2010CB945100-卵巢早衰的分子机制及其生物标记的研究

项目名称：卵巢早衰的分子机制及其生物标记的研

究

首席科学家：徐璎南京大学

起止年限：2010年1月-2014年8月

依托部门：江苏省科技厅

一、研究内容

本项目组织了染色体分离阻断及卵泡形成、代谢衰老及神经内分泌与卵泡耗竭、生物节律与卵巢衰老3个基础研究团队和POF流行病学及临床诊疗研究团队，共四个课题组，对下列五个问题进行探讨：1）染色体分离异常导致卵泡储备不足的机制；2）代谢衰老及相关基因加速卵泡自主发育的机制；3）POF与时钟之间的分子机制的调控网络；4）神经内分泌与卵泡发育异常；5）卵巢早衰的易感基因筛选与临床干预。

1. 染色体分离异常导致卵泡储备不足的机制

卵细胞来源于原始生殖细胞。卵细胞的形成是一个漫长的过程，出生前原始生殖细胞先进行有丝分裂快速扩增，之后进入减数分裂并停滞在减数分裂I的前期。性成熟后，激素水平增高，刺激排卵，重新启动减数分裂过程并停滞在减数分裂II的中期，受精后减数分裂才得以完成。染色体的精确分离是保持基因组完整，从而形成健康的卵细胞的关键。姊妹染色体的异常分离造成基因组不稳定，产生异倍体等，从而引起卵细胞的缺陷，或卵泡形成数量的不足。此前，我们已经建立了几个染色体分离异常和调控染色体分离的有丝分裂检测点异常的基因工程小鼠，如Seperase和Securin基因敲除小鼠，并观察到生殖异常。在此基础上，我们将进行以下三个相互关联层面的研究：

** 染色体分离相关基因与卵泡发育和卵巢早衰的相关机制

** 进一步分析Seperase和Securin对卵细胞和颗粒细胞染色体分裂异常及其与生殖干细胞有丝分裂，卵细胞减数分裂异常相关的卵泡形成减少或卵泡耗竭过早的分子机制。此前，我们已经建立了相关基因敲除小鼠；

1.1.2 建立CDC20突变小鼠模型，研究染色体分离调控机制对卵泡发育和卵巢衰退的影响及其机制。此前，CDC20被发现与APC形成复合物，参与有丝分裂过程。在果蝇中CDC20蛋白家族成员还被发现为完成卵母细胞减数分裂所必需。因此，建立CDC20卵巢敲除小鼠，检验CDC20在卵泡发育和卵巢衰退中的作用十分必要。

在以上两项研究中，特别注重对小鼠胚胎卵巢进行研究。

** 时钟基因和寿命相关基因对卵细胞染色体分离的影响

此前我们发现，Per2、CKle等时钟基因敲除小鼠表现出生殖缺陷。我们猜想，其它关键时钟基因如Per1、Reverb、Clock、Bmal1等也可能参与卵巢生殖功能。我们将利用我们实验室已有的Per1、Per2、Reverb、Clock、Bmal1和CKle等基因敲除小鼠模型，首先确定这些基因是否参与卵巢生殖。如果结果肯定，我们将研究这些时钟基因对卵细胞染色体分离过程的影响，及其在卵泡缺失和卵巢早衰中的作用。同理，我们将对影响寿命的p53进行相应的

研究。

** 已知染色体分离相关基因的临床筛查及新相关候选基因的小鼠模型验证**临床上验证引起生殖异常的已知染色体分离相关基因与卵泡缺失综合症和/或卵巢早衰的相关性；即在卵泡缺失综合症和卵巢早衰临床病人标本中寻找已知染色体分离相关基因与这些疾病的连锁性。

**根据筛查出的新染色体分离相关基因，利用基因敲除和高表达小鼠模型，明确其在卵泡发生和卵巢早衰中的作用及其机制。

2. 代谢衰老及相关基因加速卵泡耗竭的机制

卵泡自主发育或迟滞的内在机制与代谢调控有着密切的关系。在生物进化中，当能量供应（食物）不足时，生物为了保存个体，以及为它的子代寻找合适的生存条件，往往推迟生殖细胞的成熟；而当能量供应丰富时，则加速生殖细胞的成熟。在实验小鼠中，限食可明显引起卵泡自主发育迟滞（Merry and Holehan 1979）。而在限食诱导的代谢相关基因FOXO3a卵巢敲除小鼠中，卵泡自主发育过激，卵泡提前耗竭（Castrillon, et al. 2003）；这一发现已在人体研究中得到证实。我们在前期工作中发现，代谢关键基因STAT3（Gao, et al. 2004; 2007）卵巢敲除小鼠存在严重的生殖障碍。事实上，STAT3在卵泡发育早期（始基和窦前卵泡）强烈表达，其后突然消失，提示STAT3可能在限制卵泡自主发育中起着关键作用。本课题将在确定限食对卵巢生殖功能及卵泡自主发育的影响的基础上，进行以下研究：

