蜂蜜高效液相色谱指纹图谱的研究进展

摘要：指纹图谱技术在食品的质量控制中起着重要的作用。

本文主要介绍了高效液相色谱指纹图谱在蜂蜜研究中的应用，以期为蜂蜜的鉴定、质量控制及标准的制定等方面工作奠定基础。

关键词：蜂蜜高效液相色谱指纹图谱蜂蜜是一种传统的天然保健食品。

它是由蜜蜂采集植物的甜味分泌物，通过蜂蜜自身的消化，转化作用及蜜蜂通过气流干燥作用，使水分从花蜜中含６０％以上降低到２０％以下。

一般蜜蜂从采集花蜜到酿制为成熟蜜，正常情况下需要３～５ｄ时间［１］［２］。

糖类是蜂蜜的主要的成分，其中有单糖、双糖、低聚糖和多糖，单糖中的葡萄糖和果糖占蜂蜜总糖的５５％～７５％，而双糖和三糖的含量因蜜源种类的不同而变化。

此外，蜂蜜还含有多种蛋白质、氨基酸、脂肪酸、维生素及人体所必须的矿物质及微量元素，营养十分丰富［２］［３］。

多年来的科学研究与医学临床都证明，蜂蜜具有促进食欲、改善肠胃功能、促进消化吸收、镇静安神、提高肌体免疫能力，促进儿童生长发育等功效；它不仅对婴幼儿、运动员、老人及体弱多病者、重体力劳动者、高强度脑力工作者来说是一种直接有效的营养补充来源，而且对治疗烧伤、烫伤、溃疡愈合、促进伤口愈合及心血管病的辅助治疗等方面来说有很好的疗效［４］｛５］。

蜂蜜作为一种营养丰富、易被人体吸收的天然食品在国内外市场上深受消费者欢迎。

为规范蜂蜜市场，保证消费者的利益，我国于１９８２年和２００２年分别颁布了蜂蜜行业标准和推荐性国家标准；但是目前就蜂蜜质量来说，全国各地在蜂蜜生产、流通中仍存在很多不规范的环节，更甚的是出现许多人为掺杂假使的行为，而当前的国家标准不能满足快速、准确的检测需要。

高效液相色谱指纹图谱技术已经广泛的应用于食品行业，特别是药物化学中的中药指纹图谱已经取得了重大的进展。

在蜂蜜市场较为混乱且没有准确、快捷的检测方法的情况下，期望建立蜂蜜的高效液相色谱指纹图谱成为必然的趋势。

１．指纹图谱的含义“指纹（Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｓ）”识别技术起源于１９世纪末２０世纪初的犯罪学和法医学。

作为一种综合、宏观的和可量化的鉴别手段的指纹图谱，是指经过适当的处理后，采用一定的分析手段如光谱或图谱，得到能够标示该样品特征的色谱或光谱的谱图或图象。

在完整地呈现出色谱的特征“面貌”的前提下，表达了对照品与待测样品指纹图谱的相似性，用以产品真伪鉴别，评价其质量的均一性和稳定性。

蜜源植物的花蜜是蜂蜜的主要来源，由于同种蜜源植物具有整体的遗传相似性，因此，同一种类的单一花蜜在成分上也具有相似性。

同时，经采集、酿造后的成熟蜂蜜其成分除糖类的含量有明显变化外，来源于蜜源植物的次生代谢物质等微量活性成分一般不会发生较大的变化，这使指纹图谱技术应用于蜂蜜种类和真伪鉴别成为可能。

借助于现代分析技术对蜂蜜中主要特征功效成分信息以图形（图像）的方式进行表征并加以描述，这就是蜂蜜指纹图谱的内涵［１８］。

２．指纹图谱的种类指纹图谱已广泛的应用于食品品种和质量的鉴别，其根据测定方法的不同，大体分为色谱指纹图谱、光谱指纹图谱和ＤＮＡ指纹图谱。

其中，以高效液相色谱指纹图谱应用最为广泛。

２．１色谱指纹图谱色谱技术种类繁多，是获得指纹图谱的最常用的方法。

其中，高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）是应用最多的一种方法，６０％～７０％的有机物均可应用，具有高压、高速、高效、高灵敏度等特点，是所有光谱色谱分析中最适合绘制指纹图谱的方法。

