人类EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒说明书
EGFR基因突变(ARMS法)检测标准操作规范
EGFR基因突变(ARMS法)检测标准操作规范EGFR基因突变（ARMS法）检测标准操作规范1、目的：明确EGFR基因突变（ARMS法）检测操作、结果判断、报告内容及质控管理规程，保证检测结果的可靠性。
2、执行人：李文辉、郭志云3、试剂来源：苏州为真生物医药科技有限公司4、质控物：阴性、阳性对照均为试剂配套。
5、实验操作步骤：5.1 DNA提取FFEP样本DNA的提取(QIAGEN)（1）切片、烤片：切3~5张厚度为8~10μm的组织片，捞至普通玻片上（若为小组织，则切10张，同一玻片可捞多张），60℃考片30分钟；大组织另外切一张3μm组织片进行常规HE染色，作病理评估之用。
（2）脱蜡：将组织切片置于二甲苯中室温脱蜡2次，每次10min；随后浸入100%乙醇3min。
将组织切片依次室温置于100%、80%、70%梯度乙醇中各2min，复水后，室温浸入去离子水3min。
（3）评估、刮片：组织片经病理评估后，用洁净盖玻片刮取癌组织密集区域，并转移至洁净的1.5ml EP管中；小组织全部刮取至1.5ml EP管中。
（4）消化：加入180μl ATL和20μl蛋白酶K，震荡混匀，根据组织大小可增加消化液的用量，56℃，1h，根据组织大小可延长消化时间甚至过夜消化（期间可以适当摇晃颠倒样品，使之混匀裂解充分；可裂解至组织消化完）。
（5）升温：将温度调至90℃，作用1h（注意管盖，90℃高温可能会导致爆盖以致液体被蒸发；时间不要太长1小时足够；一个水浴锅时，56℃到90℃之间过渡时应将样本置于室温中，待温度完全升到90℃后再将样本放进去）。
（6）短暂离心使液体聚于管底，加入200μl AL，震荡混匀，然后加入200μl无水乙醇，震荡混匀。
（7）短暂离心使液体聚于管底，将整个液体全部移入收集柱中，然后8000rpm 离心1min，丢弃收集管后将收集柱至于新的收集管中。
（8）加入500μl AW1漂洗液，离心8000rpm，1min，丢弃收集管后将收集柱至于新的收集管中。
引物特异荧光PCR检测EGFR突变的试剂盒[发明专利]
![引物特异荧光PCR检测EGFR突变的试剂盒[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/365595f2a8114431b80dd844.png)
专利名称：引物特异荧光PCR检测EGFR突变的试剂盒专利类型：发明专利
发明人：吴荃,李明,程钢,何蕴韶
申请号：CN200810027672.6
申请日：20080425
公开号：CN101565742A
公开日：
20091028
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供了一种引物特异荧光PCR检测EGFR突变的试剂盒，特别涉及肿瘤组织以及肿瘤患者外周血清中EGFR基因突变的诊断。
本试剂盒针对分子靶向抗癌药物疗效相关的特定突变位点，设计特异性的寡核苷酸引物序列和探针序列，对每一个待测样品，分别用野生型PCR体系和突变型PCR体系进行荧光PCR检测，通过两次反应Ct值差值(ΔCt)的大小，判断样品是否存在EGFR19外显子和21外显子的突变。
本发明可对EGFR的特定位点是否存在突变进行检测，可用于分子靶向抗肿瘤新药的疗效预测和肿瘤患者临床个体化用药方案的指导。
申请人：中山大学达安基因股份有限公司
地址：510665 广东省广州市高新技术产业开发区香山路19号
国籍：CN
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透景EGFR检测试剂盒说明书
