[7] 结构生物学实验技术原理
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残留的结晶母液 X-rays
密封的薄壁玻璃毛细管
生物大分子X射线衍射数据收集
• 液氮低温冷冻
– 使用相对不便，成本偏高。但是，由于无玻璃 毛细管使得吸收效应大大减少，而且晶体的低 温冷冻状态使其耐辐射能力大大增加，有可能 加大曝光时间并收集尽可能多的衍射画面
液氮气流维持冷冻状态
X-rays
晶体结构解析方法
溶液结构的计算
• 初始结构的生成 • NOE 信号归属 • 结构计算 • 结构精修
NMR解谱过程
• 标记杂质峰 • 根据积分曲线计算各组峰的相应质子数 • 根据峰的化学位移确定它们的归属 • 根据峰的形状和偶合常数确定基团之间的互相关系 • 采用重水交换的方法识别活泼氢 • 综合各种分析，推断分子结构并对结论进行核对
核磁共振谱的化学位移归属
• 化学位移的归属是通过对一系列核磁共振谱图的 解析来获得的，分为主链和侧链化学位移归属两 个部分
– 主链化学位移归属是指获得蛋白质肽链骨架上各原子( 包括15N , 1HN , 13CO , 13Cα和1Hα) 的化学位移 – 侧链化学位移归属的目的在于获得各个氨基酸残基侧 链‐R基团上能够产生核磁共振信号的原子的化学位移值
§11-4 小角散射
• 当X射线照射到试样上时，如果试样内部存在纳米 尺度的电子密度不均匀区，则会在入射光束周围 的小角度范围内（一般 0‐4°）出现散射 X 射线， 这种现象称为X射线小角散射或小角X射线散射
§11-4 小角散射
• 获得低分辨率生物大分子结构 • 蛋白质折叠和构象变化等动态学方面的研究
三种常规蛋白质解析方法的主要缺点是什么
核磁共振谱的化学位移归属
• 同种核由于在分子中的化学环境不同而在不同共 振磁感应强度下显示吸收峰，这称为化学位移（ chemical shift）
– 根据前面讨论的基本原理，在某一照射频率下，只能 在某一磁感应强度下发生核磁共振 – 但实验证明：当 1H 在分子中所处化学环境（化学环境 是指1H的核外电子以及与1H邻近的其它原子核的核外电 子的运动情况）不同时，即使在相同照射频率下，也 将在不同的共振磁场下显示吸收峰
二维核磁共振对蛋白质进行动力学研究
• 核磁共振的弛豫过程(即原子核由激发态向平衡态 回复的过程)与分子的微观运动相关联 • 核磁共振信号的弛豫参数包含了蛋白质分子运动 的信息，可以作为探针来获得蛋白质分子的动力 学特性 • 用于蛋白质动力学研究的宏观可测弛豫参数
– 纵向弛豫速率R1 – 横向弛豫速率R2 – 异核稳态NOE效应
– 小角X‐ 射线散射(small angle X‐ray scattering, SAXS) – 小角中子散射(small angle neutron scattering, SANS)
§11-4 小角散射
• SAXS 谱图能直接提供的参数只能给出粒子结构的 一些有限信息
• • • • 分子质量(MM) 回转半径(Rg) 水化体积(V) 最大直径(Dmax)
实现核磁共振的两种方法
• 共振条件： = 0 = 0
– a．扫场法: 改变0 – b．扫频法: 改变
溶液多维核磁共振特点
• 在溶液状态下，即更加接近生理环境(pH、盐浓度 、温度 , 等等)的状态下，对蛋白质三维结构进行 研究 • 液相核磁共振技术已经突破25 k的分子量限制 • 液相核磁共振技术通过原子核弛豫过程可以在原 子水平对蛋白质多位点的动力学特性进行研究
