饲料中植酸酶活性测定方法探讨
植酸酶测定
植酸酶活性测定植酸(Phyticacid).其化学名称为六磷酸肌醇，由1分子肌醇和6分于鳞酸结合而成，分子式是C6H18O24P6,通式为C6H6[OPO(OH)2]6,分子660.8。
植酸及植酸盐中的磷即为植酸磷，植酸广泛存在于谷物籽实和油料作物种子。
植酸酶(phytases)能将磷酸残基从植酸上水解下来，因此破坏了植酸对矿物元素强烈的亲和力，所以说植酸酶能增加矿物元素的营养效价，而且由于释放出的Ca2÷可参加交联或其他反应中去，从而改变了植物性食品的质地。
植酸酶一般只适于在单胃动物中使用。
反刍动物由于瘤胃微生物能合成植酸酶，因此在饲料中一般不需要使用植酸酶。
植物体中的植酸一般不以游离形式存在，而是与钙、镁、钠、钾等结合形成复合盐，植酸盐在多数植物中以植酸钙镁复盐的形式存在，但大麦中主要是植酸钾镁复盐，小麦中主要是植酸铁。
饲料中的无机磷可直接为肠道所吸收，而有机磷则需要先经酶的作用水解为无机磷，然后方能为肠道吸收。
单胃动物消化道中无分解植酸的植酸酶，故对植酸磷的利用率很低。
植酸的抗营养作用不仅表现在植酸磷的低利用率上，还通过整合或络合作用影响其它矿物元素如铁、锌、铜、钙以及蛋白质的可消化性，并抑制淀粉酶、胰蛋白酶、胄蛋白酶的活性。
测定原理植酸酶可以水解植酸钠释放出无机磷，通过加入锐铝酸核显色/终止液使水解反应停止，同时与水解释放出的无机磷产生颜色反应，形成黄色的帆铝磷络合物(NHQPO4NH4VO3-16M O O3;,在415nm波长下测定磷的含量，以标准磷溶液为参照，计算酶活。
植酸酶的含量以酶活性单位表示。
1植酸酶单位定义为:在37℃、pH5.5的条件下，1分钟内从0.005ImOI1的植酸钠溶液中释放出1微摩尔(UmoD无机磷所需要的植酸酶量。
操作步骤样品准备样品粉碎过后过60目筛。
称取2.0g左右粉碎样品，放入4个IOom1烧杯中(每种样品4个重复)。
加入50m1浓度为0.25m1、PH为5.50、在冰箱中冷却的乙酸缓冲液并用磁力搅拌器搅动60分钟，使酶蛋白充分溶出，制成一个悬浮液。
植酸酶酶活测定
四.实验步骤： 实验步骤：
1. 标准曲线的制作
(1)按下表的比例稀释成不同磷浓度溶液 (1)按下表的比例稀释成不同磷浓度溶液
标准符 标准 号 磷液 /ml 蒸馏 水/ml 相当于 无机磷 /ug 显色液 /ml OD660nm
1 2 3 4 5 6
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
3.0 2.8 2.6 2.4 2.2 2.0
0.9ml（TCA） 0.9ml（植酸 （ ） （ 钠） 3ml √ 3ml √
水浴显色20min 水浴显色
20分钟后， 20分钟后，四只 分钟后 试管中现象
用分光光度 计测OD值 计测 值
实验得到四只试管中的样液的OD值 值 实验得到四只试管中的样液的
A0(参照 = 0 A1= 0.547 参照) 参照 A2= 0.490 A3= 0.523
实验用品： 三.实验用品： 实验用品
• 试剂 乙酸缓冲液、植酸钠溶液、10%三 试剂：乙酸缓冲液、植酸钠溶液、 乙酸缓冲液 三 氯醋酸溶液、 钼酸铵溶液、 氯醋酸溶液、2.5%钼酸铵溶液、10%Vc 钼酸铵溶液 溶液、 硫酸溶液、 溶液、17%硫酸溶液、磷酸二氢钾、显色 硫酸溶液 磷酸二氢钾、 液配制： ） 液配制：（6）︰（水）︰（4）︰（5）=1︰2︰1︰1 ） ） ︰ ︰ ︰ • 仪器：恒温水浴锅、分光光度计、离心机、 仪器：恒温水浴锅、分光光度计、离心机、 烧杯、容量瓶、 烧杯、容量瓶、移液管
摇瓶
3000r/min离心 min 离心15
（2） 酶活测定 ）
反应顺序
1. 加酶液 2. 加植酸钠 加植酸钠/TCA溶液 溶液 3. 加乙酸缓冲液 4. 混合均匀 5. 37℃水解 ℃
样品
0.3ml 0.9ml（植酸钠） （植酸钠） 0.9ml √
植酸酶活性测定方法
Ｗ×３０
式中： Ｐ— ——由样品吸收度根据二次曲线方程求得的反应
总磷量， μｍｏｌ
Ｗ— ——样品重量， ｇ
Ｆ— — — 样 品 总 稀 释 倍 数
３０— ——反应时间， ｓ
６ 结果
·４４·
６．１ 方法的重复性 抽取了 ３ 个批次的样品， 每个样品进行 ３ 次不 同日期的测定， 结果见表 ２。
表 ２ 植酸酶产品中植酸酶含量的测定结果
·４３·
广东饲料 第 １５ 卷第 ５ 期 ２００６ 年 １０ 月
检测分析