透景EGFR检测试剂盒说明书【药品名称】通用名称：EGFR基因突变检测试剂盒(荧光PCR法)汉语拼音：EGFRJiYinTuBianJianCeShiJiHe(YingGuangPCRFa)【成份】外显子19检测试剂：探针1(delE746-A750)、探针2(delL747-P753insS)、正向引物1、反向引物1、阳性对照品1(delE746-A750)、阳性对照品2(delL747-P753insS)、阴性对照品1(exon19 wildtype)；外显子21检测试剂：探针3(L858R)、探针4(L861Q)、正向引物2、反向引物2、阳性对照品3(L858R)、阳性对照品4(L861Q)、阴性对照品2(exon21wild type)；通用试剂：去离子水、2X PCR Pre-Mix。
产品储存条件及有效期：检测试剂于-20℃±3℃避光、密封储存,通用试剂于2℃～8℃密封储存，有效期为自生产之日起一年。
附件：注册产品标准、说明书【适应症】该产品用于定性检测经临床确诊为非小细胞癌患者的肺组织新鲜样本或石蜡包埋样本中的EGFR基因外显子19(delE746-A750，delL747-P753insS)和外显子21(L858R，L861Q)的突变。
【规格】10人份/盒、20人份/盒。
人EGFR基因突变检测试剂盒（PCR荧光法）技术参数规格：24人份/盒组分及储存有效期24人份：序号名称包装体积描述样本类型（1）推荐样品类型顺序：新鲜病变组织＞冰冻病理切片＞石蜡包埋病理组织或切片＞其它类型标本。
从新鲜病变组织中取样应确定含有肿瘤病变组织,石蜡包埋病理组织或切片应确定含有肿瘤病变组织,所用石蜡包埋病理组织或切片保存时间不超过3年。
（2）推荐使用商业化的DNA提取试剂盒(推荐使用QIAGEN石蜡组织DNA抽提试剂盒，Cat NO,56404)，所提取的DNA OD260/OD280在1.6～2.0。
基因突变检测实验操作流程-EGFR
基因突变检测实验操作流程实验试剂：QIAGEN DNA FFPE Tissue Kit试剂盒、实验仪器：离心机、生物安全柜、Nanodrop2000分光光度计、LightCycler480荧光定量PCR、恒温金属浴。
一、DNA提取1.Extract DNA（详见QIAGEN DNA FFPE Tissue Kit,货号56404）HE染色：1）石蜡块固定至切片机上，调整切片机切片厚度设置为2μm；2）切取2μm厚度的组织片1张，先放入15%酒精中，然后从15%酒精中放入45℃水中捞片；3）HE染色；HE分析；如图* 记录：病理号、病理诊断、肿瘤细胞比例。
1)石蜡块固定至切片机上，调整切片机切片厚度设置为5μm，首先切除表面的2-3片，以去除表面氧化层；2)切取5μm厚度的组织片3片（如果组织块过小，需要多切几片），然后放入EP管中，加入1ml二甲苯振荡混匀，以充分溶解组织周围石蜡，14000rpm离心2min吸去上清去除石蜡，如果石蜡过多，可以用二甲苯再洗一次；3)加入无水乙醇1ml（去除二甲苯），14000rpm离心2min吸尽上清后开盖直至残余乙醇全部挥发（大约10min）；4)加入180μlATL和20μl蛋白酶K，震荡混匀；5)56℃1h（期间可以适当摇晃颠倒样品，使之混匀裂解充分）；6)90℃1h（注意管盖，由于90°高温可能会导致开盖，以致液体被蒸发；时间不要太长1小时足够；一个水浴锅时，56℃到90℃之间应该将样本置于室温中）；7)短暂离心使液体聚于管底，加入200μlAL，震荡混匀，然后加入200μl无水乙醇，震荡混匀；8)短暂离心使液体聚于管底，将整个液体全部移入收集柱中，然后8000rpm离心1min，丢弃收集管后将收集柱置于新的收集管中；9)加入500μl AW1漂洗液，离心8000 rpm，1min，丢弃收集管后将收集柱置于新的收集管中；10)加入500μl AW2漂洗液，离心8000rpm，1min，丢弃收集管后将收集柱置于新的收集管中；11)离心14000rpm，3min，以去除收集柱中的残余液体；12)加入ATE（洗脱液）50μl，然后室温静置2min；13)离心14000rpm，1min，收集洗脱液。
人类KRAS7种突变检测试剂盒(荧光PCR法)说明书-P4.2-12T-2015.10.09
人类KRAS基因7种突变检测试剂盒（荧光PCR法）说明书【产品名称】通用名称：人类KRAS基因7种突变检测试剂盒（荧光PCR法）英文名称：Human KRAS Gene 7 Mutations Fluorescence Polymerase Chain Reaction (PCR) Diagnostic Kit【包装规格】12测试/盒【预期用途】KRAS基因是人体肿瘤中常见的致癌基因。
