癌症相关microRNA的荧光生物传感及活细胞成像方法研究

癌症相关microRNA的荧光生物传感及活细胞成像方法研究

MicroRNAs(miRNAs)是一类存在于真核细胞内的非编码RNA分子,由18~24

个核苷酸组成。miRNAs通过降解目标mRNA或抑制其转录后翻译调控基因表达。

miRNAs可以调控多种生物过程,例如早期发育、免疫反应、造血、细胞增殖、分化和凋亡等。此外,越来越多的研究表明,miRNAs的异常表达与癌症的发生和发展密切相关,已被用作重要的癌症诊断标志物和治疗靶点。

因此,miRNAs的特异和灵敏检测对于癌症的诊断和治疗具有重要意义。miRNA具有一些特有性质,例如尺寸短、表达水平低、同源之间序列相似、易被酶降解等。

针对这些特性,研究者构建了一些基于核酸扩增策略的miRNA检测方法。虽然这些方法在一定程度上提高了 miRNA检测的灵敏度和特异性,然而miRNA的检测仍然存在一些不足和挑战:1)现有的miRNA识别模式只能在有限的功能区域内发挥识别作用,不能完全区别碱基错配位置分布在各种区域的同源性miRNA;2)

蛋白酶介导的信号扩增策略用于细胞内miRNA的检测时,蛋白酶的入胞需要将细胞固定化,容易造成细胞受损或死亡,无法满足活细胞中miRNA检测的需要;3)目前miRNA的检测多为单重检测,miRNA的多重检测对于癌症的准确诊断和治疗更具有指导意义;4)如何以miRNA作为逻辑输入构建逻辑平台实现癌症风险评估和不同表型癌细胞的鉴别?本论文针对已有的不足和挑战,设计了四种实验方案用于miRNA的生物传感检测和活细胞成像研究。

本文分为以下六章:第一章为绪论部分,主要概述了 miRNA的特征、作用机理、生物学意义和已有的检测方法,并总结了已有检测方法存在的不足。第二章,构建了一种分裂式识别模式结合级联信号扩增策略用于miRNA的高特异和灵敏

检测。

设计两种识别探针,包括具有粘性末端的发夹探针(HP)和辅助探针(AP)。首先,HP的粘性末端和AP同时识别miRNA的一部分,HP通过粘性末端介导的链置换反应打开,形成稳定的DNAY型结构。

接下来,DNA Y型结构中的AP可以进一步作为引物触发链置换扩增(SDA)反应,产生大量的trigger序列。最后,trigger序列与设计为具有G四倍体互补序列和Nt.BbvCI内切酶切刻位点的锁式DNA杂交,启动循环滚环扩增(RCA)反应,产生大量G四倍体序列。

G四倍体序列能够结合N-甲基-卟啉IX(NMM),生成用于miRNA检测的增强的荧光信号。本策略中,miRNA的识别序列被分裂在两种不同的识别探针中。

无论碱基错配位点位于何种位置,粘性末端介导的链置换反应的速率变化和直接杂交反应热力学能量变化的协同作用,使得DNA Y型结构无法稳定形成。该识别模式的双重识别效应保证了本策略良好的特异性。

由于级联信号扩增反应高的扩增效率,本策略能够灵敏检测let-7b,检测限为3.2 pM。而且,本策略还对HeLa细胞裂解液中let-7b的含量进行了测定。

这些实验结果表明,本工作为临床诊断和疾病治疗中miRNA的检测提供了一种有潜力的策略。第三章,基于DNAzyme驱动的三维DNA walker和杂交链式反应(HCR)级联信号扩增,构建了一种无酶免标记的荧光生物传感器用于miRNA的检测。

首先walking probe与 locking DNA杂交,使walking probe 中的DNAzyme 功能区域被封住,形成被锁住的walking probe(BWPs)。然后,将BWPs和发夹DNA 底物(HDSs)修饰在磁球的表面。

当miRNA存在时,miRNA与locking DNA杂交,使得locking DNA通过粘性末端介导的链置换的方式从BWPs上释放下来,暴露出DNAzyme的功能区域。然后,walking probe沿着三维的轨道运动,切割HDSs,产生大量的触发链。

最后,触发链启动随后的HCR过程,产生大量完整的G四倍体序列。G四倍体序列能够结合NMM,产生用于miRNA检测的增强的荧光信号。

与蛋白酶驱动的三维DNA walker相比,DNAzyme驱动的DNA walker更加简单和稳定。所有的DNA组件都修饰在同一个磁球上,大大增加了探针的局部浓度和反应效率。

而且,磁球可以通过外加磁场分离出去,保证了较低的背景信号。三维DNA walker和HCR级联信号放大反应的高扩增效率确保了木策略良好的灵敏度,检测限为7.9 fM。

而且,本策略还对HeLa细胞裂解液中let-7a的含量进行了测定。以上结果表明本工作为miRNA的定量检测提供了一种有潜力的策略。

第四章,构建了一种pH响应型ZnO纳米探针介导的DNAzyme信号扩增策略用于多重miRNAs的灵敏检测和活细胞成像。设计核壳状的纳米探针,包括作为载体和辅因子提供者的ZnO纳米粒子(ZnO NPs)核和用于吸附功能性发夹DNAs的聚多巴胺壳。

在碱性条件下,多巴胺通过自聚过程沉积在ZnO NPs的表面上。功能性发夹DNAs通过π-π相互作用吸附在聚多巴胺壳上。

当ZnO纳米探针通过细胞内吞作用进入细胞后,细胞内的酸性环境会使ZnO NPs核降解,释放出功能性发夹DNAs和Zn2+。释放出的Zn2+可以作为辅因子催化DNAzyme切割扩增反应的进行,避免了额外的辅因子细胞递送过程。

识别发夹DNA包括目标物的识别序列和被锁住的DNAzyme区域。报告发夹DNA包括DNAzyme的底物部分和标记在末端的荧光团和猝灭剂。

识别发夹DNA识别miRNA后暴露出DNAzyme区域。暴露出的DNAzyme区域在Zn2+的存在下切割报告发夹DNA的底物部分,荧光团和猝灭剂相互远离,使荧光

恢复。

释放出的识别发夹DNA和miRNA的杂交双链继续循环切割报告发夹DNA,产

生增强的荧光信号用于灵敏检测miR-21和miR-373,检测限分别为54 pM和38 pM。本策略对三种细胞内miR-21的不同表达水平进行了区分,而且在同一种活细胞

内对miR-21和miR-373进行了同时成像。

以上结果表明,本策略在癌症准确诊断和治疗领域的miRNA多重分析中具有潜在应用。第五章,构建了基于MNAzyme切割扩增反应的DNA逻辑平台用于癌症风险评估和癌细胞鉴别。

MNAzyme是指分裂式的DNAzyme。在DNAzyme的催化中心处分裂后添加目标物的传感臂,形成两条独立的催化链Part A和Part B。

当miRNA不存在时,Part A和Part B独立存在,不能形成完整的催化中心,

无法切割底物链,保证了较低的背景信号。当miRNA存在时,Part A和Part B的目标物传感臂能够同时识别miRNA,形成完整的MNAzyme复合物。

该复合物绑定底物链,在Mrn2+的辅助下循环切割底物链,产生增强的荧光

信号用于癌症风险评估和癌细胞鉴别。将本策略用于癌细胞鉴别时,由于细胞内的金属离子不足以催化MNAzyme切割扩增反应的进行,MnO2纳米片被作为探针入胞的载体。

MnO2纳米片能够在细胞内谷胱甘肽(GSH)的作用下降解产生辅因子Mn2-,催