双向凝胶电泳
《双向电泳技术》课件
高通量
该技术可以同时分离大量蛋白质，提高了实 验的通量。
高稳定性
该技术具有较高的稳定性，实验结果重复性 好。
缺点
实验周期长
双向电泳技术的实验周期较长 ，需要耗费较多的时间和人力
。
对样品要求高
该技术需要大量的起始样品， 并且对样品的纯度要求较高。
对实验条件要求严格
双向电泳技术的实验条件较为 苛刻，需要精确控制实验参数 。
在药物研发中的应用
总结词
双向电泳技术为药物研发提供了高通量和高效率的蛋白质分离手段，有助于发现潜在的药物靶点和筛 选候选药物。
详细描述
在药物研发过程中，双向电泳技术可用于分析药物对蛋白质表达谱的影响，从而发现药物作用的靶点 。此外，通过比较不同物种或组织的蛋白质表达谱，可以发现潜在的药物靶点，为新药研发提供思路 和候选药物。
应用领域的拓展
疾病诊断与治疗
利用双向电泳技术分析疾病相关蛋白质，为疾病诊断 和治疗提供依据。
药物研发
通过双向电泳技术筛选药物作用靶点，加速新药研发 进程。
生物工程与农业
在生物工程和农业领域中应用双向电泳技术，优化生 物过程和育种。
未来发展方向与挑战
标准化与规范化
建立双向电泳技术的标准化操作流程和质量控制体系，提高实验 结果的可靠性和可比性。
CHAPTER 02
双向电泳技术的实验流程
样本制备
01
02
03
样本选择与处理
选择适当的组织或细胞样 本，进行适当的处理以提 取蛋白质。
蛋白提取
使用适当的缓冲液和试剂 ，从样本中提取蛋白质。
蛋白定量
使用蛋白质定量方法，确 定蛋白质的浓度。
蛋白质提取
溶解蛋白质
双向凝胶电泳
双向凝胶电泳(2-DE)双向凝胶电泳的原理是第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离,第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分离,把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。
近年来经过多方面改进已成为研究蛋白质组的最有使用价值的核心方法。
分离蛋白质组所有蛋白的两个关键参数是其分辨率和可重复性。
在目前情况下,双向凝胶电泳的一块胶板(16cm×20cm)可分出3~4千个,甚至1万个可检测的蛋白斑点,这与10万个基因可表达的蛋白数目相比还是太少了。
80年代开始采用固定化pH梯度胶,克服了载体两性电解质阴极漂移等许多缺点而得以建立非常稳定的可以随意精确设定的pH梯度。
由于可以建立很窄的pH范围(如0.05U/cm),对特别感兴趣的区域可在较窄的pH范围内做第二轮分析,从而大大提高了分辨率。
此种胶条已有商品生产,因此基本上解决了双向凝胶电泳重复性的问题。
这是双向凝胶电泳技术上的一个非常重要的突破。
第二向SDS-PAGE有垂直板电泳和水平超薄胶电泳两种做法,可分离10~100kD分子量的蛋白质。
其中灵敏度较高的银染色法可检测到4ng蛋白,最灵敏的还是用同位素标记,20ppm 的标记蛋白就可通过其荧光或磷光的强度而测定。
用图像扫描仪、莱赛密度仪、电荷组合装置可把用上述方法得到的蛋白图谱数字化,再经过计算机处理,去除纵向和横向的曳尾以及背景底色,就可以给出所有蛋白斑点的准确位置和强度,得到布满蛋白斑点的图像,即所谓“参考胶图谱”。
蛋白质组研究的主要困难是对用双向凝胶电泳分离出来的蛋白,进行定性和定量的分析。
最常用的方法是先把胶上的蛋白印迹到PVDF(polyvinylidene difluoride)膜上后再进行分析,确定它们是已知还是未知蛋白。
现在的分级分析法是先做快速的氨基酸组成分析,也可先做4~5个循环的N末端微量测序,再做氨基酸组成分析;结合在电泳胶板上估计的等点电和分子量,查对数据库中已知蛋白的数据,即可作出判断。
双向凝胶电泳的图像分析ppt课件
• 所有点的含量通过单个点的光密度值比上 胶上所有点光密度值
• 归一化处理后的数据是否合理决定着图像 分析数据统计学分析的可靠性。
第五节 凝胶配比分析
一、原因 通过多次凝胶电泳的结果提高实验的可靠性，就
需要进行不同凝胶间斑点的配比分析。 包括：凝胶的匹配和斑点的比较 匹配的目的是为了对已经进行了点检测的凝胶之
二、算法
是对凝胶中的蛋白质的斑点经扫描后获得的数 据，进行检测、评判和定量分析的过程。