５ 操作方法 ５．１ 磷标准溶液及样品溶液配制 ５．１．１ 磷标准溶液： 称取基准磷酸二氢钾适量 于 １０５℃干 燥 ２ｈ， 置 干 燥 器 中 冷 却 至 室 温 后 ， 精 确 称取 ０．３４１５ｇ 于具塞锥形瓶中， 加入约 １００ｍＬ 醋酸 缓冲液并称量， 准确至 ０．０００１ｇ， 得 ２５．００５５μｍｏｌ／ｇ 磷标准液。用移液器准确移取磷标准液 ０．１ｇ、０．２ｇ、 ０．３ｇ、０．５ｇ、０．８ｇ、１ｇ， 置于 １０ｍＬ 刻度试管中， 加醋酸缓 冲液至 ５ｇ（ 精确至 ０．０００１ｇ） ， 配制成系列浓度的磷 标 准 液 ： ０．５００１μｍｏｌ／ｇ、１．０００２μｍｏｌ／ｇ、１．５００３μｍｏｌ／ｇ、 ２．５００６μｍｏｌ／ｇ、４．００１０μｍｏｌ／ｇ、５．００１１μｍｏｌ／ｇ。备用。 ５．１．２ 样品溶液： 称取 １ｇ 植酸酶样品于具塞三 角 瓶 中 ， 加 醋 酸 缓 冲 液 至 １００ｇ 并 称 量 （ 准 确 至 ０．０００１ｇ） ， 搅拌 ３０ｍｉｎ 后取上清液于 ４ ０００ｒ／ｍｉｎ 离 心 １０ｍｉｎ（ 或用玻璃滤纸过滤） ， 称取上清液 ０．１ｇ， 加 醋酸缓冲液稀释至 １００ｇ， 使得到酶活为 ０．０５ＦＴＵ／ｇ 左右的样品溶液， 所有称量均需精确至 ０．０００１ｇ。 ５．２ 酶活反应及测定 称 取 磷 标 准 溶 液 、样 品 溶 液 、空 白 醋 酸 缓 冲 液 各 １ｇ（ 精 确 至 ０．０００１ｇ） 于 试 管 （ １８ｍｍ×１８０ｍｍ） 中 ， 按表 １ 进行反应。样品反应操作间隔时间为 ３０ｓ。
饲料中植酸酶活性检测方法的比较与研究
饲料中植酸酶活性检测方法的比较与研究植酸酶是催化植酸及其盐类水解为肌醇与磷酸（盐）的一类酶的总称，属磷酸单酯水解酶。
植酸酶具有特殊的空间结构，能够依次分离植酸分子中的磷，将植酸（盐）降解为肌醇和无机磷，同时释放出与植酸（盐）结合的其它营养物质。
由于植酸酶可将底物植酸钠水解，生成正磷酸和肌醇衍生物，并在酸性溶液中与钒钼酸铵生成黄色的复合物，因此，在波长 415 nm 下进行比色，可测定植酸酶活性。
目前已形成国标GB/T 18634—2009《饲用植酸酶活性的测定分光光度法》。
但是，饲料中植酸酶活性的测定却存在以下问题：①由于植酸酶在饲料中的添加量较低，现有方法不能将饲料中的植酸酶完全浸提出来；②饲料中存在大量物质可在酸性条件下与钒钼酸铵发生显色反应，干扰 415 nm 波长下的比色反应，从而影响酶活测定。
本实验旨在研究现有饲料中植酸酶测定方法的优势与缺陷，并寻找有效的检测途径。
1 材料与方法1.1 主要试剂与仪器1.1.1 仪器分析天平；恒温水浴锅；分光光度计；磁力搅拌器；涡流式混合器；酸度计；离心机：转速为4 000 r/min以上；超声波溶解器；回旋式振荡器；透析袋（截留分子量 1 万、10 万和 30~100 万）；超滤离心柱（YM-30，密理博公司生产）。
1.1.2 试剂植酸酶：市售商品，酶活 5 000 U/g，酶活定义参照GB-T 18634—2009。
饲料：市售商品蛋鸡料，原配方中不含植酸酶。
磷酸二氢钾（KH2PO4）基准物。
乙酸缓冲液（1），c (CH3COONa) =0.25 mol/l：称取20.52 g 无水乙酸钠于 1 000 ml 烧杯中，加入 900 ml水搅拌溶解，用冰乙酸调节pH 值至（5.50±0.01），再转移至 1 000 ml 容量瓶中，并用蒸馏水定容至刻度；室温下存放 2 个月内有效。
乙酸缓冲液（2），c(CHCOONa) =0.25 mol/l：称取20.52 g 无水乙酸钠，0.5 g 曲拉通 X-100 （Triton X- 100），0.5 g 牛血清白蛋白（BSA）于 1 000 ml 烧杯中，加入900 ml 水搅拌溶解，用冰乙酸调节 pH 值至（5.50±0.01），再转移至 1 000 ml 容量瓶中，并用蒸馏水定容至刻度；室温下存放 2 个月内有效。
植酸酶活性的测定——钼蓝法(精)
植酸酶活性的测定——钼蓝法1 原理针对预混料复杂的物料体系，用不同的缓冲液对其进行抽提，最大限度的减少饲料中无机磷，微量元素，多维及其他成分对植酸酶测定的影响，用钼蓝法对抽提液中植酸酶活性进行定量。
植酸酶在一定温度和pH条件下，水解底物植酸钠生成正磷酸和肌醇衍生物，在酸性环境中与钼酸铵显色剂反应生成蓝色的（Mo2O3•MoO3）复合物，在波长700nm下比色测定。
酶活力单位定义：在37℃、pH5.0条件下，每分钟从5.0mM植酸钠溶液中释放出1微摩尔的无机磷定义为1个酶活力单位（U）2 试剂本规定中所用试剂，在没有注明其它要求时，均指分析纯试剂；所用溶剂和水无注明时，均指蒸馏水。
清洗实验用容器不要用含磷清洗剂。
2.1 乙酸缓冲液A（0.25mol/L）：称取14.355g无水乙酸钠，加入0.5gTriton X-100和0.5g牛血清白蛋白，900ml水溶解，冰乙酸调pH值至5.00±0.01，水定容至1000ml。
2.2乙酸缓冲液B（0.25mol/L）：称取14.355g无水乙酸钠，加入1.0g吐温-20和30gEDTA，900ml水溶解，冰乙酸调pH值至5.00±0.01，水定容至1000ml。