近２０多年来，随着仪器和柱技术、样品预处理技术的发展成熟及仪器的日益普及，ＨＰＬＣ作为食品中的营养成分、功能因子、食品添加剂及污染物的一种快速、准确、易于自动化的检测手段，在食品分析中的应用发展很快；高效液相色谱－质谱（ＭＳ）联用，能够将未知成分的各峰进行归属；当前，高效液相色谱已经用于蜂蜜某些糖分的定量与定性的常规分析；反相液相色谱在类黄酮成分分析方面也有很多的报道［６］。

薄层色谱（ＴＬＣ）法出现于１９５６年，具有操作简单，展开剂组成灵活多样，色谱后衍生方便，可以提供色彩斑斓蜂蜜高效液相色谱指纹图谱的研究进展西南大学食品学院王文静的彩色图像，直观易辨的特点；气相色谱（ＧＣ）法适合于挥发油及其制剂的指纹图谱的研究和应用；高效毛细管电泳（ＨＰＣＥ）法可鉴别大分子物质，是近年发展起来的新的分析技术，从根本上解决了ＨＰＬＣ的柱效问题，它集ＨＰＬＣ与电泳技术的优点于一身，使组分的分析范围更广、更灵敏。

２．２光谱指纹图谱光谱指纹图谱包括：红外（ＩＲ）指纹图谱、紫外（ＵＶ）指纹图谱、核磁共振谱（ＮＭＲ）指纹图谱、质谱（ＭＳ）ＥＩ－Ｓ图谱等。

红外光谱（ＩＲ）是纯物质组分鉴定的权威方法；紫外光谱（ＵＶ）特征的差异，在一定程度上反映了供试样品化学成分的差异。

紫外和红外光谱具有加和性，对于混合物来说，其鉴别专属性差，分辨率低，需借助计算机模式识别技术或模糊数学方法进行处理。

２．３ＤＮＡ指纹图谱随着现代分子生物学的发展，物质鉴别的手段从宏观形态拓展到微观的遗传物质ＤＮＡ领域。

由于同种生物体具有相同的ＤＮＡ序列，可依据其差异来鉴定生物物种［９］。

此项技术已经成功的应用于中药材和苹果品种的鉴定研究。

３．高效液相色谱指纹图谱的研究进展３．１食品领域高效液相指纹图谱的应用在过去的几十年中，指纹图谱在食品领域的其他的产品质量控制中已取得了研究性进展。

２００４年，魏永生等［７］发表了青海油菜蜂花粉黄酮类化合物的含量研究一文。

此研究采用正交试验设计，研究得出青海油菜蜂花粉中黄酮类化合物的最佳提取条件———９５％的乙醇作为溶剂，以１０倍总量的乙醇用量，水浴热回流提取。

试验还分别采用ＨＰＬＣ法和比色法测定了黄酮类化合物的含量，研究结果表明，以槲皮素、山奈酚、异鼠李素为对照品，采用ＨＰＬＣ法，测定出黄酮类化合物平均含量为３．１９４％；以芦丁为对照物，采用比色法，测定出总黄酮平均含量为３．７０％。

２００５年８月，魏新军［８］发表采用高效液相色谱建立了保健酒的石油醚－乙醚提取物的指纹图谱。

通过分析比较色谱指纹图谱中的相对保留值α和相对面积Ｓｒ，对不同批次的保健酒进行对比研究，并确定出标准图谱（见图１）。

结果表明，该法简便可靠，对保健酒的质量控制效果明显。

２００５年１０月，朱丽敏［９］着重以食用油、橙汁和奶制品为例，阐述了气味指纹分析法对食品所建立的新型质量控制和风味的研究方法。

分析结果表明，该分析技术具有以下优点：满意的分析灵敏度和重复性，而且该分析方法无需样品前处理。

图１中国劲酒指纹图谱２００５年，吴继红［１０］对果汁特征理化指标指纹图谱及指纹图谱信息解析技术等相关问题进行论述，对建立科学合理的控制和评价果汁质量、果汁防伪方法等方面的研究工作进行初探。

周萍等［１１］从蜂胶的功效成分－黄酮类化合物着手测定了真品蜂胶、杨树胶和搀假蜂胶的ＨＰＬＣ指纹图谱。

结果表明，真品蜂胶含有１９个特征峰中的１８个特征峰，缺６号峰；杨树胶含有１９个特征峰中的１７个特征峰，缺７号和１１号峰；搀了杨树胶的搀假蜂胶，含有６号峰，而７号峰和１１号峰的峰面积显著降低，为蜂胶真伪的有效鉴别提供依据。