原理：是以每一个像素点为中心构建算子，然 后比较算子中心与边缘的吸光度，如果中心与边 缘的强度相比足够大，则此像素点被认为是某蛋 白质点的一部分，如此重复对每一个像素点进行 搜索，最终构建该凝胶的图谱。
高斯拟合和高斯拉普拉斯变换斑点检测法。
四、比较
第六节 数据分析
涉及到质的准确性评估，量的确定，表 达中的定量变化
第七节 数据呈递
每个蛋白质斑点应该有一个相对分子质 量（Mr)和等电点（pI）。因此利用某些特征 的蛋白质斑点（参考胶上的斑点），一种Mr /pI晶格形式就覆盖在凝胶上，从而推测Mr /pI值。这些蛋白质斑点是已知蛋白质，并易像素为基础、 具有不同灰度强弱和一定边界方向的斑点的电脑信号。
典型流程：
• 凝胶图像的扫描： • 图像加工： • 斑点检测和定量： • 凝胶配比： • 数据分析： • 数据呈递（report） • 2-DE数据库的建立：
第二节 双向凝胶电泳图像采集
第四章 双向凝胶电泳的图像分析
第一节 概述 一、图像分析工具
1.硬件设备： 一定的电脑配置,Pentirm 166处理器，64M 内存，3G硬盘，1024*768分辨率 ，256色， SCI接口，windows操作系统
双向凝胶电泳实验方法
双向凝胶电泳实验方法实验方案1.样品制备(Sample preparation)1.1仪器高速离心机1.2试剂NS(制备好的);Citrated human plasma ;溶解缓冲液(9M 尿素，4 , CHAPS，2 , IPG 缓冲液，40 mM DTT,40mM Tris-base) 1.3样品处理方法1).吸取适量的制备好的NS加入到Citrated human plasma 中，在温度为37°下孵化5min。
NS与血浆的加入比例为0.6:8ml。
2)孵化后，将样品高速离心，离心转速为，时间为。
3)除去上清液，将沉淀的纳米球再混悬于0.05M，pH7.4的磷酸缓冲盐中，再次以上次条件离心，本步骤重复三次。
4)将离心后收集到的总蛋白溶解于溶解缓冲液(9M 尿素，4 , CHAPS，2 , IPG 缓冲液，40 mM DTT,40mM Tris-base)。
2.第一相等电聚焦(IEF)2.1固定化 pH 剃度胶条的水化(IPG strip rehydration) 2.1.1仪器IPGphor2.1.2试剂水化液(8 M 尿素，2 % CHAPS，15 mM DTT 和 0.5 % IPG 缓冲液) 水化液需当天新鲜配制2.1.3实验步骤A. 加样品溶涨1).用样品溶解缓冲液(9M 尿素，4 , CHAPS，2 , IPG 缓冲液，40 mM DTT,40mM Tris-base)溶解样品。
蛋白质上样浓度(Q:如何确定上样浓度,)不要超过 10 mg/ml，否则会造成蛋白质的集聚或沉淀。
2).吸取适量(见下表1)含有样品的水化液放入标准型胶条槽中，为确保样品充分进入胶条中，不要加入过量的水化液。
表1 IPG胶条所需水化液体积3).去掉 IPG 胶条的保护膜，胶面朝下，先将 IPG 胶条尖端(阳性端)朝标准型胶条槽的尖端方向放入胶条槽中，慢慢下压胶条，并前后移动，避免生成气泡，最后放下 IPG 胶条平端(阴极)，使水化液浸湿整个胶条。
双向凝胶电泳
返 回
步骤： SDS-PAGE凝胶的制备 IPG胶条在SDS缓冲液中的平衡 将平衡好的IPG胶条放至 SDS-PAGE凝胶上 质谱相兼容的银染 用SYPRO Ruby 对蛋白质进行 荧光染色 用GelCode磷蛋白染色试剂盒进 行磷蛋白染色
返 回
双向凝胶电泳
制作人：李炳宏
样品的制备 第一向等电聚焦电泳 第二向SDS-PAGE凝胶电泳 蛋白质的显色 印迹法分析双向凝胶的方法
1.中性变性剂 一般是脲素或脲素与脲素 衍生物的混合物
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2.中性或两性去垢剂 非离子型去垢剂（Triton X100,Nonidet P-40） 两性离子去垢剂CHAPS,CHAPSO
透析、凝胶过滤除盐。
2）核酸 影响：导致IEF胶上的酸性区域难以聚 焦，并且对双向凝胶进行 银染时， 核酸会产生高背景；DNA的存在使 样品粘性太高不能有效分离。 去除：超速离心
3).脂类
影响：脂类与蛋白质形成复合物，减少蛋 白质的溶解度，也可以和去垢剂形成复 合物，降低去垢剂的效率。
去除：有机溶剂沉淀。