该基因的突变常见于多种恶性肿瘤，在肺癌患者中的突变率为15～30%，在结直肠癌患者中的突变率为20～50%。
导致KRAS处于激活状态的突变主要位于第12和13密码子上。
KRAS 基因突变一般会使肺癌患者对EGFR酪氨酸激酶抑制剂产生耐药，使结直肠癌患者对抗EGFR抗体类药物产生耐药。
但是，2010年10月的最新研究发现第13密码子上的Gly13Asp（G13D）突变亦对抗EGFR抗体类药物有治疗反应性（参见：De Roock. W. JAMA. 2010;304(16):1812-1820）。
因此，KRAS基因突变检测能提高肿瘤临床治疗的针对性，降低治疗费用，节省宝贵的治疗时间。
大部分肿瘤的突变都是体细胞突变，突变细胞往往与野生型细胞混杂在一起，因此所提取的DNA常带有大量野生型DNA，所以对体细胞突变检测需要较高的特异性，而目前广泛使用的直接测序法检测能力有限，不能完全满足临床需要。
本试剂盒用于检测人类KRAS基因的12和13密码子上7种热点体细胞突变（见表1），试剂盒以DNA为检测样本，提供突变状态的定性评估。
辅助临床医生筛选出可受益于肿瘤靶向药物的大肠癌等癌症患者。
该产品用于组织中提取DNA的KRAS基因7种突变的检测，为临床医生对大肠癌或肺癌患者选择肿瘤靶向药物治疗提供参考。
表1 人类KRAS基因的12和13密码子上7种热点体细胞突变突变名称氨基酸变化碱基变化Cosmic ID 公司命名Gly12Asp 甘氨酸到天门冬氨酸GGT>GAT 521 12-2-A Gly12Ala 甘氨酸到丙氨酸GGT>GCT 522 12-2-C Gly12Val 甘氨酸到缬氨酸GGT>GTT 520 12-2-T Gly12Ser 甘氨酸到丝氨酸GGT>AGT 517 12-1-A Gly12Arg 甘氨酸到精氨酸GGT>CGT 518 12-1-C Gly12Cys 甘氨酸到胱氨酸GGT>TGT 516 12-1-T Gly13Asp 甘氨酸到天门冬氨酸GGC>GAC 532 13-2-A 【检测原理】本试剂盒基于实时PCR平台结合了特异引物和双环探针两种技术，检测DNA样品中含有的突变基因。
Braf基因突变检测试剂盒说明书
人类B-raf基因V600E突变检测试剂盒（荧光PCR法）说明书【产品名称】通用名：人类B-raf基因V600E突变检测试剂盒（荧光PCR法）英文名：Diagnostic kit for V600E Mutation of Human B-raf Gene(Fluorescence PCR Analysis)【包装规格】20测试/盒【预期用途】B-raf基因位于7号染色体长臂上，是一种癌基因，属RAF基因家族，有18个外显子，编码一种含783个氨基酸的B-raf蛋白，是EGFR通路RAS/RAF/MEK/MRK/MAPK中重要的转导因子，参与调控细胞生长、分化和凋亡等多种生理过程。
针对EGFR的肿瘤靶向药物通过抑制该途径发生药理作用。
研究表明在非小细胞肺癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤中存在B-raf基因突变，其中第15外显子上V600E点突变最常见，约占所有突变的90%以上，该突变导致B-raf蛋白被异常激活，从而使患者接受EGFR-TKI药物和EGFR单抗类药物治疗失效。
据中国2010版《肿瘤学临床实践指南》建议，对K-raf基因检测正常的非小细胞肺癌和结直肠癌患者，应进一步检查B-raf基因的突变状态，以指导靶向药物治疗方案。
本试剂盒以人非小细胞肺癌、结直肠癌肿瘤组织切片提取的基因组DNA为检测样本，用于肿瘤组织B-raf 基因V600E点突变的定性检测，为临床肿瘤靶向药物的个体化用药提供依据。
本公司尚无临床实例证实B-raf 基因突变与靶向药物的相关性，其相关性主要来自文献报道，因此本试剂盒检测结果仅用于辅助临床医生对肿瘤患者制定用药方案。
【检验原理】本试剂盒基于实时荧光PCR平台，结合等位基因特异性扩增（ARMS）技术、野生型基因扩增抑制技术和多重PCR技术检测B-raf基因V600E突变。
