光镊在基因治疗中的实现

第20卷第4期四川理工学院学报（自然科学版）V ol．20 No．4JOURNAL OF SICHUAN UNIVERSITY OF2007年8月 SCIENCE & ENGINEERING（NATURAL SCIENCE EDITION）Aug．2007文章编号：1673-1549（2007）04-00101-04光镊在基因治疗中的实现杨 黠（四川理工学院物理系，四川 自贡 643000）摘 要：基因治疗综合了物理、化学、生物、医学等多门学科的技术，应用于基因的置换、修正、修饰、失活。

治疗的关键措施是基因转移，既将目的基因导入靶细胞，这里通过介绍几种普通的物理导入方法的利弊，并通过对光镊原理的分析可以看出其在该领域的优势和重要地位。

关键词：基因治疗；普通的物理方法利弊；光镊子中图分类号：Q812 文献标识码：A引 言基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学新技术。

基因是携带生物遗传信息的基本功能单位，是位于染色体上的一段特定序列。

基因治疗的物理方法有别于生物化学方法，它更多的体现了对基因的细微操作。

光镊子继承了这一特点即将外源的基因导入生物细胞，同时避免了普通显微注射法存在的耗材且不带来外来污染。

1普通的物理方法简介1.1 显微注射法采用特别的玻璃显微注射器在显微镜下将目的基因导入靶细胞。

根据导入方式的不同分为真正的显微注射法和刺穿法[1]。

前者：将目的基因溶液吸入玻璃显微注射器中，在显微镜下注射器针头刺破细胞膜，刺入核内后，将目的基因直接注入受体细胞核中。

后者：在显微镜下用显微注射器针尖刺入细胞膜及核摸，使其形成“孔洞”，使分布于细胞周围的外源性目的基因能有机会自由地进入受体细胞核内。

优点：前者转化效率高、靶向性好；后者便于操作。

缺点：前者显微注射器针尖和靶细胞大小，针尖的内径大小和不同目的基因大小存在尺寸匹配问题；后者由于通过外源目的基因自由地进入“空洞”就存在一个效率问题。

1.2 穿孔法该方法和显微注射器刺穿很相似。

不过是采用光电技术使细胞膜或核膜产生“孔洞”，便于外源基因进入靶细胞。

根据方式分为电穿孔法和激光微束转化技术[2]。

前者：在高压脉冲作用下，使细胞膜上瞬间出现微小的孔洞，既可使不同细胞之间原生质膜发生融合，又可使外源性目的基因通过细胞膜上出现的瞬间小孔而进入细胞。

后者：激光是一种很强的相干单色电磁辐射，极细的激光束即可携带巨大的能量。

激光微束转化技术就是利用激光束定向定点击穿细胞壁和膜，产生可逆性孔洞，溶液中的外源基因可以通过这些孔洞进入[1]。

优点：前者在外加电脉冲的作用下基因转移可以批量生产；后者有定向定点的优势，而且孔极小并可逆。

缺点：前者基因转移效率和脉冲最大电压和其维持时间有关，对大的动物基因转移时要多次电脉冲，故定向受限；后者虽然细胞上产生的是可逆小孔，但激光光束的携带能量大易于溶液中离子产生的热而对细胞有影响。

收稿日期：2006-12-21作者简介：杨 黠（1980-），男，四川自贡人，助教，主要从事生物大分子功能与结构方面的研究。

102 四川理工学院学报（自然科学版） 2007年8月1.3 颗粒轰击技术形象的说，由于基因较轻难得到电场加速，就把基因进行金属包层（选用金或钨），再安装在小塑料子弹头上，这样在电场加速下就有能量穿越器官、组织进入目的细胞中，当然在进入细胞前要用带小孔挡扳把塑料子弹滤去。