电镜样品百度文库速冷冻制备
• 通过快速冷冻的制样方法，能够使样品处在接近 于生理环境的玻璃态冰(vitrified ice)中，从而保持 其天然构像，克服了染色等过程对样品构象的影 响，使其结构更接近功能活性状态 • 但是冷冻电镜的图像对比度和信噪比很低，并且 样 品 的 朝 向 是 杂 乱 和 随 机 的 (increasing heterogeneity) ，需要复合大量单颗粒图像来提高 信噪比
X射线晶体衍射
• 晶体可被视为三维立体光栅 • 根据劳艾斑点的分布可算出晶 面间距，进而完成生物大分子 结构解析
生物大分子X射线晶体学技术特点
• 所能测定的生物大分子的分子量范围很宽 （可以从1kDa以下到400kDa甚至更大） • 技术成熟度比较高 • 应用成本比较低廉 • 缺点是必须预先制备出适合于X射线衍射的 单晶体
生物大分子X射线晶体学技术步骤
基因克隆表达 天然生物组织
蛋白质 样品
功能研究 晶体 结构模型
结构功能 关系分析
X射线
蛋白质 晶体
晶体 衍射谱
晶体 电子密度
生物大分子结晶方法
• 气相扩散法
• 种晶法
生物大分子X射线衍射数据收集
• 室温毛细管衍射数据收集
– 使用比较方便，成本较低。但是，由于封装晶 体的玻璃毛细管以及残留的结晶母液对X射线的 吸收，使得衍射强度的测量误差较大
化学位移
~2.1 H3C C
~3.0 H 3C N
H
O
~1.8 H 3C C C
~3.7 H 3C O
H C
~0.9 H 3C C
O C OH
H C O
C
15 14 13 12 11 10 9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
化学位移 δ(ppm)
核磁共振谱的化学位移归属
• 由于局部化学环境的差别，蛋白质分子中每一个 原子核都具有独特的化学位移 • 核磁共振谱图解析的第一步就是要获得蛋白质分 子中能产生核磁共振信号的各个原子的化学位移 值，这称为化学位移的归属(或指认)
– 因而不适合研究不均一或者分子量较小的样品
单颗粒样品玻璃态快速冷冻
电镜样品冷冻-负染制备
• 结合负染和冷冻样品制备的优点，冷冻‐负染制备 方法可以使样品处于生理状态的环境，并且具有 负染的对比度
– 已经成功地应用于解析RNA聚合酶Ⅱ、TFIIE及RNA聚合 酶Ⅰ和GroEL的结构 – 适用性较低，成功例子不多
• 小角散射 • X‐射线吸收精细结构
§11-1 X射线晶体衍射
• X 射线晶体学是一门利用 X 射线来研究晶体 中原子排列的学科
– 更准确地说，利用电子对X射线的散射作用，X 射线晶体学可以获得晶体中电子密度的分布情 况，再从中分析获得原子的位置信息，即晶体 结构 – 衍射→散射→电子密度→原子位置信息
蛋白质动力学
• 蛋白质分子在溶液中的运动包括了分子的整体运 动和内部运动，其中内部运动又可以分为在快速 时间尺度(皮秒)的运动以及慢时间尺度(毫秒)的构 象(或化学)交换
– 这些分子内部运动与蛋白质的生物功能密切相关 – 尤其是慢时间尺度的构象交换，它与许多重要的生物 过程，如酶催化、蛋白质折叠和蛋白 ‐蛋白相互作用等 ，发生在同一时间尺度内，和蛋白质的生物功能有着 非常紧密的联系
• 现在可以根据SAXS 数据从头计算(ab initio)蛋白质 的低分辨率三维结构
• 对于大的蛋白质或蛋白质复合物，当蛋白质各结构域或亚基的 结构已知时， SAXS 的最大用处就在于用刚体建模 (rigid body modeling)的方式来构建蛋白质或蛋白质复合物的整体结构