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SDS(十二烷基磺酸钠) 优点：具有迅速抽提蛋白质的能力，同 时还能使修饰酶失活 缺点：SDS与样品蛋白质结合，干扰蛋 白质的分离
3.还原剂
β-巯基乙醇
巯基还原剂【二硫苏
糖醇（DTT）和二硫赤藓糖醇（DTE）】
4.两性电解质溶液或缓冲液
作用:维持蛋白质溶解的最佳pH 条件，以及减少由于电荷之间的相 互作用导致的蛋白质聚集
注意：在第一向分离时缓冲液浓度不 能太高
阳离子缓冲液（如Tris）会向阴极 移动并集中在阴极，导致pH梯度末端分 离效果不佳。 两性电解质溶液（如HEPES）能聚 集在pH梯度中，产生高传导性区域，使 此处蛋白质不能聚焦。
双向电泳的概念和原理
双向电泳的概念和原理双向电泳是一种采用两个方向的电场同时作用于凝胶电泳系统的技术，用于分离复杂样品中的蛋白质或核酸。
首先，将样品溶解于含有凝胶的电泳缓冲液中。
凝胶是一种聚合物网状结构，可以限制分子的运动，将其分离。
常见的凝胶材料包括聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶。
第一步是水平电泳。
在水平电泳阶段，一个方向的电场施加在凝胶中，使得带电分子向着相应的电极方向移动。
这个方向通常被称为水平方向，因为它从一个电极移动到另一个电极。
在水平电泳过程中，由于分子的大小和电荷不同，它们将以不同的速度在凝胶中运动。
大分子移动缓慢，小分子移动快速。
这样，分子根据大小按照一定的顺序移动，导致它们在凝胶中排列成一条通常是呈斜角的直线。
这个方向通常被称为水平电泳通道。
第二步是垂直电泳。
在水平电泳结束后，垂直电场被施加在凝胶中，使分子以另一个方向移动。
这个方向通常被称为垂直电泳通道。
在垂直电泳过程中，分子将根据它们的电荷大小被拖曳向上（正电流）或向下（负电流）。
正电流将使分子向上移动，而负电流将使分子向下移动。
这样，分子将根据其电荷被分离并在凝胶中形成一条平行于水平电泳通道的直线。
最终，两个方向的电泳都完成后，在凝胶上会形成一个类似网格的结构，其中分子被分离成不同的带状。
这些带状物可以被染料或放射性示踪剂探测出来，从而确定分离出的分子的位置。
总结起来，双向电泳是一种利用两个方向的电场移动分子的方法。
通过水平电泳和垂直电泳，分子根据其大小和电荷被分离成不同的带状，从而实现复杂样品中蛋白质或核酸的分离和分析。
双向电泳技术
变性2D-PAGE：样品先用2%SDS＋5%β-ME＋95℃变性5min，IEF在 8M尿素＋1%NP-40条件下进行，之后胶条用2%SDS＋5%β-ME平衡， 然后进行SDS-PAGE。该技术适于DNA序列和多肽结构的分析，或分 析被碳氢键连接和其它翻译后修饰所引起的多肽结构微异质性，但此 方式显示的大于100Kd的蛋白质点少于第三种方式
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丙烯酰胺会产生如下几个化学反应：
•高浓度酸和碱会促进其水解形成丙烯酸和NH3。 •与一些羟基化合物如酚或酯族醇反应，生成β-芳氧基或烷 氧基丙酰胺。 •在20℃能NH3反应，生成β、β′、β″-氮川三丙酰胺。 •与一些硫醇反应，生成β-烷基丙酰胺。 •也会由于超声、γ-射线和自然光线引起聚合作用。如果烃 键靠近在高度聚合的位置，酰胺基也会受到分子间的缩聚 作用而成亚胺桥。
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IPG胶条的重泡胀
泡胀的实质：是让样品能完全以可溶性的形式进 入IPG内，从而能进行接下来的IEF。
不同的加样方法和加样量会导致最终结果的差异： Protean IEF cell、IPGphor等集成设备的使用： 20mmol/L DTT 垫片的使用： 温度的源自择：46蛋白载样量
影响IPG胶条对蛋白载样量的因素包括： 待分析的蛋白点的量应满足随后的质谱分析。 电泳的目的：如果只是得到一张好的图片，则无需考
双向电泳技术
1、丙烯酰胺凝胶有以下优点：
①几乎无电渗作用。 ②化学性能稳定，与被分离物不起化学反应。对pH和温度 变化较稳定。
蛋白质双向凝胶电泳原理及应用
