微生物降解纤维素的研究进展

微生物降解纤维素的研究进展

引言植物通过光合作用, 生产地球上最丰富、最廉价的纤维素资源,全球每年产生的纤维素高达1000 亿t，中国农作物秸秆量达到6 亿t，林木枝桠和林业废弃物年可获得量约9 亿t，这些纤维素，除少部分被利用外,大部分通过简单的焚烧方式利用，利用率极低，在浪费能源的同时对环境造成了污染。纤维素在自然条件下分解缓慢。随着世界人口迅速增长、粮食、矿产资源日渐枯竭，开发高效转化木质纤维素类可再生资源的微生物技术，利用工农业废弃物等发酵生产人类急需的燃料、饲料及化工产品，即化工原料的“绿色化”，具有重要的现实意义和发展前景。微生物作为处理纤维素的一种手段，由于其对环境危害小，且能实现资源的再利用而越来越受到重视。因此，纤维素降解机制的研究、纤维素高效分解菌种的选育以及纤维素分解酶类的研究成为热点。

1 纤维素的分子结构

纤维素是由D-葡萄糖以β-1,4 糖苷键结合起来的链状高分子化合物，纤维素的分子量为1. 5～ 1. 84×106, 相当于11 300 个葡萄糖残基, 这些纤维素分子以氢键构成平行的微晶束, 约60 个为一束。纤维素主要由结晶区和无定型区两部分组成。结晶区结构致密,葡萄糖没有游离羟基,纤维素酶不易侵入到内部发挥降解作用 ,而无定型区结构比较疏松,很易被微生物降解。迄今为止, 已发现固态下纤维素存在着五种结晶变体, 即天然纤维素(纤维素Ⅰ)、人造纤维素Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和纤维素X, 这五种结晶变体各有不同的晶胞结构, 并可由X 射线衍射、红外光谱、Raman光谱等方法加以鉴别。

2 纤维素降解机理研究

有关纤维素降解机理的研究有很多，但纤维素酶将天然纤维素转化成葡萄糖过程中的细节至今仍不清楚。目前，关于纤维素的降解机理主要有以下几种。

2.1 C1-Cx假说

1950 年, Reese 等曾阐明没有一种纤维素酶生产菌能生产出分解棉花中的天然纤维素的酶, 但发现有的菌株生产的酶能分解膨润的纤维素或纤维素诱导体等非晶体性纤维素, 因而提出了由于天然纤维素的特异性而必须以不同的酶协同作用才能分解的C1-Cx假说,其基本模式可以表述为：

该学说认为，C1酶首先作用于结晶纤维素，使形成结晶结构的纤维素链开裂，长链分子的末端部分离，使其转化为非结晶形式，从而使纤维素链易于水解；Cx 酶随机水解非结晶纤维素，可溶性纤维素衍生物和葡萄糖的β-1,4-寡聚物；β-葡萄糖苷酶将纤维二糖和纤维三糖水解成葡萄糖。

2.2 协同理论

协同理论是目前被大多数学者所普遍接受的理论。该理论认为：纤维素降解是由EG(内切葡聚糖酶)、CBH(外切葡聚糖纤维二糖水解酶)和CB(纤维二糖酶或β

-葡萄糖苷酶)共同作用的结果。其酶反应的顺序机理：内切葡聚糖酶首先进攻纤维素的非晶区，形成外切纤维素酶需要的新的游离末端，然后外切纤维素酶从多糖链的非还原端切下纤维二糖单位，β-葡萄糖苷酶再水解纤维二糖单位形成葡萄糖。

2.3 原初反应假说

在对褐腐菌降解纤维素的研究过程中发现，褐腐菌降解结晶纤维素的早期阶段纤维素的机械强度大幅度降低，但只有极微量的重量损失和很少的还原糖生成。这与纤维素酶解时的聚合度降低而还原糖增加现象明显不同，因此Coughlan 提出了结晶纤维素降解的多步骤学说(Multisteps)，该学说认为原初反应即无序化反应使纤维素的结晶状态发生改变，更便于随后的纤维素[EG，CBH，GE]水解。

2.4 其他理论

2002 年山东大学的高培基[8]概括纤维素酶降解机制及纤维素酶分子结构与功能研究进展时，提出了新的纤维素酶降解模式。该模式认为纤维素降解是由纤维素聚合物分子链的解链和其糖苷键的水解(解聚)先后发生并同时反复进行的过程所组成。前者起始于纤维素酶分子对纤维表面的吸附，导致了分子链间氢链断裂和单一基元纤维的分离，造成纤维素聚集结构态的改变，是降解过程的限速阶段。后一过程水解单一基元纤维链的糖苷键，使其断裂，形成可溶性糖类，对解链也有协同作用。

3 纤维素降解菌的研究进展

在自然生态环境中，许多微生物、植物及昆虫在适宜的条件下均有产生纤维素酶的能力。近年来已发现的能降解纤维素的微生物就超过了200 种，主要包括：真菌、细菌、放线菌。