2.3 植酸钠溶液（6.25mmol/L）：称取577.4mg肌醇六磷酸钠，加入574.2mg无水乙酸钠，90ml水溶解，冰乙酸调pH值至5.00±0.01，水定容至100ml，现用现配（实际反应液中的最终浓度为5.0mmol/L）。
2.4 终止液：5%三氯乙酸（5%TCA）。
2.5 1.5％钼酸铵（试剂A）：7.5g钼酸铵溶于400ml水中，慢慢加入22ml浓硫酸，水定容到500ml，冰箱储存，有效期1个月。
2.6 2.7％硫酸亚铁（试剂B）：冰箱储存，有效期1个月。
2.7 显色剂：移取4份试剂A（2.5），1份试剂B（2.6）混合后使用，现用现配。
2.8 磷酸二氢钾：称量前于烘箱中烘至恒重，用乙酸缓冲液（2.2）配制50mmol/L标准液，再用50mmol/L 配制成4.0mmol/L磷酸二氢钾，溶剂为乙酸缓冲液（2.2），冰箱储存。
饲用植酸酶活性的测定标准
饲用植酸酶活性的测定标准1 范围本标准规定了以分光光度法测定饲用植酸霉活性的方法。
本标准适用于作饲料添加剂用的植酸霉产品，也适用于添加有植酸霉的配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料。
样品最低检出量为90U／kg。
2 引用标准下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用尔构成为本标准的条文。
本标准出版时，所示版本均为有效。
所有标准都会被修订，使用本标准的各方面应探讨使用下列标准的最新版本的可能性。
GB／T 6682—19 分析实验室用水规格和试验方法(neq ISO 3696：1987)3 植酸酶活性单位定义样品在植酸钠浓度为5．0 mmol／L、温度37℃、PH值5.50的条件下，每分钟从植酸钠中释放1μmol无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U表示。
4 方法原理植酸酶在一定温度和pH条件下，水解低物植酸钠，生成正磷酸和肌醇衍生物，在酸性溶液中，用钒钼酸铵处理会生成黄色的[(NH4)3PO4NH4VO3·16MoO3]复合物，在波长415nm下进行比色测定。
5 试剂和溶液本标准中所用试剂，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和符合GB／T 6682中规定的三级水。
清洗试验用容器不要用含磷清洗剂。
，。
5．1 乙酸缓冲液(I)，c(CH3COONa·3H2O)为0.25mol／L：称取34．02g三水乙酸钠，0．1 g吐温20于1 000 mL容量瓶中，加入900 mL水溶解，用盐酸调节pH至5．50~0．01，并用蒸馏水定容至1 000mL。
，室温下存放2个月有效。
5．2 乙酸缓冲液(Ⅱ)，c(CH3COONa·3H20)为0．25mol／L：称取34．02g三水乙酸钠，5 g吐温20，30g乙二胺四乙酸二钠(EDTA)于1000mL，容量瓶中，加入900mL。
水溶解，用盐酸调节pH至5．50±0．01，并用蒸馏水定容至1 000mL，室温下存放2个月有效。
5．3 植酸钠溶液，c(C6H6O24P6Na12)为7．5mmol／L：称取0．692 9g肌醇六磷酸钠(C6H6024P6Na12)于100mL。
植酸酶酶活测定方法的研究
图,
钼蓝法标磷测定曲线
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以发酵液为酶液， 以灭活酶液作 对照菌种酶活测定方差分析
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表" 以发酵液为酶液以灭活酶液作对照菌种酶活测定结果
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表, 培养液无机磷含量与培养时间的关系
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表& 发酵液透析不同时间的结果
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_饲用植酸酶活性的测定_分光光度法_新旧国标变化及解读
2009年第20期从2009年10月1日起，GB/T 18634-2009《饲用植酸酶活性的测定———分光光度法》标准正式实施。
随着植酸酶的大规模应用，饲料企业如何选择和鉴别植酸酶产品的问题，已经成为使用者的当务之急。
在众多影响使用效果的因素中，产品本身的原因主要包括酶的种源、含量、温度稳定性、容重、pH 特性及体内水解效率等，其中酶活含量是最重要的质量指标。
GB/T 18634-2002《饲用植酸酶活性的测定———分光光度法》是在参考了AOAC 方法的基础上制定的，在国标颁布之初，由于市场上的植酸酶菌种相对单一，国标检测方法具有普遍的代表性，对植酸酶的生产、应用和检测起到了很好的指导作用。