蛋白质双向凝胶电泳原理及应用一、双向凝胶电泳（2-DE）的原理双向凝胶电泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）的原理是第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，蛋白质沿pH梯度分离至各自的等电点；第二向则按分子量的差异用SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶进行分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。
近年来经过多方面改进已成为研究蛋白质组的最有使用价值的核心方法。
二、关键参数分辨率和可重复性。
目前，双向凝胶电泳的一块胶板（16cm×20cm）可分出3～4千个，甚至1万个可检测的蛋白斑点。
采用固定化pH梯度胶，克服了载体两性电解质阴极漂移等许多缺点而得以建立非常稳定的、可以随意精确设定的pH梯度。
建立很窄的pH范围（如0.05U/cm)，对意向区域在pH范围内做第二轮分析，从而大大提高分辨率，威斯腾生物实验中心对这方面的研究比较全面和成熟。
灵敏度。
双向凝胶电泳灵敏度较高的银染色法可检测到4ng蛋白，最灵敏的是用同位素标记，20ppm的标记蛋白可通过其荧光或磷光的强度而测定。
双向凝胶电泳用图像扫描仪、莱赛密度仪、电荷组合装置可把用上述方法得到的蛋白图谱数字化，再经过计算机处理，就可以给出所有蛋白斑点的准确位置和强度，得到布满蛋白斑点的图像，即“参考胶图谱”。
三、蛋白质组研究的主要困难对用双向凝胶电泳分离出来的蛋白，进行定性和定量分析。
双向凝胶电泳最常用的方法是先把胶上的蛋白印迹到PVDF膜上后再进行分析，确定是已知还是未知蛋白。
现在的分级分析法是先做快速的氨基酸组成分析，也可先做4～5个循环的N末端微量测序，再做氨基酸组成分析；结合在电泳胶板上估计的等点电和分子量，查对数据库中已知蛋白的数据，即可作出判断。
四、蛋白质的翻译后修饰和加工指在肽链合成完成后进行的化学反应，如磷酸化、羟基化、糖基化、二硫键形成等，可能有一百种以上。
双向凝胶电泳翻译后修饰和加工对蛋白质的正常生理功能是必需的，它们的变化往往和疾病的发生有关。
《双向凝胶电泳 》课件
双向凝胶电泳的原理
等电聚焦
在第一向电泳中，蛋白质根据其等电点进行分离，聚焦在相应的pH区域。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
在第二向电泳中，已经分离的蛋白质加入SDS（十二烷基硫酸钠）后带负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中按分子量大 小进行分离。
生物标志物发现
通过双向凝胶电泳技术寻 找新的生物标志物，用于 疾病预警、监测和治疗。
药物研发
利用双向凝胶电泳技术分 析药物作用机制和靶点蛋 白质，为新药研发提供支 持。
研究展望
蛋白质组学研究
随着蛋白质组学研究的深入，双 向凝胶电泳技术有望在更广泛的 领域发挥重要作用。
跨学科合作
加强与其他学科领域的合作，共 同推动双向凝胶电泳技术的发展 和应用。
样品上样
将处理好的蛋白质样品上样到第一向 等电聚焦凝胶中。
等电聚焦
在第一向等电聚焦凝胶中进行等电聚 焦，分离蛋白质。
固相pH梯度第二向分离
将第一向分离后的蛋白质从凝胶中转 移到第二向SDS-PAGE凝胶中进行第 二向分离。
图像分析
染色与脱色
01
对第二向分离后的凝胶进行染色和脱色，以便观察和检测蛋白
研究疾病的发生和发展机制，为疾病的诊断和治疗提供依据。
03
生物标志物发现
利用双向凝胶电泳技术可以发现与疾病相关的生物标志物，如肿瘤标志
物、感染性疾病相关蛋白等，有助于疾病的早期诊断和预后评估。
在医学研究中的应用
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药物作用机制研究
通过双向凝胶电泳技术分析药物作用前后蛋白质 表达谱的变化，有助于揭示药物的作用机制和靶 点。
数据共享和分析
质谱鉴定双向电泳蛋白
百泰派克生物科技质谱鉴定双向电泳蛋白双向电泳即双向凝胶电泳，是凝胶电泳的一种形式，通常用于分析蛋白质。
通过双向电泳将样品中的蛋白质进行分离检测后，可以选取感兴趣的目标蛋白进行质谱鉴定，以实现更精确的鉴定。
百泰派克生物科技提供双向电泳获得的兴趣蛋白的质谱鉴定服务。
双向电泳双向电泳（two-dimensional electrophoresis），也称作双向凝胶电泳（Two-dimensional gel electrophoresis）或二维凝胶电泳，缩写为2-DE或2-D电泳，是凝胶电泳的一种形式，通常用于分析蛋白质。