ARMS技术是指PCR引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增，通过设计特异性ARMS引物，对存在V600E突变的B-raf基因靶序列进行PCR扩增放大，并利用FAM基团标记的Taqman 探针对扩增产物进行检测。
EGFR实验说明书电子版414
10.预处理溶液Ⅲ：甲醛固定液
市售甲醛
1ml
PBS（pH7.2-7.4）
39ml
MgCl 2·6H2O
0.18g
充分混匀，每次实验前应使用新鲜配制的溶液。
备注：正确的操作程序保证试剂的质量
20×SSC（pH5.3）
100ml
去离子水
800ml
充分混匀，室温下10M NaOH调节pH值至7.0±0.2，用去离子水定容至1L。使用 期间2-8℃储存。试剂配制6个月后应丢弃，若试剂出现混浊或污染丢弃时间应更早。
3.变性液：70％（v/v）甲酰胺/2×SSC
甲酰胺
35ml
20×SSC（pH5.3）
(8) 组织切片经蛋白酶K消化后，于2×SSC溶液中漂洗2次，每次5分钟。 (9) 室温下于甲醛固定液中固定5分钟。
（为保持组织结构，蛋白酶K消化后室温下用甲醛固定液固定）
(10) 室温下将组织切片玻片依次置于70%乙醇、85％乙醇和100％乙醇中各2分钟脱水。 (11) 自然干燥玻片。 (12) 加热玻片至56℃。 (13) 按照FISH操作步骤进行FISH实验。
6
EGFR基因扩增检测试剂盒
【变性杂交操作步骤】
注意：荧光原位杂交有杂交仪变性杂交和甲酰胺变性杂交两种方法。前者是 样本和探针分别变性，后者是用杂交仪对样本和探针进行共变性，减少了人为因 素的影响。
1. 甲酰胺变性杂交(手工操作) (1) 探针混合物准备及变性
探针配制。室温下将如下液体加入到微量离心管中。
交产生明亮的信号。EGFR DNA 探针杂交到人类7号染色体短臂7p11.2-p21, 荧光 信号为橘红色（Rhodamine）。对照探针为CSP7，探针杂交信号位于人类7号染色体 7p11.1-q11.1，覆盖整个着丝粒区域，荧光信号为绿色（FITC）。
艾德人类10基因突变联合检测试剂盒（可逆末端终止测序法）
艾德⼈类10基因突变联合检测试剂盒（可逆末端终⽌测序法）受理号：CSZ1700127体外诊断试剂产品注册技术审评报告产品中⽂名称：⼈类10基因突变联合检测试剂盒（可逆末端终⽌测序法）产品管理类别：三类6840申请⼈名称：厦门艾德⽣物医药科技股份有限公司国家⾷品药品监督管理总局医疗器械技术审评中⼼⽬录基本信息 (3)⼀、申请⼈名称 (3)⼆、申请⼈住所 (3)三、⽣产地址 (3)产品审评摘要 (4)⼀、产品概述 (4)⼆、临床前研究摘要 (7)三、临床评价摘要 (15)四、收益-风险评估 (24)综合评价意见 (28)基本信息⼀、申请⼈名称厦门艾德⽣物医药科技股份有限公司⼆、申请⼈住所厦门市海沧区⿍⼭路39号三、⽣产地址厦门市海沧区⿍⼭路39号产品审评摘要⼀、产品概述（⼀）产品主要组成成分表1 试剂盒主要组成成分试剂盒具体组成成分、配套试剂及软件见说明书。
（⼆）产品预期⽤途本试剂盒⽤于定性检测⾮⼩细胞肺癌（NSCLC）、结直肠癌（CRC）患者经中性福尔马林固定的⽯蜡包埋（FFPE）的组织样本中EGFR/ALK/ROS1/RET/KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF/HE R2/MET基因变异。
其中，针对NSCLC，EGFR基因中：19号外显⼦缺失（19del）、L858R点突变⽤于吉⾮替尼⽚的伴随诊断检测，T790M点突变⽤于甲磺酸奥希替尼⽚的伴随诊断检测；AL K基因重排（融合）和ROS1基因重排（融合）⽤于克唑替尼胶囊的伴随诊断检测；针对CRC，KRAS基因野⽣型⽤于西妥昔单抗注射液的伴随诊断检测；如表2所⽰。
表2 伴随诊断⽤途的基因变异类型及相应的靶向药物表3中为本试剂盒可以检出，但未经伴随诊断验证的基因变异类型。
表3 未经伴随诊断⽤途验证的基因变异类型其检测结果仅供临床参考，不应作为患者个体化治疗的唯⼀依据。