3.1 真菌

降解纤维素的真菌有很多，如木霉属(Trichoderma )、青霉属(Penicillium)、曲霉属(Aspergillus)、根霉属(Rhizopus)、漆斑霉属(Myrothecium)、枝顶孢霉属(Acremonium)、毛壳霉属(Chaetomium)和脉孢霉属(Neurospora)等。其中，很多纤维素降解真菌在生长过程中能产生菌丝，菌丝具有很强的穿透能力，能穿透植物角质层的阻碍，紧紧依附和穿插在纤维物质上，增大降解酶与纤维物质的接触面积，从而加快降解速率。如木霉属、青霉属、漆斑霉属、毛壳霉属和脉抱霉属为丝状真菌。目前，木霉属是迄今所知纤维素酶系最全面和研究较多的一个属。

霉的研究也较多。木霉菌和曲霉菌也早已应用于酶制剂的生产。目前，发现的真菌多为好氧菌，也有研究者在草食动物胃肠道及其粪样中发现厌氧真菌。2009 年，张艳英就从山羊、奶牛和绵羊的瘤胃液中分离出了8 株瘤胃厌氧真菌。

3.2 细菌

细菌中酶活力较强的菌种有纤维杆菌属(Culmolnoas)、生孢纤维菌属(sporocytophaga)和梭菌属(cellulomonas)。研究最多的是纤维单胞菌（Cellulomonas）和热纤梭菌（Clostridium thermocellum）。根据细菌的生理学特性，一般将纤维素降解细菌分类为：厌氧型、好氧型和好氧滑动菌。好氧细

菌以可溶性胞外酶的形式分泌出3种纤维素酶对纤维素进行水解，如纤维杆菌属(Culmolnoas)的纤维单胞菌。厌氧细菌将3 种纤维素酶联合组装成一个大复合体———纤维小体(cenulosome)，具有多种功能的超分子结构。纤维小体附着在细菌细胞表面，所以细菌需要粘附在纤维上，使纤维小体在纤维的接触点处对纤维素进行水解，如热纤梭菌（Clostridium thermocellum）。研究表明，细菌在降解纤维素过程中产生纤维素酶的量较少，且大多不能分泌到细菌细胞外，其大多数对结晶纤维素没有活性，纤维素降解能力明显低于真菌，因此很少将细菌投入到工业生产中。

3.3 放线菌

虽然放线菌繁殖缓慢且不及真菌和细菌对纤维素降解能力强，但放线菌分泌的胞外酶多数具有一定的耐碱性，在强碱性条件下仍能保持较高活性。目前，研究较多的是高温放线菌。能降解纤维素的放线菌主要包括：纤维放线菌(Acidothermus. Cellulolyticus)、诺卡氏菌属（Ncardia）和链霉菌属（Streptomyces）。

3.4 纤维素降解复合菌群

纤维素结构复杂，要将其有效降解需要多种纤维素酶的协同作用。单一的纤维素降解菌大多不能同时产生3 种类型的纤维素酶，而多菌株混合培养中，各种纤维素降解菌可产生不同配比的内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶共同降解纤维物质。同时，在多菌株共存的环境中，产物的反馈抑制也可得到缓解，从而提高纤维素的转化率。

4 问题及展望

利用微生物将纤维素类物质水解成葡萄糖，所得葡萄糖经发酵可生产酒精、食品及其他化工原料．其经济效益和社会效益都十分显著。微生物产生的纤维素酶作为新型饲料添加剂，在饲料工业中应用已相当普及．但是，目前在利用微生物降解木质纤维素方面依然存在降解效率低．酶产量低的瓶颈问题。因此，研究可从以下方面突破：

（1）菌种筛选方面：加强高效野生菌种的筛选和发酵工艺等基础工作的研究，分离和筛选出针对不同行业的高效纤维素分解菌种，同时利用目前先进的分子生物学技术，选育出活性高，产酶量大的菌种。此外，在自然界中存在大量的未可培养微生物，通过提取并纯化特定环境样品中微生物的总DNA，进而构建环境基因组文库，并从构建的各种基因组文库中筛选新的纤维素酶基因，为筛选新的高效纤维素降解菌提供了一个新途径。

（2）混合培养方面：微生物种群的多样性可以影响系统的功能，由两种或更多种不同微生物组合成的微生物集合体被证实在自然界中的许多生物转化中起主要作用。深入研究不同来源纤维素酶以及不同菌种之间的协同作用，弄清菌株与菌株之间的关系及其在降解发酵过程中的作用；利用分子生物学手段弄清混合菌剂在木质纤维素降解过程中微生物群落的变化；为混合菌剂的选育、优化提供有利支持。

（3）机理研究方面：由于底物的复杂性和酶本身的多组分，虽然纤维素酶作用的某些疑难问题已获解决，但还遗留下许多问题。因此必须弄清自然界中微生物降解木质纤维素的机制，了解纤维素酶类不同组分以及小分子活性物质之间