双向电泳是等电聚焦（isoelectric focusing，IEF）和SDS-PAGE的结合。
蛋白质混合物在二维凝胶上，首先根据pH值对蛋白质进行等电聚集电泳分离，之后根据蛋白质分子大小进行SDS-PAGE分离。
双向电泳完成后，将凝胶进行染色即可得到一个蛋白质二维分布图。
常用的染色技术有考马斯亮蓝染色、银染、负染和荧光染色。
双向电泳中，通过在电泳时在一条泳道上添加已知相对分子质量的一系列标准蛋白质，可以对样品中的蛋白质的相对分子质量进行估算。
质谱鉴定双向电泳蛋白通过双向电泳将样品中的蛋白质进行分离检测后，可以选取感兴趣的目标蛋白进行质谱鉴定，从而实现目标蛋白的精确鉴定。
对于Coomassie Blue，SYPRO Ruby以及Silver stain染色的样品，均可通过质谱进行蛋白的鉴定。
但是，银染的样品有可能会与质谱分析不兼容，推荐使用以下产品或者实验步骤进行银染实验：ProteoSilver Plus, Sigma (Product # PROTSIL1 or PROTSIL2)；Dodeca Silver Stain, BioRad (Product # 161-0481 or 161-0480)。
此外，用于质谱鉴定的银染样品不要进行脱色处理。
双向凝胶电泳特点
双向凝胶电泳特点
双向凝胶电泳是一种常用的蛋白质或核酸分析技术，其特点如下：
1. 高分辨率：双向凝胶电泳可以提供较高的分辨率，允许分离几乎相同大小的DNA片段或蛋白质，使其成为分析样品组成和结构的有力工具。
2. 分离适应性强：双向凝胶电泳适用于各种样品类型，包括DNA、RNA和蛋白质等，可以进行定性和定量分析。
3. 定量准确性：通过比较样品与标准曲线，双向凝胶电泳可以精确地确定样品中的目标物含量。
4. 可视化：双向凝胶电泳结果可以直接观察，并且可以使用染色剂或放射性示踪剂对目标蛋白质或核酸进行可视化。
5. 提供局部结构信息：双向凝胶电泳可以提供有关分子的局部结构信息，如转录起始位点、剪接位点等。
6. 适用于高通量分析：双向凝胶电泳可以同时分析多个样品，适用于高通量分析，提高分析效率。
总的来说，双向凝胶电泳具有高分辨率、适用于多种样品、准确度高、可视化、提供局部结构信息和高通量分析等特点，是一种常用的分析技术。
双向电泳的原理及步骤
双向电泳的原理及步骤
双向电泳是一种分离蛋白质的方法，基于蛋白质在电场中的电荷和大小的不同进行分离。
以下是双向电泳的原理及步骤：
原理：
双向电泳是将蛋白质样品首先进行等电聚焦，然后再进行垂直于等电聚焦方向的SDS-PAGE电泳，从而获得更高的分离效率。
等电聚焦可以将蛋白质按照等电点的不同进行分离，而SDS-PAGE电泳可以将蛋白质按照分子量的大小进行分离。
通过这两个步骤的组合，可以更加准确地分离出蛋白质。
步骤：
1. 等电聚焦：将蛋白质样品加入到等电聚焦电极中，该电极包含有一系列等电点缓冲液。
在等电聚焦过程中，电极会产生一个电场，该电场会将带有不同电荷的蛋白质分子朝向不同方向移动，最终在等电点处停留。
这样可以将蛋白质按照等电点的不同进行分离。
2. SDS-PAGE电泳：在等电聚焦完成后，将电极旋转90度，使其与等电聚焦电极垂直。
然后将电极中的蛋白质样品注入到SDS-PAGE凝胶中，并进行电泳。
在SDS-PAGE电泳中，蛋白质会在电场中移动，但由于SDS的存在，蛋白质会被完全线性化。
这样可以将蛋白质按照分子量的大小进行分离。
3. 结果分析：通过电泳分离，可以得到一系列不同的蛋白质带，每个带代表一个蛋白质。
通过比对蛋白质带的大小和位置，可以鉴定蛋白质的分子量和等电点，从而确定蛋白质的特征。
蛋白质组学研究中的核心技术—双向凝胶电泳
(4)c. 图像分析及数据处理(3)经活检及病理证实，有 12 条为扩张型心肌病特有的蛋白。
(6)RA 和 OA ：类风湿关节炎 (RA) 是一种常见的慢性炎性关节疾病，本病侵犯多个关节，主要累及手足小关节，病情迁延反复，主要的病理变化为关节滑膜的慢性炎症，细胞侵润，血管翳形成，软骨及骨组织侵蚀，导致关节结构的破坏，功能丧失。
而骨性关节炎 (OA) 其基本病理改变为多种致病因素引起的进行性关节软骨变性，破坏及丧失，关节软骨及软骨下骨边缘骨赘形成，由此引起一系列的关节症状和体征。