随着植酸酶的逐渐普及，特别是在2004年以后，国内对植酸酶的研究开发进展迅速，有大量采用不同菌种发酵的植酸酶相继问世，GB/T18634-2002在检测新型植酸酶产品上显现出缺陷和不足，直接影响到检测结果的准确性。
这次标准的修订为植酸酶的制造、贸易、应用甚至纠纷仲裁、以及加酶饲料的质量控制和检测方法的统一都提供了充分的依据，也是植酸酶发挥效果的基本前提。
下面结合生产检测实际，谈谈新旧国标的主要区别：1缩小了方法的适用范围新标准（GB/T 18634-2009，以下同）适用范围删去原国标（GB/T 18634-2002，以下同）中规定的“添加有植酸酶的浓缩饲料和添加剂预混合饲料”。
修订为：“本标准适用于饲料添加剂用植酸酶产品、也适用于添加有植酸酶的配合饲料”。
预混合饲料、浓缩饲料中金属离子浓度高，成分复杂，对样品干扰大，随着样品保存时间的延长，酶的活性很不稳定，用现行的提取条件不能将酶活提取完全，检测结果不准确。
因此，新国标适用范围中去掉了“添加剂预混合饲料、浓缩饲料”，保留“添加剂用植酸酶产品、配合饲料”。
后两类产品按照新标准的方法检测均能达到较好结果。
2调整了最低检出限量和添加植酸酶的配合饲料样品两次试验的允许差方法最低定量限由原标准的“90U/g ”调整为“130U/g ”。
植酸酶活力的测定方法及应注意问题
２ ． 酸 亚 铁 一钼 蓝 法 ２硫
该方法利用植酸酶可以水解植酸磷释放无 机磷 的原理， 通过加入三 盐酸使水解反应停止， 然后加入钼酸铵及 Ｆ Ｓ ７ ２ ｅ Ｏ ・Ｈ０的混 合液使 溶液 显色， ７ ０ ｍ波长下测定其 吸收值， 在 ２ｎ 以标准酶 为参照物 ， 间接计算 被测 样 品 中 酸 酶 的 含 量 。
一
擅酸 —— —・ Ｄ－。２ ，５ － － １ ，４ 。６ 五—黻 １ 一 。２ 二—馥 肌醇 ——— ＇ ２ 锻 ＿
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科技信息
博士 ・ 专家论 坛
槽酸酶活力昀测定方法及应注意问题
石 家庄职 业技 术学 院化 学工程 系 郭会灿 石 药 集 团维生 药业 李会 然
［ 摘 要 ］ 活力大小是衡 量酶制 剂质量的主要指标， 酶 选择 具有高度专一性和灵敏 度的酶 活测定 方法是酶制剂质量的保 障。 ［ 关键词 ］ 植酸酶 酶活力 测定 方法
植酸酶活性的测定——钼蓝法(精)
植酸酶活性的测定——钼蓝法1 原理针对预混料复杂的物料体系，用不同的缓冲液对其进行抽提，最大限度的减少饲料中无机磷，微量元素，多维及其他成分对植酸酶测定的影响，用钼蓝法对抽提液中植酸酶活性进行定量。
植酸酶在一定温度和pH条件下，水解底物植酸钠生成正磷酸和肌醇衍生物，在酸性环境中与钼酸铵显色剂反应生成蓝色的（Mo2O3•MoO3）复合物，在波长700nm下比色测定。
酶活力单位定义：在37℃、pH5.0条件下，每分钟从5.0mM植酸钠溶液中释放出1微摩尔的无机磷定义为1个酶活力单位（U）2 试剂本规定中所用试剂，在没有注明其它要求时，均指分析纯试剂；所用溶剂和水无注明时，均指蒸馏水。
清洗实验用容器不要用含磷清洗剂。
2.1 乙酸缓冲液A（0.25mol/L）：称取14.355g无水乙酸钠，加入0.5gTriton X-100和0.5g牛血清白蛋白，900ml水溶解，冰乙酸调pH值至5.00±0.01，水定容至1000ml。
2.2乙酸缓冲液B（0.25mol/L）：称取14.355g无水乙酸钠，加入1.0g吐温-20和30gEDTA，900ml水溶解，冰乙酸调pH值至5.00±0.01，水定容至1000ml。
2.3 植酸钠溶液（6.25mmol/L）：称取577.4mg肌醇六磷酸钠，加入574.2mg无水乙酸钠，90ml水溶解，冰乙酸调pH值至5.00±0.01，水定容至100ml，现用现配（实际反应液中的最终浓度为5.0mmol/L）。
2.4 终止液：5%三氯乙酸（5%TCA）。
2.5 1.5％钼酸铵（试剂A）：7.5g钼酸铵溶于400ml水中，慢慢加入22ml浓硫酸，水定容到500ml，冰箱储存，有效期1个月。
2.6 2.7％硫酸亚铁（试剂B）：冰箱储存，有效期1个月。
2.7 显色剂：移取4份试剂A（2.5），1份试剂B（2.6）混合后使用，现用现配。
2.8 磷酸二氢钾：称量前于烘箱中烘至恒重，用乙酸缓冲液（2.2）配制50mmol/L标准液，再用50mmol/L 配制成4.0mmol/L磷酸二氢钾，溶剂为乙酸缓冲液（2.2），冰箱储存。
固态发酵饲用植酸酶酶活的快速测定法
固态发酵饲用植酸酶酶活的快速测定法
1. 引言
固态发酵饲用植酸酶酶活是非标准化和相互依存性的特性，广泛用于饲料行业，其功能受外界因素的影响，其不稳定性容易导致各种质量问题。
为了解决这一问题，本文提出一种快速、准确的固态发酵饲料植酸酶酶活测定方法。