临床医⽣应结合患者病情及其他实验室检测指标等因素对检测结果进⾏综合判断。
（三）产品包装规格24测试/盒（四）产品检验原理本试剂盒通过构建样本DNA测序⽂库，并使⽤特异探针对⽂库进⾏⽬标区域捕获富集，捕获后的⽂库通过⾼通量测序，可实现多个基因多个突变的⼀次性检测。
人类EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒说明书
人类EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒说明书1.打开操作软件，设置PCR扩增程序为Stage1：95℃ 5minStage2：95℃ 20s，57℃ 32s ，5个循环Stage3：95℃ 20s，60℃ 32s ，40个循环收集FAM信号注：如果使用ABI定量PCR仪，将“Passive Reference”设置为“None”, “reporter”设置为“FAM”，“quencher”设置为“TAMRA”【参考值】检测结果判定：1.当样品CT值大于或等于阴性临界值时，则该样品为阴性或低于本试剂盒的检测下限。
2.当样品CT值小于阴性临界值时，则该样品为阳性。
表3 结果判定【实验结果的解释】1.阈值设定：针对ABI7500机型，对以上9种检测分别设定阈值，其中19-del(1) ,19-del(2)和G719X阈值设定为12000，其他为300002.阴性无模板空白对照(NTC) 应无扩增曲线升起；否则表明此次实验结果无效，建议更换操作环境或反应试剂，重新试验。
（若只稍稍升起，但对结果判断无显著影响，则结果依然有效）3.阳性对照Ct值一般小于25，参照基因体系的阳性对照CT值一般小于23，但须根据仪器型号等情况进行判断。
4.CT值确定：建议对于一个突变检测体系应同时选择参照基因反应管，STD反应管，NTC和样品反应管，一并划定阈值，从而得到外控CT值和样品的突变CT值。
5.参照基因CT值应控制在23之前，以用于评估反应体系中的DNA模板量。
若外控CT值大于23，说明加入的DNA含有PCR抑制剂或DNA加入量太少，需重新提取或增大DNA加入量再做。
(仅对全阴性结果而言；若已经判断为阳性，结果仍然可靠)附表：。
人类EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒说明书
人类EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒说明书【产品名称】通用名称：人类EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒英文名称：Shuwen®Human EGFR Gene Mutation Detection Kit for Real-Time PCR【包装规格】7测试/盒【预期用途】EGFR是一种细胞膜表面的糖蛋白受体，具有酪氨酸激酶（Tyrosine Kinase，TK）活性，是原癌基因c-erbB-1（HER-1）的表达产物。
EGFR的主要信号转导途径有：PI3K-PDK通路，RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK通路，PLC-γ通路，JAK-STA T通路。
通过这些途径，将胞外信号转化为胞内信号，从而有效应对外界的信号刺激，调节细胞的生长、增殖、分化，抑制细胞的凋亡。
EGFR异常调节通过多种机制促进细胞恶性转化，包括受体的过度表达、突变、生长因子-受体自分泌环的活化以及特定的磷酸酶失活，其中涉及肿瘤发生和进展的机制中最常见的是EGFR的基因突变和过度表达。
EGFR基因位于7号染色体短臂7pl2-14区，由28个外显子组成。
其突变主要发生在EGFR酪氨酸激酶的A TP结合位点的编码区（第18-20外显子），研究表明，EGFR酪氨酸激酶抑制剂（例如吉非替尼、厄洛替尼和埃可替尼等）疗效与EGFR基因的突变有密切的相关性。
目前已经报道大约有30种突变与吉非替尼的药物反应相关，主要是19外显子上的缺失突变和21外显子上的L858R的点突变。