李旭部分第六次作业
GroEL的近原子分辨率电镜结构
非常少的样品用量
10 μg / ml
接近“天然状态”的样品溶液构象
单颗粒的归属分拣
初步的负染结果
三维重构结果
Cryo-EM的分辨率与适用范围
30Å 10Å 5Å 3Å 晶体结构
Size Shape Subunit
Size Shape Subunit
Backbone Trace
• 分子置换法
• 同晶置换法
• 反常散射法
§11-2 溶液多维核磁共振
核磁共振原理
• 核磁共振
– 原子核在外磁场中吸收特定频率电磁波的现象 称为核磁共振 – 核磁共振是磁矩不为零的原子核，在外磁场作 用下自旋能级发生塞曼分裂，共振吸收某一定 频率的射频辐射的物理过程
核磁共振原理
• 半数以上的原子核具有自旋，旋转时产生一小磁 场。当加一外磁场，这些原子核的能级将分裂， 既塞曼效应 – 在外磁场B0中塞曼分裂图：
二维核磁谱
结构约束的获得
• 常用于蛋白质溶液结构计算的结构约束主 要包括: NOE，二面角，氢键，以及残余偶 极耦合(Residual Dipolar Couplings , RDC) ,
– NOE 效应是指两个空间距离相近的原子通过空 间进行磁矩传递，该效应的强度与距离的6 次 方成反比 – 角度约束最常用的是主链肽键的二面角φ和ψ – 氢键的约束传统上依靠蛋白质在重水中主链酰 胺基的氢‐氘交换实验，同时结合观察到的NOE 交叉峰以及初步的二级结构信息获得
第七节 结构生物学技术概论
授课教师：李旭 授课时间：2014年10月31日
定义
• 结构生物学：
– 以生物大分子的特定空间结构及结构的特定运 动与其生物学功能的关系为基础，阐明生命现 象的学科
• 研究生物大分子的功能和结构 • 阐明生物大分子间的相互作用机制
结构生物学主要技术方法
• X射线晶体衍射 • 溶液多维核磁共振 • 低温电子显微镜三维电子衍射图象重构 • 其他方法
X射线晶体衍射
• X射线的波长范围(0.01‐100Å)与成键原子之间的距 离 (1‐2Å附近 ) 可比，因此 X 射线可用于研究各类分 子的结构 • 因为没有X射线透镜可以聚焦 X射线，到目前为止 还不能用X射线对单个的分子成像 • X射线对晶体中数量巨大的相位相同分子的衍射叠 加在一起能够产生足以被探测的信号
§11-3 低温电镜三维重构
• 三维冷冻电镜技术主要是将样品保存在液 氮或液氦温度下利用透射电子显微镜进行 二维成像，再经过对二维投影图像的分析 进行三维重构
– 将样品通过快速液氮冷冻“冻”在玻璃态冰中
电镜样品负染制备
• 负染(negative staining)条件下，样品通常包埋在重 金属盐中，图像具有很高的对比度，而且样品在 炭膜上大都有特定的朝向 • 结合图像分类技术，该方法可以用于研究非常不 均一或者分子量较小的样品 • 然而染色过程不可避免地会引起样品的变形，并 且有染色不均匀的缺陷，所以负染样品的精度通 常不超过20 Å
同位素标记蛋白样品的制备
• 生物大分子核磁共振的主要实验对象是自旋为1/2 的原子核，如1H，13C，15N 和31P
– 对于分子量较小的短肽和分子量小于10k的蛋白质，可 以使用未标记的样品通过采集二维氢谱进行化学位移 归属和结构解析 – 而对于分子量大于 10k 而小于 25k 的蛋白质，由于氢谱 的谱峰重叠比较严重，需要使用13C和15N标记的样品， 采集一系列的1H，13C，15N三共振谱图进行化学位移归 属和结构解析 – 对于分子量更大的蛋白质，则需要使用D2O配制的培养 基获得氘代的蛋白样品进行核磁共振实验