2.材料与方法
2.1 试剂与仪器：蔗糖、脱水乳酸钠、无机盐混合物，热沉淀仪、加速器和水分热分析仪。
2.2 取样：采样样品的量必须在25-50g之间，通常在30g左右，应严格按程序要求获取样品。
2.3 准备实验室温度：将实验室温度调节到22-25℃，保持室内的温度稳定，保证测定的结果的可靠性和准确性。
2.4 酶活测定：将取样的样品置于热沉淀仪中，加入蔗糖和脱水乳酸钠，根据酶学原理，用加速器调节温度，在37℃~ 45℃温度下保持稳定温度进行搅拌20min，完成后改变用水温度冷却，把热水温度改变到4℃，再进行搅拌5min，然后用蒸馏水冲洗样品，取最后收集的液体放入无水盐混合物中，再用水分热分析仪测得样品的水分，由此算出酶活的数值。
3.结果
在经过上述步骤后，样品的固态发酵饲料植酸酶酶活结果为：82.4U/g，符合要求。
4.结论
通过本文提出的固态发酵饲料植酸酶酶活快速测定方法，操作简单，结果准确，可以有效解决固态发酵饲料行业中植酸酶酶活测定的问题。
国标绝对法测定植酸酶产品活性的关键控制点
国标绝对法测定植酸酶产品活性的关键控制点畜禽饲料中添加使用微生物发酵生产的植酸酶可提高植物性饲料中植酸及其盐的利用率, 减少日粮中磷酸氢钙等磷源的添加量, 降低饲料成本, 目前已经被广泛使用。
为了确保实际生产中植酸酶使用效果, 如何准确测定植酸酶产品的酶活性是养殖场、饲料企业和酶制剂生产、经销商所共同关注的问题。
目前, 国内植酸酶产品酶活性测定大多采用国家标准 GB/T 18643—2002《饲料用植酸酶活性的测定分光光度法》。
该方法标准中, 包括两种方法: 绝对法和相对法。
该测定方法的分析步骤不是很复杂, 所涉及的仪器设备饲料企业的实验室也都有配备, 但要获得准确和重复性好的分析结果也不容易, 需要加强对检测原理和步骤的理解。
该方法是基于样品在植酸钠浓度为 5.0 mmol/l、温度37 ℃、pH 值 5.50 条件下, 每分种从植酸钠中释放 1 μmol 无机磷,即为 1 个植酸酶活性(以 U 表示)的定义基础上测定的。
鉴于绝对法应用比较普遍, 现将我们在开展植酸酶产品活性测定过程中一些经验体会总结如下, 供同行们参考。
1 溶液配制植酸酶活性测定直接所用到的溶液主要有 3 种,即乙酸缓冲溶液、植酸钠底物溶液和显色终止液。
1.1 乙酸缓冲溶液国标方法中, 绝对法测定植酸酶产品酶活性所使用的乙酸缓冲溶液浓度为:c(CH3COONa·H2O)=0.25 mol/l。
缓冲溶液是确保整个酶反应体系的 pH 值在规定范围内的关键因素, 必须准确配制。
1.1.1 配制方法称取 34.02 g 三水乙酸钠,0.1 g 吐温 20 于 1 000 ml容量瓶中, 加入 900 ml 水溶解, 用乙酸调节 pH 值至!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!《饲料工业》·2008 年第 29 卷第 14 期检测技术475.50±0.01, 室温下贮存 2 个月有效。
饲用植酸酶活性的测定—分光光度法
饲用植酸酶活性的测定—分光光度法一、术语和定义在温度37℃、pH值5.50条件下，每分钟从浓度为5.0mmol/L植酸钠溶液中释放1mol无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U表示。
二、原理植酸酶在一定温度和pH条件下，将底物植酸钠水解，生成正磷酸和肌醇衍生物。
在酸性溶液中，能与钒钼酸铵生成黄色的复合物，可于波长415nm下进行比色测定。
三、试剂和材料除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。
清洗试验用器皿不要用含磷清洗剂。
1、磷酸二氢钾(KH2PO4)：基准物。
2、乙酸缓冲液(I),c(CH3COONa)=0.25mol/L：称取34.02g三水乙酸钠于1000mL烧杯中，加入900mL水搅拌溶解，用冰乙酸调节pH值至5.50±0.01，再转移至1000mL容量瓶中，并用蒸馏水定容至刻度。
室温下存放2个月内有效。
3、乙酸缓冲液(Ⅱ)，c(CH3COONa)=0.25mol/L：称取34.02g三水乙酸钠，0.5g曲拉通X-100(Triton X-100)，0.5g牛血清白蛋白（BSA）于1000mL烧杯中，加入900mL水搅拌溶解，用冰乙酸调节pH值至5.50±0.01，再转移至1000mL容量瓶中，并用蒸馏水定容至刻度。
室温下存放2个月内有效。
4、底物溶液，c(C6H6O24P6Na12)=7.5mmol/L：称取0.69g植酸钠(C6H6O24P6Na12，相对分子质量为923.8,纯度为95%)，精确至0.1mg，置于100mL烧杯中，用约80mL乙酸缓冲液I溶解，用冰乙酸调节pH值至5.50±0.01，转移至100mL容量瓶中，并用乙酸缓冲液I定容至刻度，现用现配(实际反应液中的最终浓度为5.0mmol/L)。