外显子19上747-750位氨基酸的大约20种缺失约占所有突变的45%，其中以两种delE746-A750(2235_2249del15和2236_2250del15)最为常见，占到外显子19缺失总数的75%；外显子21上L858R的点突变占所有突变的45%左右；外显子18的3种点突变（G719X）约占5%；外显子20的突变占1%左右。
另外研究发现外显子20上的T790M突变与酪氨酸激酶抑制剂药物的耐药性相关。
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人类EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒说明书
【产品名称】
通用名称：人类EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒
英文名称：Shuwen® Human EGFR Gene Mutation Detection Kit for Real-Time PCR
【包装规格】
7测试/盒
【预期用途】
EGFR是一种细胞膜表面的糖蛋白受体，具有酪氨酸激酶（Tyrosine Kinase，TK）活性，是原癌基因c-erbB-1（HER-1）的表达产物。
EGFR 的主要信号转导途径有：PI3K-PDK 通路，RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK 通路，PLC-γ 通路，JAK-STAT 通路。
通过这些途径，将胞外信号转化为胞内信号，从而有效应对外界的信号刺激，调节细胞的生长、增殖、分化，抑制细胞的凋亡。
EGFR异常调节通过多种机制促进细胞恶性转化，包括受体的过度表达、突变、生长因子-受体自分泌环的活化以及特定的磷酸酶失活，其中涉及肿瘤发生和进展的机制中最常见的是EGFR的基因突变和过度表达。
EGFR基因位于7号染色体短臂7pl2-14区，由28个外显子组成。
其突变主要发生在EGFR酪氨酸激酶的ATP结合位点的编码区（第18-20外显子），研究表明，EGFR酪氨酸激酶抑制剂（例如吉非替尼、厄洛替尼和埃可替尼等）疗效与EGFR基因的突变有密切的相关性。
目前已经报道大约有30种突变与吉非替尼的药物反应相关，主要是19外显子上的缺失突变和21外显子上的L858R的点突变。
外显子19上747-750位氨基酸的大约20种缺失约占所有突变的45%，其中以两种delE746-A750(2235_2249del15和2236_2250del15)最为常见，占到外显子19缺失总数的75%；外显子21上L858R的点突变占所有突变的45%左右；外显子18的3种点突变（G719X）约占5%；外显子20的突变占1%左右。
另外研究发现外显子20上的T790M突变与酪氨酸激酶抑制剂药物的耐药性相关。
本试剂盒以肿瘤DNA为检测样本，提供EGFR基因突变的定性检测。
本试剂盒仅为临床医生肿瘤靶向治疗药物的选择提供参考，具体临床应用时须结合实际情况进行判断，不能以本试剂盒检测结果作为临床诊断的唯一依据。
【检测原理】
本试剂盒结合特异性引物和TaqMan探针技术，用实时荧光PCR方法检测DNA样品中的EGFR突变基因。
利用特异性引物对突变靶序列进行扩增，同时阻滞野生型的扩增，通过TaqMan探针对扩增产物进行检测，使得突变基因得到扩增而野生型基本不扩增，从而达到高检测特异性和高灵敏度。
【主要组成成分】
本试剂盒具体包含组分如表1
表1
【储存条件及有效期】
避光，-20℃以下保存，避免反复冻融(不要超过5次)，有效期6个月。
【适用仪器】
ABI 7300，ABI 7500，ABI 7900，ABI StepOne，ABI StepOne Plus，Rotor-Gene Q
【样本要求】
本试剂盒可以检测从新鲜组织及FFPE组织中提取的DNA，DNA质量及浓度影响检测的特异性和灵敏度。
DNA的质量与样本保存时间、样本组成、DNA提取方法密切相关；而且所采集的临床样本中正常组织细胞的混杂程度也不同，因此对样本做如下要求：
1、新鲜标本的制备过程中，术后标本取下后应立即放入-20℃以下冰箱中保存；石蜡包埋组织制备过程中，
术后标本应在1 个小时内放入10％中性缓冲福尔马林溶液中固定，用量应为组织块的4-20 倍，固定时间应在6-48 小时之间；