密封的薄壁玻璃毛细管
生物大分子X射线衍射数据收集
• 液氮低温冷冻
– 使用相对不便，成本偏高。但是，由于无玻璃 毛细管使得吸收效应大大减少，而且晶体的低 温冷冻状态使其耐辐射能力大大增加，有可能 加大曝光时间并收集尽可能多的衍射画面
液氮气流维持冷冻状态
X-rays
晶体结构解析方法
溶液结构的计算
• 初始结构的生成 • NOE 信号归属 • 结构计算 • 结构精修
NMR解谱过程
• 标记杂质峰 • 根据积分曲线计算各组峰的相应质子数 • 根据峰的化学位移确定它们的归属 • 根据峰的形状和偶合常数确定基团之间的互相关系 • 采用重水交换的方法识别活泼氢 • 综合各种分析，推断分子结构并对结论进行核对
核磁共振谱的化学位移归属
• 化学位移的归属是通过对一系列核磁共振谱图的 解析来获得的，分为主链和侧链化学位移归属两 个部分
– 主链化学位移归属是指获得蛋白质肽链骨架上各原子( 包括15N , 1HN , 13CO , 13Cα和1Hα) 的化学位移 – 侧链化学位移归属的目的在于获得各个氨基酸残基侧 链‐R基团上能够产生核磁共振信号的原子的化学位移值
§11-4 小角散射
• 当X射线照射到试样上时，如果试样内部存在纳米 尺度的电子密度不均匀区，则会在入射光束周围 的小角度范围内（一般 0‐4°）出现散射 X 射线， 这种现象称为X射线小角散射或小角X射线散射
§11-4 小角散射
• 获得低分辨率生物大分子结构 • 蛋白质折叠和构象变化等动态学方面的研究
三种常规蛋白质解析方法的主要缺点是什么
核磁共振谱的化学位移归属
• 同种核由于在分子中的化学环境不同而在不同共 振磁感应强度下显示吸收峰，这称为化学位移（ chemical shift）
– 根据前面讨论的基本原理，在某一照射频率下，只能 在某一磁感应强度下发生核磁共振 – 但实验证明：当 1H 在分子中所处化学环境（化学环境 是指1H的核外电子以及与1H邻近的其它原子核的核外电 子的运动情况）不同时，即使在相同照射频率下，也 将在不同的共振磁场下显示吸收峰
二维核磁共振对蛋白质进行动力学研究
• 核磁共振的弛豫过程(即原子核由激发态向平衡态 回复的过程)与分子的微观运动相关联 • 核磁共振信号的弛豫参数包含了蛋白质分子运动 的信息，可以作为探针来获得蛋白质分子的动力 学特性 • 用于蛋白质动力学研究的宏观可测弛豫参数
– 纵向弛豫速率R1 – 横向弛豫速率R2 – 异核稳态NOE效应
– 小角X‐ 射线散射(small angle X‐ray scattering, SAXS) – 小角中子散射(small angle neutron scattering, SANS)
§11-4 小角散射
• SAXS 谱图能直接提供的参数只能给出粒子结构的 一些有限信息
• • • • 分子质量(MM) 回转半径(Rg) 水化体积(V) 最大直径(Dmax)
实现核磁共振的两种方法
• 共振条件： = 0 = 0
– a．扫场法: 改变0 – b．扫频法: 改变
溶液多维核磁共振特点
• 在溶液状态下，即更加接近生理环境(pH、盐浓度 、温度 , 等等)的状态下，对蛋白质三维结构进行 研究 • 液相核磁共振技术已经突破25 k的分子量限制 • 液相核磁共振技术通过原子核弛豫过程可以在原 子水平对蛋白质多位点的动力学特性进行研究
电镜样品百度文库速冷冻制备