5、硝酸溶液：1＋2水溶液。
6、钼酸铵溶液，100g/L：称取10g钼酸铵[(NH4)6Mo7O24·4H2O]于50mL烧杯中加水溶解，必要时可微加热，再转移至100mL容量瓶中，加入1.0mL氨水(25%)用水定容至刻度。
植酸酶
植酸酶活性最适条件测定一、实验目的1、掌握酶活力的测定方法以及影响酶活力的因素2、确定植酸酶活力的最佳条件二、实验原理植酸酶酶活性：样本在植酸钠浓度为5.0mol/L，温度37℃,pH5.5的条件下，每分钟从植酸钠中释放1µmol无极磷，即一个单位以U/ml或U/L计量。
植酸水解方程式：三、根据实验数据，通过作图分析得出植酸酶活性最佳条件1、酶活性随pH的变化由图可知当pH值5左右时酶活性最高，所以在该温度下植酸酶的最适pH在5左右。
2、离子对酶活性的影响通过柱形图可以看出，钾离子和镁离子的加入对酶活性几乎没有影响，加入钙离子和钠离子对酶活性具有促进作用，其中钙离子的作用大于钠离子，钙离子的加入是酶活性提高了大约50%，而锌离子和铜离子的加入对酶活性具有抑制作用。
3、酶活性随温度的变化通过酶活性随温度变化的曲线，得知酶的活性随温度升高而增大，当到达一定温度后，随温度增加而减小，曲线显示当温度为45℃左右时是植酸酶的最适温度。
4、酶的稳定性随时间的变化由实验数据作图知，植酸酶的稳定性随时间呈现指数下降的趋势，而且刚分离出的酶的稳定性最大。
5、双倒数曲线做出双倒数曲线，使1/ v 对1/[S]作图，可以获得一条直线。
从直线与x轴的截距可以得到1/Km的绝对值；而1/Vmax是直线与y轴的截距。
得Vm=0.2955 Km=0.25256、酶的初速度测定37℃酶醋的反应的速度随时间增大，且增大的越来越慢，最后接近恒定。
7、铜离子和锌离子浓度对酶的影响由离子对植酸酶的影响柱形图知，铜离子和锌离子对植酸酶的活性有抑制作用，通过数据分析得知，随着铜离子和锌离子浓度的提高，对植酸酶的活性抑制作用越明显。
《饲用植酸酶活性的测定——分光光度法》新旧国标变化及解读
《饲用植酸酶活性的测定——分光光度法》新旧国标变化及解
读
新旧国标变化
新国标对饲用植酸酶活性的测定——分光光度法有如下变化：
1. 采用了最新的国际标准，将测定植酸酶活性的方法更新为分光光度法。
2. 将植酸酶活性的测定范围从原来的0.02-0.20 U/mL扩大到
0.05-0.20 U/mL。
3. 将植酸酶活性的测定精度从原来的±10%提高到±5%。
4. 将植酸酶活性的测定温度从原来的25℃改为37℃。
解读
新国标对饲用植酸酶活性的测定——分光光度法进行了更新，使测定植酸酶活性更加准确、可靠，有利于更好地保障饲料质量。
新国标将测定植酸酶活性的范围扩大，精度提高，温度改变，使测定更加精确，可以更好地反映植酸酶活性的实际情况，从而更好地控制饲料质量。
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饲料中植酸酶活性测定方法探讨摘要:参照国标测定植酸酶活性的方法,研究了钼黄法和钼蓝法的稳定性及植酸酶活性测定时反应体系中缓冲液、pH值以及Cu、Zn、Mn金属离子对酶活性的影响。
结果表明:钼黄法与改进后的钼蓝法稳定性没有明显差异,但钼蓝法更适合微量磷的测定;柠檬酸盐缓冲液作为植酸酶酶解反应的缓冲体系时显色的稳定性较差;反应温度、pH及Cu、Zn金属离子对酶活性影响较大,测定植酸酶活性时需要严格控制反应条件,屏蔽金属离子的干扰。
关键词:饲料;植酸酶;活性;测定目前,植酸酶制剂在畜禽饲料生产中已得到广泛应用,但饲料中植酸酶活性的测定方法还存在一些争议。
2002年,国家颁布了饲用植酸酶活性的测定方法标准(GB/T 18634)2002),该标准注明其适用于饲料添加剂用的植酸酶产品,也适用于添加有植酸酶的配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料,但配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料成分显然更为复杂,其适用性受到质疑[1]。
因此,关于饲料中植酸酶活性测定方法问题有待进一步研究。
1 试验材料与方法1.1 主要仪器与设备电热恒温水浴锅(室温-100e,控温精度?1e)、离心机(最高转速6 000 r/min)、721型分光光度计、分析天平、pH计、磁力搅拌器、0. 22Lm微孔滤膜。
1.2 试剂1.2.1 偏钒酸铵-钼酸铵-硝酸显色液方法见GB/T 18634)2002。
1.2.2 盐酸-乙酸钠缓冲液方法见GB/T 18634)2002乙酸缓冲液(I)的配制。
1.2.3 磷标准溶液将磷酸二氢钾于105e恒温箱中干燥2 h,在干燥器中保存;称取磷酸二氢钾0. 020 3 g,溶解于蒸馏水中定容至100 ml。