2、新鲜组织样本，要确保含有肿瘤细胞大于1%，尽量减少正常组织、间质及坏死组织，推荐使用商业化
试剂盒提取DNA(AXYGEN，QIAGEN等公司产品)。
提取的DNA用分光光度计检测DNA纯度，
A260/A280在1.6-2.0之间，如果不能立即检测请置于-20℃保存。
3、FFPE组织样本，要确保含有肿瘤细胞，尽量去除坏死组织及石蜡边缘，推荐使用商业化试剂盒提取
DNA(QIAamp DNA FFPE Tissue Kit)。
提取的DNA用分光光度计检测DNA纯度，A260/A280在1.6-2.0之间，如果不能立即检测请置于-20℃保存。
FFPE组织样本保存年限尚未超过3年。
4、样本切片规格要求为：横切面面积至少6mm×6mm，厚度10µm，3片，如果切片面积小请适当增加切
片数。
最终提取的DNA用100µL-200µL水溶解，分光光度计检测浓度后，稀释或浓缩成5-10ng/µL。
【检验方法】
本试剂盒可以进行5人份的检测反应，并为每个样本额外提供一个参照基因扩增反应，用于估测样本实际DNA的浓度。
建议每批次实验都检测一个阳性对照(positive control)和一个无模板阴性对照(NTC)。
建议根据实验条件进行分区操作，如样品处理区，反应液配制区等。
具体操作步骤如下：
1.将试剂盒中所有组分冰上融化，涡旋混匀并短暂离心，放置于冰上。
[注意：试剂盒中的所有试管在开
盖前均应短暂离心，以免粘在管口或管盖上的试剂在开盖时被污染。
]
2.每批实验根据待检测样本数、一个阳性对照、一个阴性对照，同时计算并分别配制1-8号反应液。
每个
反应液所需反应数=待测样本数+ 2（一个阳性对照、一个阴性对照），而每个反应所需反应液19.7µL，需r-Taq酶0.3µL，即从1-8号反应液中分别取（19.7×反应数）µL于对应编号的1.5EP管，再分别加入（0.3×反应数）µL的r-Taq酶。
[注意：由于取样误差，请根据情况适当多配置0.3个反应即可。
]
3.将配制好的混合液轻轻充分混匀，并按照每管20µL分装到每个PCR反应管中。
4.然后向每个反应管中加入5µL待检测DNA、或阳性参照、或水(试剂盒提供)。
待检测样本最佳浓度范
围为5ng/µL-10ng/µL，即每个反应管中有效DNA总量为25-50ng。
5.短暂离心消除反应管中的气泡，将PCR反应管放入PCR仪。
样本在PCR反应板中的布局可参见表2
表2 建议布局
6.打开操作软件，设置PCR扩增程序为
Stage1：95℃ 5min
Stage2：95℃ 20s，57℃ 32s ，5个循环
Stage3：95℃ 20s，60℃ 32s ，40个循环收集FAM信号
注：如果使用ABI定量PCR仪，将“Passive Reference”设置为“None”, “reporter”设置为“FAM”，“quencher”设置为“TAMRA”
【参考值】
检测结果判定：
1.当样品CT值大于或等于阴性临界值时，则该样品为阴性或低于本试剂盒的检测下限。
2.当样品CT值小于阴性临界值时，则该样品为阳性。
表3 结果判定
【实验结果的解释】
1.阈值设定：针对ABI7500机型，对以上9种检测分别设定阈值，其中19-del(1) ,19-del(2)和G719X阈值设
定为12000，其他为30000
2.阴性无模板空白对照(NTC) 应无扩增曲线升起；否则表明此次实验结果无效，建议更换操作环境或反
应试剂，重新试验。
（若只稍稍升起，但对结果判断无显著影响，则结果依然有效）
3.阳性对照Ct值一般小于25，参照基因体系的阳性对照CT值一般小于23，但须根据仪器型号等情况进行
判断。
4.CT值确定：建议对于一个突变检测体系应同时选择参照基因反应管，STD反应管，NTC和样品反应管，
一并划定阈值，从而得到外控CT值和样品的突变CT值。
5.参照基因CT值应控制在23之前，以用于评估反应体系中的DNA模板量。
若外控CT值大于23，说明加
入的DNA含有PCR抑制剂或DNA加入量太少，需重新提取或增大DNA加入量再做。
(仅对全阴性结果而言；若已经判断为阳性，结果仍然可靠)
附表：。