水稻遗传转化体系Protocol

水稻遗传转化体系Protocol

Introduction

1．水稻的遗传转化研究历史与现状

20 世纪80年代末, 水稻的遗传转化首获成功。1988 年, 3 个不同的研究小组以水稻原生质体为受体,采用“电击法”或“PEG 介导法”等方法将外源

3]。1991 年, 基因枪转化的方法在水稻中基因导入到水稻中并获得再生植株[1

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获得成功[4],随后成为水稻遗传转化的常用方法之一。1993 年，Chan 等人[5]首先采用农杆菌介导的方法获得了转基因水稻。Hiei 等人[6]以水稻成熟种子诱导的愈伤为受体, 建立了农杆菌介导的粳稻高效转化体系, 使得农杆菌介导法逐渐成为了水稻转化最常用的方法。此后, 粳稻的转化方法被进一步优化, 使粳稻的遗传转化周期大幅缩短[7]。虽然Hiei等[6]建立的农杆菌介导的转化体系使得粳稻的转化不再困难, 但是许多籼稻的转化依然存在障碍, 主要是转化效率低下。因此, 一些研究者对籼稻的转化体系进行了一些优化, 使得籼稻的转化效率得到了一定的提高[8,9]。最近, Hiei 和Komari[10]发表了一个粳稻和籼稻均适用的农杆菌高效转化的方法.根据他们的结果, 采用幼胚作为外植体, 籼

13 个稻的转化可以在两个半月内完成，且转化效率非常高(一个幼胚可以得到5

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独立的转化植株)。

2. 转基因技术在水稻上的研究与应用[11]

a. 转基因抗虫水稻

对于水稻最主要的害虫——螟虫(二化螟、三化螟、稻纵卷叶螟等)在水稻中尚未发现有效的抗性种质资源. 目前,最有希望和前途的方法就是利用转基因技术把外源抗虫基因引入水稻中创造出新的抗虫品种。虽然水稻中已经发现和鉴定了19 个抗褐飞虱的基因[12], 但是由于褐飞虱有多个生物型且易产生变异, 抗性品种往往推广数年后就会失去抗性。

b. 转基因抗病水稻

见抗水稻病毒研究

c. 转基因抗旱水稻

d. 转基因营养高效利用水稻

e. 转基因优质水稻

f. 转基因高产水稻

g. 转基因抗除草剂水稻

3.转基因技术在水稻抗病毒基因工程上的应用

随着RNA干扰技术（包括siRNA和miRNA介导的RNA干扰）在抗病毒

18 ]，结合RNA干扰技术和水稻遗传转化技术基因工程上的广泛研究和应用[13

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来研究水稻，获得对水稻病毒高抗的品系越来越受研究人员的重视，成为国内外水稻病毒研究的热点。目前，国内在这方面属于起步阶段，仅仅做了一些构建干

27]，但并没有获得高抗植株，国外，特别是日扰载体和获得RNA干扰植株[19

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本在这方面有着较大优势，Omura T实验室分别在2009年和2010已获得了对RDV、RSV高抗植株[28，29]，另外Himani在2007年也获得了对RTBV高抗的植株[30]。（重要是看以上文献，一定要认真体会）

Materials and methods

一、接种

步骤：

1、保存在-20度的种子使用前取出（用多少取多少，用纸包好），置于37度恒

温箱烘烤10-20小时左右（最好过夜）。

2、拨去种皮（1），尽量不要损害到种胚，拨皮后检查，将胚乳表面发黑或胚死

亡的种子剔掉（2），用纸包好带入组培操作间。

3、（以下操作均在超净工作台内进行）将种子倒入干净的100ml三角瓶中，加

入75%乙醇消毒2分钟，期间要不断的摇动，倒出酒精，再加入20ml 2%的NaClO(3),覆盖种子即可，室温在摇床上160rpm摇25min，将NaClO倒掉，将种子用无菌镊子转移至高压灭菌过的滤纸上，在超净工作台上吹干为止，然后将种子接入诱导培养基（NB培养基）（5）上，每皿20粒（4），注明日期，封口膜封口，置于27℃恒温箱中暗培养（15）；

二、掐芽

种子在培养箱中培养7天后，长出可见的芽和遁片，根据种子的生长状态，

将芽掐掉（16），继续在27°C恒温箱中暗培养。

三、继代

掐芽后7天左右，进行第一次继代，用镊子将新长出的愈伤夹成小块（17），转入新的NB培养基中，每皿20粒，在27度恒温箱中暗培养15天后进行第二次继代，培养15天后，就可以长出颜色鲜黄，表面光滑，直径大小为2-3mm的胚性愈伤组织颗粒。大小合适的愈伤可以进行预培养，小的就进行第三次继代。四、农杆菌介导的水稻遗传转化

共培养（整个操作过程需8天）

第一天：选取自然分散，颜色鲜黄，直径约为2-3mm的颗粒愈伤，置于27度暗培养4天。

第三天：农杆菌划线28°培养，两天后农杆菌长满即可洗脱（18），用于转化。

第五天：悬浮农杆菌，悬浮于添加有100uM乙酰丁香酮（AS）(19)20ML的AMM液体培养基(20)中，剧烈震荡1min后，静置1h，让农杆菌形成悬浮液，取菌液于三角瓶中加入经预培养的愈伤，略微摇动静置30min，于无菌纸上晾干愈伤后置于添加有100uM的乙酰丁香酮的NB培养基（AS培养基（21）上27度暗培养3天。

第八天：等农杆菌生长至可见的愈伤下的菌斑，但未长满愈伤时，挑取愈伤于无菌培养瓶中，用无菌水冲洗，直至无可见菌丝为止，最后用含300mg/l的羧苄无菌水静置1h，置于无均滤纸上晾干后，转移至筛选培养基上。

五、抗性愈伤的继代筛选

当抗性愈伤在朝霉素30培养基（22）上生长15天后（23），将愈伤换到新的朝霉素30培养基上，15天后可观察到一些褐化愈伤开始长出的新的愈伤，继续培养，等新愈伤长出很多时转移至朝霉素50培养基（24）上，筛选3-7天。

六、分化

从朝霉素50培养基中将继续增生分裂的抗性愈伤转入分化培养基（25）上再生，成团而不是分散放置（26），一周后愈伤开始转绿，三周后开始长出幼芽，随后根也长出，当芽长至2-3cm时，就可移至1/2MS培养基（生根培养基）上（27）。

分化间进行，25°（28），光14小时，暗10小时。