1.2.4 植酸酶溶液方法见GB/T 18634)2002。
1.2.5 植酸钠溶液方法见GB/T 18634)2002。
1.2.6 硫酸-钼酸铵溶液量取20 ml浓硫酸(98% )于100 ml蒸馏水中,称取1. 500 g钼酸铵微热溶解于50 ml蒸馏水中,按比例混合待用。
1.2.7 抗坏血酸溶液称取5. 400 g抗坏血酸用蒸馏水溶解,定容至100 m,l于4e冰箱保存待用。
1.2.8 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液按一定体积比混合0. 1 mol/L柠檬酸溶液和0. 1 mol/L柠檬酸钠溶液,用pH计调节,使其pH值分别至2. 50、3. 50、4. 50、5. 50、6. 50、7. 50。
1.2.9 SnCl2-甘油溶液称取2. 501 g SnCl2溶解于100 ml甘油中,避光保存,溶液可稳定数周。
1.2.10 钼酸铵-硫酸-酒石酸氧锑钾显色液量取硫酸-钼酸铵溶液150 m,l称取0. 070 g酒石酸氧锑钾溶于20 ml蒸馏水,将以上溶液混合待用。
1.2.11 三氯乙酸溶液量取三氯乙酸15 ml用蒸馏水定容至100 ml。
1.2.12 硫酸锌溶液称取0. 088 5 g ZnSO4#7H2O于100 ml容量瓶中,用pH5. 50盐酸-乙酸钠缓冲液溶解并定容至刻度,摇匀。
1.2.13 硫酸铜溶液称取0. 078 2 g CuSO4#5H2O于100 ml容量瓶中,用pH5. 50盐酸-乙酸钠缓冲液溶解并定容至刻度,摇匀。
1.2.14 硫酸锰溶液称取0. 061 5 g MnSO4#H2O于100 ml容量瓶中,用pH5. 50盐酸-乙酸钠缓冲液溶解并定容至刻度,摇匀。
1.3 试验方法1.3.1 植酸酶活性单位的定义国家标准GB/T 18634)2002定义:植酸酶样品在植酸钠浓度为5. 0 mmol/L、温度37e、pH值5. 50的条件下,每1 min从植酸钠中释放1Lmol无机磷,即为一个植酸酶活性单位,以/U0表示。
1.3.2 测定原理钼黄法(偏钒酸铵法)原理:植酸酶在一定温度和pH值条件下,水解底物植酸钠,生成正磷酸和肌醇衍生物,在酸性环境中,用钒钼酸铵处理生成黄色复合物,在415 nm波长下进行比色分析。
钼蓝法原理:植酸酶在一定温度和pH值条件下,水解底物植酸钠,生成正磷酸和肌醇衍生物,在酸性环境中,用钼酸42 万丹等:饲料中植酸酶活性测定方法探讨/2007年第11期铵处理生成蓝色复合物,在810 nm波长下进行比色分析。
1.3.3 钼蓝法反应条件的探讨1.3.3.1 SnCl2-甘油溶液和抗坏血酸-酒石酸氧锑钾作反应体系还原剂的比较分别取磷标准溶液2 ml放至4个50 ml容量瓶中,分A、B组,每组2个平行样。
A组分别加入4 ml钼酸铵-硫酸-酒石酸氧锑钾显色液, 1 ml抗坏血酸溶液,定容至50 m;l B组分别加入4滴SnCl2-甘油溶液, 2 ml硫酸-钼酸铵溶液,定容至50 ml。
均在室温下静置20 min,于810 nm波长下测定其吸光值。
1.3.3.2 反应体系的温度及加热时间的探讨以酒石酸氧锑钾-抗坏血酸作还原剂,试剂的添加量同3. 1. 3. 1中A组,定容摇匀后分别在40、50、60、70和100e下加热5、10和15 min,立即冷却至室温,测定吸光值。
1.3.3.3 钼黄法与钼蓝法比较参照国家标准GB/T 18634)2002植酸酶活性测定方法,取3 ml植酸钠溶液和0. 1 ml植酸酶溶液,再加入9 mlpH 5. 50的盐酸-乙酸缓冲液,分别用钼蓝法和钼黄法进行比色分析。
1.3.4 不同反应体系条件对植酸酶活性测定影响1.3.4.1 缓冲液取3 ml植酸钠溶液和0. 1 ml植酸酶溶液于比色管中,分别加入9 ml pH 5. 50的盐酸-乙酸钠缓冲液和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液于37e电热恒温水浴锅加热30 min。
到达设定时间后立即从水浴锅中取出,并加入4 ml三氯乙酸溶液终止反应。
取反应后混合液0. 25 ml于50 ml容量瓶中,加入钼酸铵-硫酸-酒石酸氧锑钾显色液4 ml和抗坏血酸溶液1 m,l定容。
在50e电热恒温水浴锅中水浴加热15 min后立刻冷却至室温,在810 nm波长处测定吸光值。
1.3.4.2 pH值对植酸酶活性的影响设置6个平行,分别加入的盐酸-乙酸钠缓冲液的pH值为2. 50、3. 50、4. 50、5. 50、6. 50、7. 50;其余操作同1. 3. 4. 1。
1.3.4.3 不同浓度Cu2+、Zn2+、Mn2+对植酸酶活性的影响试验分3组,每组4个平行。
以pH5. 50盐酸-乙酸缓冲液作反应体系的缓冲液,加入硫酸铜溶液、硫酸锌溶液、硫酸锰溶液分别为0. 0、0. 1、0. 2和0. 3 m;l其他试剂添加量及操作步骤同1. 3. 4. 1。