• 通过快速冷冻的制样方法，能够使样品处在接近 于生理环境的玻璃态冰(vitrified ice)中，从而保持 其天然构像，克服了染色等过程对样品构象的影 响，使其结构更接近功能活性状态 • 但是冷冻电镜的图像对比度和信噪比很低，并且 样 品 的 朝 向 是 杂 乱 和 随 机 的 (increasing heterogeneity) ，需要复合大量单颗粒图像来提高 信噪比
X射线晶体衍射
• 晶体可被视为三维立体光栅 • 根据劳艾斑点的分布可算出晶 面间距，进而完成生物大分子 结构解析
生物大分子X射线晶体学技术特点
• 所能测定的生物大分子的分子量范围很宽 （可以从1kDa以下到400kDa甚至更大） • 技术成熟度比较高 • 应用成本比较低廉 • 缺点是必须预先制备出适合于X射线衍射的 单晶体
生物大分子X射线晶体学技术步骤
基因克隆表达 天然生物组织
蛋白质 样品
功能研究 晶体 结构模型
结构功能 关系分析
X射线
蛋白质 晶体
晶体 衍射谱
晶体 电子密度
生物大分子结晶方法
• 气相扩散法
• 种晶法
生物大分子X射线衍射数据收集
• 室温毛细管衍射数据收集
– 使用比较方便，成本较低。但是，由于封装晶 体的玻璃毛细管以及残留的结晶母液对X射线的 吸收，使得衍射强度的测量误差较大
化学位移
~2.1 H3C C
~3.0 H 3C N
H
O
~1.8 H 3C C C
~3.7 H 3C O
H C
~0.9 H 3C C
O C OH
H C O
C
15 14 13 12 11 10 9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
化学位移 δ(ppm)
核磁共振谱的化学位移归属
• 由于局部化学环境的差别，蛋白质分子中每一个 原子核都具有独特的化学位移 • 核磁共振谱图解析的第一步就是要获得蛋白质分 子中能产生核磁共振信号的各个原子的化学位移 值，这称为化学位移的归属(或指认)
– 因而不适合研究不均一或者分子量较小的样品
单颗粒样品玻璃态快速冷冻
电镜样品冷冻-负染制备
• 结合负染和冷冻样品制备的优点，冷冻‐负染制备 方法可以使样品处于生理状态的环境，并且具有 负染的对比度
– 已经成功地应用于解析RNA聚合酶Ⅱ、TFIIE及RNA聚合 酶Ⅰ和GroEL的结构 – 适用性较低，成功例子不多
• 小角散射 • X‐射线吸收精细结构
§11-1 X射线晶体衍射
• X 射线晶体学是一门利用 X 射线来研究晶体 中原子排列的学科
– 更准确地说，利用电子对X射线的散射作用，X 射线晶体学可以获得晶体中电子密度的分布情 况，再从中分析获得原子的位置信息，即晶体 结构 – 衍射→散射→电子密度→原子位置信息
蛋白质动力学
• 蛋白质分子在溶液中的运动包括了分子的整体运 动和内部运动，其中内部运动又可以分为在快速 时间尺度(皮秒)的运动以及慢时间尺度(毫秒)的构 象(或化学)交换
– 这些分子内部运动与蛋白质的生物功能密切相关 – 尤其是慢时间尺度的构象交换，它与许多重要的生物 过程，如酶催化、蛋白质折叠和蛋白 ‐蛋白相互作用等 ，发生在同一时间尺度内，和蛋白质的生物功能有着 非常紧密的联系
• 现在可以根据SAXS 数据从头计算(ab initio)蛋白质 的低分辨率三维结构
• 对于大的蛋白质或蛋白质复合物，当蛋白质各结构域或亚基的 结构已知时， SAXS 的最大用处就在于用刚体建模 (rigid body modeling)的方式来构建蛋白质或蛋白质复合物的整体结构
李旭部分第六次作业
GroEL的近原子分辨率电镜结构