有研究者对滑膜细胞进行原代培养，应用流式细胞仪鉴定滑膜细胞类型，提取蛋白进行双向电泳分离，比较 RA 与 OA 成纤维样滑膜细胞(Fibroblast-Like Syno-viocytes ， FLS) 蛋白酪氨酸磷酸化状态的差异，结果显示： RAFLS 蛋白酪氨酸磷酸化较 OAFLS 明显增多，其中以相对分子质量 42 × 10 3 ~95 × 10 3 间蛋白酪氨酸磷酸化位点居多，对其结果进行灰度扫描， RAFLS 灰度扫描值为 4227672 ± 8947 ，OAFLS 为 663480 ± 7962 ， RAFLS 的灰度扫描值约为 OAFLS 的 6.5倍，两者具有非常显著性差异 (T= 2.820 ， P<0.01) 。
1980 年 Hunter 首先发现酪氨酸激酶 (PTK) ，许多生长因子受体都具有 PTK 活性，一半以上的癌基因产物也具有 PTK 活性，他发现酪氨酸磷酸化比例虽小，但却与细胞生长、增殖关系密切，很可能是正常细胞与肿瘤细胞相互转化的关键，癌基因活化后， PTK 活性大大增加。
1992 年，Williams 等研究发现， RA 滑膜细胞中的 PTK 活性远远高于 OA ，这可能是导致 RA 滑膜细胞转化特性而呈持续活化状态的关键，作者推测RAFLS 可能存在原癌基因的活化或突变，或多种生长因子受体的持续激活，从而导致转化细胞的外观表现并伴有 PTK 活性的增高。
第八课双向凝胶电泳
二维SDS-PAGE
• 同普通SDS-PAGE类似。 • 但一般在垂直电泳系统中无需浓缩胶， 因为在IPG胶条中蛋白质区域已得到浓 缩，可以认为非限制性IEF胶（低浓度丙 烯酰胺胶）充当了浓缩胶。
2D Gel-Based Proteomics
聚丙烯酰胺凝胶的蛋白质的检测
• • • • • • • 理想显色剂的7S 安全（safety）： 灵敏（sensitivity）： 简单（simplicity）： 特异性（specificity）： 快速（speed）： 稳定（stability）： 兼容性（synergy）：
双向电泳分析中的样品制备
制备原则：
• 应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括 多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。 • 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。 • 防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰 （如酶性或化学性降解等）。 • 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 • 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证 待研究蛋白的可检测性。
特殊样品的制备
低丰度蛋白的分离：尽管增加上样 量和提高总蛋白的溶解度能增加分离时 的低丰度蛋白的量，但同时增加了高丰 度蛋白的负荷，且造成蛋白的叠加效应 而影响分离。现常用预分级＋窄pH胶的 微制备技术进行分离：即将总蛋白组分 成蛋白质组亚群，再用pH梯度小于2个 pH单位的IPG胶进行窄pH范围的分离。
不同样品的基本处理方法
可溶性样品 固体组织样品
细胞
样品的分级处理 通过采用亚细胞分级、液相电泳和选择性沉淀等方法 对蛋白质样品进行分级处理，可降低样品的复杂性并 富集低丰度蛋白质。当前最简单有效的处理是采用分 级抽提，按样品溶解度不同进行分离。
样品的溶解
第五章双向凝胶电泳(2D-PAGE)
转印至膜上的蛋白
2. 双向电泳技术的发展及原理
双向凝胶电泳的发展 双向凝胶电泳的基本原理
双向凝胶电泳的发展