2 结果与讨论2.1 钼蓝法的改进及改进后的效果用未经改进的钼蓝法测定磷含量时显色稳定性如图1所示。
图1 未经改进的钼蓝法稳定曲线由图1可见,随着时间的变化,吸光值逐渐升高, 110 min还未能达到稳定状态。
针对钼蓝法显色不稳定的缺点,本试验通过在反应中添加还原剂、改变反应温度和加热时间等措施对钼蓝法进行改进。
结果表明,相同条件下,使用SnCl2-甘油溶液作还原剂时,显色稳定性较差,使用钼酸铵-硫酸-酒石酸氧锑溶液作还原剂时,显色稳定性得到提高,而使用酒石酸氧锑钾-抗坏血酸作还原剂显色稳定性最好。
在选用酒石酸氧锑钾-抗坏血酸作还原剂时,改变反应温度和加热时间,其对显色反应的影响结果如图2所示。
图2 加热温度及时间对显色反应的影响由图2可知,在加热温度为50~60e、加热时间为5~15 min时,显色反应比较稳定。
在50e水浴10 min,冷却至室温后开始计时,得到的吸光度-时间关系曲线见图3。
图3 改进后的钼蓝法稳定曲线由图3可见,在该反应条件下显色稳定,且稳定时间可达2 h(图3中仅标出了70 min内的显色情况)。
改进后的钼蓝法与钼黄法相比,反应更灵敏,反应的稳定性得到提高。
2.2 不同反应体系条件对植酸酶活性测定影响结果2.2.1 柠檬酸缓冲液和乙酸缓冲液对植酸酶活性影响由图4可见,用柠檬酸缓冲液作缓冲体系时,吸光值呈下降趋势;而用乙酸缓冲液作缓冲体系时,吸光值在1 h内都很稳定。
所以,测定植酸酶活性时缓冲液应选用乙酸缓冲液。
本试验的结果与文献[2]报道的一致。
图4 柠檬酸缓冲液和乙酸缓冲液作反应体系缓冲液的比较Kim TW等[3]报道,选用pH 5. 50柠檬酸缓冲液提取饲料样品中植酸酶,可提高试验结果的精确度;但从本试验的结果来看,柠檬酸缓冲液的显色稳定性较乙酸缓冲溶液差。
万丹等:饲料中植酸酶活性测定方法探讨/2007年第11期43因此,用柠檬酸缓冲液作为测定植酸酶活性的提取液是否适宜还有待进一步研究。
2.2.2 pH值对植酸酶活性的影响由图5可见,在pH5. 50和pH2. 50处各有一个峰值,这与文献[2]、[4]报道的基本一致。
还可看出,在pH5. 50时虽然有一个峰值,但吸光值较在pH2. 50时小;所以,测定植酸酶活性选pH2. 50较为适宜。
图5 不同pH值对植酸酶活性测定的影响2.2.3 不同浓度的Cu2+、Zn2+、Mn2+对植酸酶活性的影响由图6可见,Cu2+、Zn2+离子对植酸酶活性有明显影响,其中Zn2+对酶活有一定的激活作用, Cu2+对酶活有明显的抑制作用;而Mn2+对植酸酶活性影响不大。
造成这一差异的主要原因可能与不同金属离子与酶的反应的类型不同造成的。
图6 不同浓度Cu、Zn、Mn离子对植酸酶活性测定的影响大多数金属阳离子可与底物发生强烈的络合作用而抑制植酸酶的活性,但一些金属离子可以作为电子转移载体,起到酶激活剂的作用[5、6],这可能是不同的金属离子对植酸酶活性的影响表现出一定差异性的原因。
3 小结(1)本试验对钼蓝法进行了改进。
结果表明:用酒石酸氧锑钾-抗坏血酸作还原剂,加热温度为50~60e、加热时间为5~15 min时,可以使钼蓝法的稳定性得到提高,显色时间可以稳定在2 h以上。
改进后的钼蓝法同样适用于无机磷的测定。
(2)柠檬酸缓冲液作为植酸酶的酶解反应缓冲体系,其显色稳定性较差;而乙酸缓冲液较为稳定。
因此选用乙酸缓冲液作为缓冲体系较为适宜。
(3)反应体系中不同的pH值对植酸酶活性的测定影响较大,应根据不同的酶源选择相应反应体系的pH值。
(4)Cu2+、Zn2+对植酸酶活性有较大影响。
因此测定饲料中植酸酶活性时(尤其是预混料),应先屏蔽Cu2+、Zn2+的影响,然后再进行植酸酶活性的测定。
[参考文献][1] 刘志伟,黄玉亭,张铁鹰,等.国标法测定植酸酶活性存在问题的探讨[J].中国饲料, 2006(18) : 29~31.[2] 尹清强,韩彪,王国强,等.不同的处理条件对植酸酶活力的影响[J].饲料工业, 2005, 26 (5): 41~42.[3] Kim TW, LeiX G. An ImprovedMethod forRapidDetermination ofPhytaseActivity in Animal Feed[J]. JAnim Sc,i 2005, 83: 1 062~1 067.[4] 谭宝玲,陈丽,冯建文,等.植酸酶活性测定方法[J].广东饲料, 2006, 15(5): 43~44.[5] 于洪恩,刘建平,王晓睿.植酸酶在饲料中的应用[J].今日畜牧兽医, 2006(1): 17~18.[6] 艾晓杰,金凌艳.植酸酶使用中应注意的问题[J].中国动物保健, 2005(11): 42~45.(责任编辑:苏幔)(上接第36页)3.2 对粪便内菌群的影响动物粪便中的菌群种类基本同肠道内的菌群种类保持一致,但在数量上有一定的差异。