优点：避免了对单个靶细胞的操作，而对靶细胞所在区域进行了宏观操作。

缺点：不易做到无级调速，可控程度比较低[2]。

1.4 其他技术工作者常对采取的基因转移手段进行命名。

例如基因针、基因缝线，其实可以列入显微注射法。

超声导入类似电穿孔。

皮肤涂层利用基因和细胞接触而进行渗透。

这些都有上述的优缺点。

2 光镊子如何合理利用已有技术优势和其他技术相结合就成了目前发展的方向，显微技术具有高效的特点这正是工作者最想要达到的，但微注射器和基因存在尺寸的匹配问题，若利用光镊手段则可使显微注射法有很大提高，光镊子对原子分子包括基因进行细微操作，是通过调整入射光和改变光与微粒的作用时间来实现的。

它直接将目的基因嵌入靶细胞当中，达到了显微注射法转化效率高的特点，同时该手段可以对不同大小的基因进行操作，没有象显微注射器那样对基因大小有选择而存在耗材，加之光镊子没有污染并且它本身不携带污染，这些都克服了显微注射法的缺点，继承了优点，因此有很大应用价值。

以下对光镊子做一简单介绍。

2.1 基本原理简单的说可用光压或光子作用于微粒的动量改变来解释[3]。

用激光捕获和固定原子和分子犹如用镊子夹钳物体，生物学家称其为光子镊子[4]。

既然是镊子，那么它是如何操作诸如基因这样的大分子的呢？我们以会聚的激光束作用在酵母菌上的例子来说明：首先，被操作的微粒（Particle）比如酵母菌或是目的基因之类，应放在特定的溶液中如类似于人体的体液或是有机生物溶液，激光装置出来的光的功率是很小的，功率在几十或者几百微瓦，同时光并不是直接照射在微粒上面，而是通过了光纤聚焦探针（Lensed fiber probe），产生了满足便于操作的一束高斯光束，根据需要调整光束照射在微粒上的部位，这样就可以获得想要的操作目的。

如图1所示的光束照在微粒上可产生两个力，一个是径向的ax F 和横向的tr F 两个力[5]。

最后微粒在两个合的作用下就移动了。

如果再次调整入射光束作用在微粒的部位，微粒就可以向想要的方向前进。

2.2 力的量值通过对微粒的跟踪扫描，当然不是用人眼而是CCD 照相再从屏幕显示微粒的运动情况，最后根据微粒是匀速还是加速运动来计算力的大小。

可以忽略重力的作用，若是匀速则说明微粒处于力的平衡，由于它在液体中运动则存在液体间的内摩擦，只需用斯托克斯公式rv F η6=计算粘滞力就可以得到受光照的力的大小。

例如，溶液的粘滞系数ms kg /1013−×=η，微粒的半径m r µ5.2=，通过观察微粒发生的位移和时间得到速度s m v /7µ=，那么N F 13103.3−×=这也是光照的力的大小。

若是加速运动的话，则在粘滞力的基础上再加上另一项ma f =既微粒的质量乘上它获得的加速度，就是它受到的光照的力了，既ma rv F +=η6[5]。

这里有两点需要说明的是：首先，我们忽略了重力的影响，是因为重力计算的最后结果比光照的力计算小很多个数量级；其次，我们利用的无限宽广的斯托克斯公式，是因为在操作的过程中，微粒的尺寸比容器的尺寸小很多。

2.3 产生光镊的装置既然一束光对微粒可以产生力的作用，那么要把微粒“夹起”来就需要两束光了，如何获得两束光第20卷 第4期 杨 黠：光镊在基因治疗中的实现 103并成为光镊子呢？图2为我们展示了镊子的形成。

来自Ti:Sa（钛-蓝宝石）产生的激光经过棱镜L1和L2后被扩展，再通过半玻片和二向色性晶体便可分成偏振方向相互垂直的两束光，一束被具有压电效应的装置PZT 反射，其目的是将它能产生一定角度的偏转，一束被镜面反射，这样光镊子在这里就最初形成了。

