免疫组织化学染色技术

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荧光素-抗体标记
❖ FITC-IgG（蛋白）
技术类型
❖ 直接染色法 ▪ 荧光素直接标记在特异性抗体（Ab1)
❖ 间接染色法 ▪ 荧光素标记第二抗体（Ab2) ▪ 第二抗体针对第一抗体种属特异性的表 位（如羊抗鼠Ig或羊抗人Ig）
直接法
❖ 优点 ▪ 简单 ▪ 特异
实例：细胞鉴定
❖ 免疫细胞及其亚群（流式细胞术） ▪ T细胞 • CD3+
荧光素
❖ 异硫氰酸荧光素（FITC）
黄绿色荧光
520-530 nm
490-495 nm
荧光素
❖ 四乙基罗丹明（RB200）
橘红色荧光
625 nm
540 nm
荧光素
❖藻红蛋白（PE）
488-561 nm
578 nm
荧光素
❖别藻蓝蛋白（Allophycocyanin, APC ）
660 nm
650 nm
免疫组织化学染色技术
李会强 医学检验学院
Email:lihuiqiang1965@
组织化学染色技术
❖ Histochemistry Technique
❖ 观察对象
▪ 组织、细胞
❖ 使用工具
形
态
▪ 普通显微镜
与 结
▪ 荧光显微镜
构
苏木素 曙红
免疫组织化学染色技术
❖ Immunohistochemistry Technique ▪ 指用标记的特异性抗体在组织细胞原位 通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反 应，对相应抗原（目的蛋白）进行定性、 定位、定量测定的一项免疫检测方法。
标本类型
❖ 组织标本 ▪ 冰冻切片 ▪ 石蜡切片（脱蜡和水化）
❖ 细胞标本 ▪ 体外培养细胞（单层细胞、悬浮细胞） ▪ 体液细胞（涂片）
固定与保存
❖ 固定的目的
▪ 防止细胞自溶，保持细胞形态与机构； ▪ 保存组织细胞抗原性； ▪ 防止标本脱落； ▪ 防止滋生微生物，预防组织腐败 ❖ 标本固定以不损伤细胞形态、不损伤抗原特异性 为基本原则
亲和素-生物素-过氧化物酶复合体（ABC）
❖ 生物素（Biotin） ❖ 亲和素（Avidin） ❖ 生物素标记抗体（B-Ab） ❖ 生物素标记过氧化物酶（B-P）
亲和素-生物素-过氧化物酶复合体（ABC）
EnVision
授课提纲
❖ 基质标本的制作 ❖ 荧光免疫组化技术 ❖ 酶免疫组化技术
❖ 相关问题与解决方案
识别抗体（第一）选择
❖ 单克隆抗体（McAb） ▪ 特异性强 ▪ 敏感性差
❖ 多克隆抗体（McAb） ▪ 特异性差 ▪ 敏感性强
识别（第一）抗体选择
糖基化
构象
碳水化合物
第二抗体选择
选择显色系统
❖ 荧光免疫组化
❖ 酶免疫组化
▪ PAP
？
▪ APAAP
Immunohistochemistry Technique
特定蛋白（抗原）
（透膜）
（一抗） （二抗） （封片）
授课提纲
❖ 基质标本的制作 ❖ 荧光免疫组化技术 ❖ 酶免疫组化技术 ❖ 相关问题与解决方案
授课提纲
❖ 基质标本的制作
❖ 荧光免疫组化技术 ❖ 酶免疫组化技术 ❖ 相关问题与解决方案
固定与保存
❖ 固定剂 ▪ 蛋白类
• 乙醇或甲醇
▪ 微生物类
• 丙酮、三氯化碳 ▪ 多糖类
• 10%福尔马林
固定与保存
❖ 常用固定剂 ❖ 中性甲醛（10%） ❖ 多聚甲醛（4%） ❖ 如原位杂交需含内源性RNA酶抑制剂（DEPC）
细胞通透(permeabilisation)
❖ 目的： ▪ 促使抗体充分进入细胞与抗原结合
❖ 方法： ▪ Triton X-100(0.1%-1%) • （40毫升PBS+120微升Triton X-100）
▪ 蛋白酶 K
抗原修复
❖ 目的： ▪ 充分暴露抗原表位，利于抗体识别。
❖ 方法： ▪ 酶消化修复（无花果蛋白酶，胰蛋白酶）消化法；
▪ 热修复（加热打开组织抗原因固定所致抗原表位交联） • 微波处理 • 煮沸处理 • 高压处理
❖ 第三抗体 ▪ 抗酶抗体 ▪ 与第一抗体同源
兔PAP
P
PP
A
A 鼠APAAP A
GAR IgG
GAM. IgG
兔抗κ
鼠抗λ
Ag
κ
λ
图 双酶双底物(复合物法)双重酶标染色原理
实例：淋巴瘤轻链双重染色法
❖ 抗
▪ 兔抗κ ▪ 鼠抗λ
❖ 二抗
▪ 羊抗兔 ▪ 羊抗鼠
❖ 显色系统 ▪ PAP ▪ APAAP
❖ 过氧化物酶 ▪ Peroxidase（P） ▪ 二氨基联苯胺（DAB）
❖ 碱性磷酸酶（AP） ▪ alkaline phosphatase（AP） ▪ 溴氯羟吲哚磷酸盐（BCIP）
过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法
P AP PAP复合物
抗体选择
❖ 第一抗体 ▪ 识别抗原
❖ 第二抗体（桥联抗体） ▪ 能同时与第一、第三抗体结合
抗原修复
❖ 修复缓冲液 ▪ 柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0) ▪ Tris-Hcl(pH 7.0～8.0) ▪ EDTA(pH8.0)
授课提纲
❖ 基质标本的制作
❖ 荧光免疫组化技术
❖ 酶免疫组化技术 ❖ 相关问题与解决方案
标记物
❖ 荧光素 ▪ 异硫氰酸荧光素（FITC） ▪ 四乙基罗丹明（RB200） ▪ 藻红蛋白（PE） ▪ 藻红蛋白花青苷（PE-Cy5）
• CD4+ • CD8+
▪ B细胞 ▪ NK细胞
免疫细胞分类与计数
Helper T cell
R1
T cell / B cell
Suppressor T cell
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间接法
❖ 优点： ▪ 抗原 ▪ 抗体
实例：检测抗核抗体
❖ 检测原理 ▪ 已知抗原 • 肝细胞/HEp-2 ▪ 待检抗体 ▪ 第二抗体 • 荧光标记兔抗人Ig
❖ 酶免疫组化技术
❖ 相关问题与解决方案
主要类型
❖ 酶标记抗体
▪ 同荧光免疫组化
❖ 非酶标记抗体
▪ 酶-抗酶系统 ▪ 生物素-链霉亲和素系统
技术特点
❖以酶作为抗原，制备抗酶抗体； ❖酶（抗原）与抗酶（抗体）结合制备酶-抗
酶复合物； ❖通过桥联抗体与识别系统（待检抗原-特异
性抗体）连接；
酶桥法
常用酶和相应底物
实例：检测病原体（病毒、细菌）
❖检测原理 ▪ 待检病毒（抗原） ▪ 已知抗体 •单抗或多抗 ▪ 第二抗体 •荧光标记羊抗鼠（或兔）Ig
荧光显微镜（落射式）
❖关键 ▪ 汞灯光源 ▪ 激发滤片 ▪ 暗场聚光镜 ▪ 吸收滤片
荧光显微镜（落射式）
荧光显微镜（落射式）
授课提纲
❖ 基质标本的制作 ❖ 荧光免疫组化技术