３．２蜂蜜高效液相指纹图谱的研究进展卢太白等［１２］通过对１０种不同来源、不同种类蜂蜜样品品质的理化性质检测与掺假鉴别测试得出：总糖、还原糖的检测方法仅适合对来源可靠的真蜂蜜检测，不适用于掺假手法繁多的掺假蜂蜜检测。

而国标检测食品中还原糖、蔗糖的方法为化学法，无法将果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖区分开来，且测定结果常常比实际结果偏高，因此一些学者提出高效液相指纹图谱指纹图谱在蜂蜜质量鉴别中的应用，而目前我国这方面的研究很少，并主要集中于糖类的研究。

１９９３年，张存洁［１３］采用ＭｉｒｃｏＰａｋ－ＮＨ２（３００×４㎜）键合柱，示差折光检测器，乙腈－水（７５：２５）体系，流速为２．０ｍｌ／ｍｉｎ，通过中途改变检测灵敏度，一次进样同时检测蜂蜜中的四种糖份，整个色谱分析在８分钟内完成对果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的最小检出量分别为１２０×１０－３ｍｇ、１００×１０－３ｍｇ、２２×１０－３ｍｇ和４４×１０－３ｍｇ；分析变异系数小，平均添加回收率高。

１９９５年，Ｇｏｏｄａｌｌ［１４］采用高效液相色谱法，以麦芽四糖为内标物分析了９１种蜂蜜样品，从中发现了５０种低聚糖。

实验结果表明，各种蜂蜜的低聚糖色谱图均有其特征，根据它们的特征和各种低聚糖的定性及相对定量结构可以鉴别蜂蜜的类型和真伪。

范崇阳等［１５］在高效液相色谱测定蜂蜜中的糖类的研究一文中采用氨丙烷基硅胶柱，乙腈－水为流动相，以鼠李糖作内标，用示差折光检测器测定（见图２、图３）。

实验发现：在实验条件下，用乙腈－水（４：１）能分离蜂蜜中的各种糖分，其中包括一些还未被鉴定出的可能属于双糖的未知峰，它的位置在蔗糖和麦芽糖之间；水溶样品对保留时间和峰高稍有影响，试样和标准可采用等容积进样消除这一误差。

图２Ａ，标准溶液２组２０微升图３Ａ，Ｂ同图２Ｂ，１０％蜂蜜（紫云英Ｆ００５）２０微升流动相：乙腈－水（３：１）流动相：乙腈－水（４：１），流速：２．２毫升／分流速：２．２毫升／分峰序同图２峰序：１，果糖２，葡萄糖３，蔗糖４，麦芽糖５，未知２００１年吴艳华［１６］等人在《应用技术》中发表采用液相色谱法，蜂蜜样品经水解后，以鼠李糖作为内标，差示折光检测器检测，可以快速、灵敏、准确的直接分离和测定蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖含量，为蜂蜜指纹图谱的建立奠定基础。

２００２年高燕红［１７］在《中国卫生检验杂志》中发表用高效液相色谱法测定食品中的葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖，葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖在４．００×１０－３ｍｇ／ｍｌ～２０．０×１０－３ｍｇ／ｍｌ范围内线性良好，葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖的回收率分别为９７．５％、９５．１％、１００．９％、９８．３％，方法重现性好、结果准确，并明确指出此方法可用于鉴别蜂蜜产品的真假。

２００６年西北大学的曹炜［１８］等人在《中国蜂业》中发表的ＨＰＬＣ指纹图谱在蜂蜜种类识别中的应用研究一文中综述了指纹图谱在蜂蜜研究中的可行性和现实意义。

２００６年ＣｒｉｓｔｉａｎｅＢ．Ｃａｎｏ［１９］等对高效液相色谱分离蜂蜜中糖分的流动相配比进行优化设计，研究结果表明，乙腈－水流动相中加入乙酸乙酯，促进糖类化合物的分离，以便蜂蜜中某些成分的定量分析；并推荐在蜂蜜样品糖类化合物的分离研究中使用乙腈－水－乙酸乙酯体积比为５０：１０：４０流动相。

近年来国外对蜂蜜的成分的研究表明，蜂蜜中存在微量的生物活性物质，如黄酮类化合物、酚酸类物质。

不同的单花蜂蜜，其特征成分存在很大的差异，采用指纹图谱技术研究不同蜂蜜中的微量生物活性物质和和非活性物质，可以有效区分不同蜜源的植物来源的蜂蜜，而且可以应用于蜂蜜的质量控制中，尤其在鉴别蜂蜜种类、判别真假蜂蜜中。