双向凝胶电泳的思路最早是由Smithies 和Poulik提出 (Smithies O, Poulik MD. Two-dimensional electrophoresis of serum proteins. Nature, 1956, 177: 1033)，蛋白质第一向电泳是根据其自由溶液迁移率 (free-solution mobility)， 在滤纸条上进行；第二向电泳方向与第一向垂直，在淀粉胶上进行。 随后，Raymond发明了聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Raymond S, Weintraub L. Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis. Science, 1959, 30:711)，双向电泳的支持介质逐渐转向聚丙烯酰胺凝胶 (Margolis J, Kenrick KG. Two-dimensional resolution of plasma proteins by combination of polyacrylamide disc and gradient gel electrophoresis. Nature, 1969, 221: 1056-1057)， 这即是双向凝胶电泳 (two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, 2D PAGE)。 同年，2D PAGE在原理上又有了新的发展，以第一向为蛋白质等电聚焦 的双向凝胶电泳技术建立起来，即IEF-PAGE (Dale G, Latner AL. Isoelectric focusing of serum proteins in acrylamide gels followed by electrophoresis. Clin Chim Acta, 1969, 24: 61-68；Macko V, Stegemann H. Mapping of potato proteins by combined elctrofocusing and electrophoresis identification of varieties. Hoppe-seyler’s Z Physiol. Chem, 1969, 350: 917-919)。
蛋白检测篇6-双向凝胶电泳
编号：1-6主题：双向凝胶电泳概述：双向凝胶电泳技术结合了等电聚焦技术（根据蛋白质等电点进行分离）以及SDS －聚丙烯酰胺凝胶电泳技术（根据蛋白质的大小进行分离）。
这两项技术结合形成的二维电泳是分离分析蛋白质最有效的一种电泳手段。
目的：凝胶中蛋白的检测、图像采集和分析、蛋白鉴定、分离蛋白质组所有蛋白。
原理：1、根据蛋白质的等电点（第一向）和分子量（第二向）的不同进行分离。
蛋白质是两性分子，在不同的pH环境中可以带正电荷、负电荷或不带电荷。
对每个蛋白质来说都有一个特定的pH，此时蛋白质的静电荷为零，此pH值即该蛋白质的等电点(pI)。
将蛋白质样品加载至pH梯度介质上进行电泳时，它会向与其所带电荷相反的电极方向移动。
在移动过程中，蛋白分子可能获得或失去质子，并且随着移动的进行，该蛋白所带的电荷数和迁移速度下降。
当蛋白质迁移至其等电点pH位置时，其净电荷数为零，在电场中不再移动。
聚焦是一个与pH相关的平衡过程：蛋白质以不同的速率靠近并最终停留在它们各自的pI值；在等电聚焦过程中，蛋白质可以从各个方向移动到它的恒定位点。
双向电泳的第二向是将IPG胶条中经过第一向分离的蛋白转移到第二向SDS．PAGE凝胶上，根据蛋白相对分子质量或分子量(MW)大小与第一相垂直的分离。
蛋白质与十二烷基硫酸钠(SDS)结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，由于SDS是一种强阴离子去垢剂，所带的负电荷远远超过蛋白质分子原有的电荷量，能消除不同分子之间原有的电荷差异，从而使得凝胶中电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于蛋白质分子的质量大小，其迁移率与分子量的对数呈线性关系。
步骤：１.样品制备２.第一向分离等电聚焦３.第二向分离聚丙烯酰胺凝胶电泳３.修饰和加工，如用32P标记可以研究磷酸化蛋白的变化流程图：。
双向电泳的操作步骤
双向电泳的操作步骤一、第一向等电聚焦1、从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化上样缓冲液,置室温溶解。
2、从冰箱中取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条，室温中放置10分钟。
3、沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。
在槽两端各1cm 左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。