被PZT 反射的光是可调节的，而被镜面反射的是固定的，就好比一把镊子样是需要两个头。

要夹住微粒的话，镊子的两个头的距离应该是很小的，经过C2后，两束光合二为一，成了名副其实的光镊了。

最后再经过镜面反射照到微粒上。

灯泡的目的是提供一个操作的背景光源，它也是经过镜面反射后和形成镊子的两束光一起照到微粒microscope objective 上的。

微粒上的这些光要再次反射经过棱镜L3而进入CCD 照相机，从CCD 实验者就可以对微粒操作了。

在棱镜L3和CCD 之间的滤色镜IR filter 是为了把有干扰的光滤掉。

PSD 是一个位置敏感探测器，它能反映光线的偏转，对PZT的调节光偏转提供一个反馈信息。

2.4 DNA 被拉伸了 有了光镊，我们可以更好的把握DNA 的一些特性，在光镊的作用下，来看看DNA 的可拉伸度和力的关系。

如图3所示。

关于DNA 的弹性表达和公式有很多，这里介绍最贴切的Odijk 公式。

⎟⎟⎟⎠⎞⎜⎜⎜⎝⎛+⎟⎟⎠⎞⎜⎜⎝⎛−=K F FL T L x p B 210211κ， x 是平均伸长，0L 晶体学长度，p L 存留长度，B κ玻尔兹曼常量，T 热力学温度，F 受力的大小，K 弹性系数[6]。

2.5 生命科学中的光镊 2.5.1 单细胞的研究 （1）细胞的俘获与分离：用光镊俘获细胞，通过分离细胞研究了细胞间的黏附作用，丰富了细胞黏附难的问题[7]。

（2）研究细胞的应变能力：光镊是对活体细胞非入侵式微观操作的有利工具，能够诱导细胞产生应变。

（3）测量红细胞膜的弹性：红细胞膜弹性是血液的生理功能指标，在测量红细胞膜弹性的技术中，光镊操作是最为直接和准确的方法[8]。

（4）促进细胞的融合：把光镊同微激光束偶联起来，实现了激光诱导细胞融合。

2.5.2 单分子的研究（1）研究生物大分子的力学特性及精细操作：生物大分子通常是被一个介质小球束缚，通过光镊操作小球来实现生物大分子的扭转或拉伸，从而反应生物分子的力学特性。

进而了解遗传物质同细胞骨架的缠绕，为在分子水平上解读生命的基本现象[7]。

（2）组装生物组件：用光镊排布分子形成稳定的空间结构，为纳米生物组件提供新的途径[8]。

（3）生命的调控：把人的志愿和意识加给分子，如转基因技术和基因治疗。

3 展 望（1）免疫调节中及其它配体—受体特异性分子识别的单分子机制及其生物学意义。

例如，应用纳米光镊技术研究人天然杀伤细胞特异性识别的单分子行为：天然杀伤细胞(NK)的NKG2系列受体分子和关键细胞因子受体分子与各自相应配基分子，在近天然状态下“人工配对”或“人工配群”式的相互识104四川理工学院学报（自然科学版） 2007年8月别，进而实现实时动态观察探测NK细胞在膜分子相互识别及作用后的单分子单细胞行为。

（2）马达蛋白分子的运动特性研究：例如，动点蛋白分子在有丝分裂程中的运动学和动力学特性，在分子层次上研究它对染色体运动的调节作用，从而更深入理解有丝分裂的机理。

总之，物理与生物高度交叉，新实验技术和方法与重大生物学基本问题相结合的纳米生物学领域正在兴起。

以光镊技术为核心的单个生物大分子的操控与检测技术，在这一新兴领域起着日益重要的作用。

光镊技术是光镊技术发展中的一个新高点，是一项富有活力的新兴技术[9]。

4 结束语光镊在生命科学中已经有广泛的应用，并显其高效和不带来外来污染的特点。

传统的基因治疗方法如化学方法和生物方法又比较纯熟，因此今后的发展趋势极可能是以光镊主导其他方法为辅助。

光镊作为新技术还是有一定局限的，如在具体的操作中光镊的光束和背景光之间有一定的视觉影响，如何提高分辨率使基因操作更细微等，还有待进一步的发展。