这两种细胞因子的理化性质差异较大, IＦNα活性稳定, 而TNＦ活性极易丧失, 其融合蛋白在一定程度上影响了彼此的活性。

1．2 蛋白融合Liｎｋeｒ的设计与选择接头序列（Lｉnker）设计是基因融合技术能否成功的关键技术之一。即通过一段适当的核苷酸序列将不同的目的基因连接起来，使其在适当的生物体内表达成为一条单一的肽链,其中起连接作用的氨基酸称为Ｌiｎｋer[1]。融合蛋白中的两种成分能否分别形成正确的空间结构、更好的发挥生物学活性, 与连接融合蛋白中两种成分的接头序列密切相关。重组生成的融合蛋白要求插入融合蛋白中的linｋｅｒ不能影响目的蛋白各自的功能。因此, Liｎkｅr序列的设计和选择对融合基因的构建至关重要。

针对Lｉnkeｒ序列的设计和选择己有诸多相关的研究[２]。目前的研究主要有两种, 即螺旋形式的Ｌｉnker肽如［A(EAAＡＫ)nＡ]和低疏水性、低电荷效应的氨基酸组成的接头, 以后者应用较广泛。这种低疏水性、低电荷效应的氨基酸组成的多肽接头能够充分伸展以分开两种融合的组分，使之能在互不干扰的情况下充分折叠成各自的天然构象。Ryoichi 等［３]在两种不同功能的融合蛋白之间插入了不同类型的linker序列,包括可形成螺旋状的不同长度的肽链、柔性ｌiｎkｅr以及葡萄糖球菌蛋白Ａ(PA)。结果发现螺旋状的linker 同柔性ｌｉnｋer及PＡ一样,可以有效的将融合蛋白的两个结构域分开, 甚至可增强融合蛋白的功能。Ｌiｎker的长度是融合基因构建的又一个重要的因素。如果Linkｅｒ的长度过长,则使融合蛋白对蛋白酶比较敏感, 导致活性融合蛋白在生产过程中的产量下降; 应用较短的Ｌinkｅｒ, 可以克服重组蛋白酶分解的问题, 但可使两个融合分子相距太近导致