**确定STAT3卵巢敲除对卵巢生殖功能及卵泡自主发育的影响

STA T3作为代谢关键基因，参与体内糖、脂代谢平衡的核心过程（Gao, et al. 2004; 2007）。我们此前发现，STAT3卵巢敲除小鼠并表现出明显的生殖障碍。我们将延续此项研究，并对STA T3卵巢敲除引起的卵巢，特别是胚胎卵巢病理学变化，进行深入的研究，确定STA T3卵巢敲除对卵巢生殖功能及卵泡自主发育的影响；

** 确定FOXO3a与STAT3在卵泡自主发育和耗竭过程中的相互拮抗作用

代谢相关基因FOXO3a卵巢敲除导致卵泡自主发育过激，卵泡早耗（Castrillon, et al. 2003）；相反，FOXO3a在卵巢中高表达，则抑制卵泡自主发育（Liu, et al. 2007）。此前，我们及其他研究发现FOXO3a与STAT3在代谢平衡过程中，相互拮抗（Nie, et al. 2009）。我们将在本研究中，测试FOXO3a与STA T3在卵泡自主发育和耗竭过程中的相互（拮抗）作用机制，以期揭示STAT3卵巢敲除对卵巢生殖功能及卵泡自主发育的分子机制；

** 确定p300、Sirt1对FOXO3a及STAT3的调控及其对卵泡自主发育的影响

长寿蛋白Sirt1因应低能摄入，通过蛋白去乙酰化，调节FOXO3a和STA T3功能，是细胞营养感受信号通路的关键调控基因（Nie, et al. 2009）。P300则乙酰化FOXO3a及STAT3，对

抗Sirt1功能。如果代谢果然调控卵泡自主激活与衰竭过程，Sirt1可能正是这一卵巢内在机制的开关。联系Sirt1与卵泡自主发育，将开启这一研究领域的新途径；一旦发现Sirt1参与卵泡自主发育的调控，可以尝试Sirt1的激动剂治疗卵巢早衰。

**确定促性腺激素对卵巢FOXO3a及STAT3的表达及功能的调控作用

最后，我们将研究生殖激素是否通过对卵巢FOXO3a及STAT3的表达及功能调控来实现其对卵泡自主发育的影响。

3. 生物节律及机体衰老和卵巢功能衰退之间的相互影响及其机制

现代生活方式和生存环境的激变直接影响正常生物节律，引起包括衰老及生殖障碍等。此前，我们发现时钟基因敲除小鼠，如Per2、CKle等敲除小鼠，表现出明显的生物节律紊乱和卵巢功能早衰。考虑到时钟基因敲除也引起一般衰老进程加速，研究衰老本身对生物节律及生殖障碍的影响，变得十分有意义。到目前为止，我们已经建立和收集了10多个生物钟紊乱遗传工程小鼠以及卵巢功能衰退模型。利用这些关键材料，我们将进一步研究：

3．1.与课题一联合构建中国最大的卵巢早衰模式动物平台

在本课题中主要建立与生物节律、神经内分泌和衰老密切相关加速卵巢早衰的模式动物。

3．1.1 建立自主知识产权的小鼠模型

此前，我们发现时钟基因敲除小鼠，如Per2、CKle等敲除小鼠，表现出明显的生物节律紊乱和卵巢功能早衰。我们已经建立和收集了10多个生物钟紊乱遗传工程小鼠，将进一步定义这些生物钟紊乱小鼠在卵巢早衰中的意义。同时我们最新发现的调节生物钟速度的位于X染色体的一个新基因MAGED1在生殖功能中也具有严重的生殖障碍。因此我们将通过分析已有的资料，系统性建立一批卵巢早衰的基因敲除小鼠。

3．1.2 我们将利用模式动物所优势，结合国际基因敲除小鼠计划的进行，引进一批对卵巢早衰研究有价值的小鼠模型。

3．2.筛选与卵巢早衰、机体衰老密切相关的基因

3．2.1 我们将利用果蝇筛选同时具有生殖功能障碍又有生物钟紊乱，衰老表型的相关基因。

3．2.2 我们将通过各种模式动物比对，分析影响卵巢发育的关键基因，建立模型验证。