鸡肝过氧化氢酶的提取、分离和纯化

鸡肝过氧化氢酶的提取、分离和纯化

孙文刚

云南民族大学化学与生物技术学院云南昆明

摘要：新鲜鸡肝经匀浆、磷酸缓冲溶液抽提、硫酸铵分级沉淀、DEAE Sepharose离子交换层析、Sepharcy1 S -200凝胶过滤层析、得到鸡肝过氧化氢酶电泳纯制品。回收率为18.23%，比活达4780.38U/mg，纯化倍数为66.15，最适温度为40℃，最适PH为7.0。该酶在20～40℃，PH 5～8内稳定。经凝胶过滤和SDS-PAGE测得该酶的全分子量为250KD,亚基分子量为62.5KD。

关键词：家鸡；肝脏；过氧化氢酶；分离纯化；性质

Chicken liver Catalase of Extraction, Separation and Purification

Wengang Sun

Yunnan Minzu University

Abstract: A catalase was purified from Anas Chicken homogenation ,n-butanol disposal, ammo-nium sulfate precipitation, ion-exchange chromatography on DEAE-Sepharose Fast Flow column and gelfiltration chromatography on Sephacryl S-200.The purity of the purified catalase was confirmed by thepresence of a single band on SDS-PAGE.18.23% of the catalase activity was recovered. The specific activ-ity was 4 780.38 U/mg. The optimum pH and optimum temperature were 7.0 and 40℃ ,respectively. The catalase appeared to be stable at 20～40℃and pH 5～8,and it was 66.15-fold purified. Sephacryl S-200 chromatography and SDS-PAGE showed that the molecular weight of this catalase was 250 KD and itssubunit was about 62.5 KD.

Key words: Anas Chicken; liver; catalase; purification; property

引言

过氧化氢酶(Catalase,EC1.11.1.6，简称CAT)是一类广泛存在于动物、植物和微生物体内的末端氧化酶，酶分子结构中含有铁卟啉环,1个酶蛋白分子中含有4个铁原子[1]。过氧化氢酶是在生物演化过程中建立起来的生物防御系统的关键酶之一[2]，催化细胞内过氧化氢的分解。过氧化氢酶已成为农业及相关食品业、乳制品业、造纸业以及农业环保业中有价值的酶之一。CAT主要以与细胞器，如线粒体、过氧化物酶体结合的形式存在,而在红细胞中则以可溶状态存在。

过氧化氢酶几乎普遍存在于所有能呼吸的生物体内，在哺乳动物的肝与红细胞中含量较高，国内外学者多从动物肝中提取[1,3-6],也有从血液、胎盘、贻贝、

苹果以及微生物中提取的研究[7-13]。但从鸡肝中分离纯化过氧化氢酶的研究未见报道。为此，本文尝试从鸡肝中分离纯化过氧化氢酶并研究其相关的酶学特性。

1. 材料与方法

1.1 实验材料

家鸡肝脏取自健康活鸡,杀死后立即取肝脏于冰箱中冰冻保存备用[14]。

1.2 实验仪器

紫外分光光度计、冷冻离心机、超声波破碎仪、可见分光光度计、离子交换柱、SDS-PAGE电泳装置、冰箱、酶标仪等。

1．3实验试剂

Tris试剂、甘油、KCl、HCl、硫酸铵、牛血清蛋白、磷酸缓冲液、考马斯亮蓝G-250、95﹪乙醇、钼酸铵、过氧化氢、30%丙烯酰胺凝胶贮存液、SDS 聚丙烯酰胺等。

2．实验方法

2.1 粗酶液的制备

称取新鲜鸡肝100g,用自来水洗净，再用消毒双蒸水漂洗干净。按1∶5(M∶V)的比例加入预冷的0.05mol/L的磷酸缓冲液(pH7.2),用高速组织捣碎机捣碎,置于4℃冰箱抽提2h；离心(6000r/min,4℃,30min),收集上清液；加入硫酸铵至40%饱和度，离心(6000r/min,4℃,30min)去沉淀,上清中再加硫酸铵至60%饱和度，离心收集沉淀；将沉淀重溶于0.05 mol/L的磷酸缓冲液(pH 7.2)中,4℃透析夜，然后按1∶1(V∶V)的比例向透析液中加入预冷的正丁醇进行脱脂,4℃静置过夜.然后6000r/min离心,弃去沉淀以及正丁醇层,重复2次,得粗酶液。

2.2 DEAE-Sepharose离子交换层析

DEAE-Sepharose离子交换层析柱为通用安玛西亚公司生产的DEAE Sepharose Fast Flow 5mL预装柱,用磷酸缓冲液(0.05mol/L,pH7.2)平衡至少4倍柱体积(20mL),上样5mL。用0～1mol/L NaCl溶液(含0.05 mol/L,pH7.2的磷酸缓冲液)进行梯度洗脱,流速30mL/h,每管收集5mL,紫外监测波长为280nm;测定各管过氧化氢酶活性和蛋白含量;收集活性较高的各管酶液,4℃透析过夜,冷冻干燥后进行凝胶过滤。

2.3 SephacrylS-200凝胶过滤柱层析

SephacrylS-200凝胶柱按产品说明书要求处理,装柱(16mm×835mm)后,用磷酸缓冲液(0.05mol/L,pH7.2)冲洗一定体积,上样2mL。用磷酸缓冲液(0.05