注意：不要产生气泡。
否则影响到胶条中蛋白质的分布。
4、当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后，用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层。
5、分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上，使得胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极。
确保胶条与电极紧密接触。
不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上，因为这些溶液不会被胶条吸收。
同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气泡。
如果已经产生气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶到胶条以外。
6、在每根胶条上覆盖2-3ml矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。
需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。
7、对好正、负极，盖上盖子。
设置等电聚焦程序。
8、聚焦结束的胶条。
立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳，否则将胶条置于样品水化盘中，-20℃冰箱保存。
二、第二向SDS-PAGE电泳1、配制10%的丙烯酰胺凝胶两块,从-20℃冰箱中取出的胶条，先于室温放置10分钟，使其溶解。
2、配制胶条平衡缓冲液I。
3、在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。
将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。
这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。
4、将胶条转移至溶涨盘中，每个槽一根胶条，在有胶条的槽中加入5ml胶条平衡缓冲液I。
将样品水化盘放在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。
5、配制胶条平衡缓冲液II。
6、第一次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液I。
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双向凝胶电泳是将不同种类的蛋白质按照等电点和分子量差异进行高分辨率分离的分析方法。
成功的二维电泳可以将2000到3000种蛋白质进行分离，是目前唯一的同时能分离成百上千种蛋白质的工具。
通过对蛋白质双向电泳的图谱扫描，用相关软件（PDQUEST等）进行图谱差异分析，找到差别点。
然后把差别点切出，进行脱色、酶解。
最后样品进入质谱测试，得到质谱原始数据文件。
通过搜库可得到差别点蛋白质的详细信息。
原理：
1、根据蛋白质的等电点（第一向）和分子量（第二向）的不同进行分离。
2、电泳后根据蛋白质的上样量对胶进行考马斯亮兰染色、银染或荧光染色，然后用相关软件对电泳图象进行分析。
样品要求：
1、建议使用的蛋白质溶解体系为8M尿素/4%CHAPS/40mMTris（Base）/65mM DTT；
2、样品浓度大于2ug/ul；
由于蛋白质组学涉及的样品范围很广，对于具体样品的要求请和项目经理联系。
仪器：
1st dimension:第一项
IEF:IPG-PhorII(GE)and Protean IEF(BioRad) Bio-Rad Model111Mini IEF Cell
2nd dimension:第二项
GE Ruby SE600(16x16cm)
GE Ettan DALTsix(26x20cm)
BioRad Criterion pre-cast(13x9cm)
BioRad Protean(8.6x7cm)
2D凝胶图像识别软件
Image master2D Elite®
实例分析。