非常少的样品用量
10 μg / ml
接近“天然状态”的样品溶液构象
单颗粒的归属分拣
初步的负染结果
三维重构结果
Cryo-EM的分辨率与适用范围
30Å 10Å 5Å 3Å 晶体结构
Size Shape Subunit
Size Shape Subunit
Backbone Trace
• 分子置换法
• 同晶置换法
• 反常散射法
§11-2 溶液多维核磁共振
核磁共振原理
• 核磁共振
– 原子核在外磁场中吸收特定频率电磁波的现象 称为核磁共振 – 核磁共振是磁矩不为零的原子核，在外磁场作 用下自旋能级发生塞曼分裂，共振吸收某一定 频率的射频辐射的物理过程
核磁共振原理
• 半数以上的原子核具有自旋，旋转时产生一小磁 场。当加一外磁场，这些原子核的能级将分裂， 既塞曼效应 – 在外磁场B0中塞曼分裂图：
二维核磁谱
结构约束的获得
• 常用于蛋白质溶液结构计算的结构约束主 要包括: NOE，二面角，氢键，以及残余偶 极耦合(Residual Dipolar Couplings , RDC) ,
– NOE 效应是指两个空间距离相近的原子通过空 间进行磁矩传递，该效应的强度与距离的6 次 方成反比 – 角度约束最常用的是主链肽键的二面角φ和ψ – 氢键的约束传统上依靠蛋白质在重水中主链酰 胺基的氢‐氘交换实验，同时结合观察到的NOE 交叉峰以及初步的二级结构信息获得
第七节 结构生物学技术概论
授课教师：李旭 授课时间：2014年10月31日
定义
• 结构生物学：
– 以生物大分子的特定空间结构及结构的特定运 动与其生物学功能的关系为基础，阐明生命现 象的学科
• 研究生物大分子的功能和结构 • 阐明生物大分子间的相互作用机制
结构生物学主要技术方法
• X射线晶体衍射 • 溶液多维核磁共振 • 低温电子显微镜三维电子衍射图象重构 • 其他方法
X射线晶体衍射
• X射线的波长范围(0.01‐100Å)与成键原子之间的距 离 (1‐2Å附近 ) 可比，因此 X 射线可用于研究各类分 子的结构 • 因为没有X射线透镜可以聚焦 X射线，到目前为止 还不能用X射线对单个的分子成像 • X射线对晶体中数量巨大的相位相同分子的衍射叠 加在一起能够产生足以被探测的信号
§11-3 低温电镜三维重构
• 三维冷冻电镜技术主要是将样品保存在液 氮或液氦温度下利用透射电子显微镜进行 二维成像，再经过对二维投影图像的分析 进行三维重构
– 将样品通过快速液氮冷冻“冻”在玻璃态冰中
电镜样品负染制备
• 负染(negative staining)条件下，样品通常包埋在重 金属盐中，图像具有很高的对比度，而且样品在 炭膜上大都有特定的朝向 • 结合图像分类技术，该方法可以用于研究非常不 均一或者分子量较小的样品 • 然而染色过程不可避免地会引起样品的变形，并 且有染色不均匀的缺陷，所以负染样品的精度通 常不超过20 Å
同位素标记蛋白样品的制备
• 生物大分子核磁共振的主要实验对象是自旋为1/2 的原子核，如1H，13C，15N 和31P
– 对于分子量较小的短肽和分子量小于10k的蛋白质，可 以使用未标记的样品通过采集二维氢谱进行化学位移 归属和结构解析 – 而对于分子量大于 10k 而小于 25k 的蛋白质，由于氢谱 的谱峰重叠比较严重，需要使用13C和15N标记的样品， 采集一系列的1H，13C，15N三共振谱图进行化学位移归 属和结构解析 – 对于分子量更大的蛋白质，则需要使用D2O配制的培养 基获得氘代的蛋白样品进行核磁共振实验