水稻遗传转化体系Protocol
水稻广亲和基因S5-n遗传转化分析及水稻OsAP蛋白家族分析的开题报告
水稻广亲和基因S5-n遗传转化分析及水稻OsAP蛋白家族
分析的开题报告
标题：水稻广亲和基因S5-n遗传转化分析及水稻OsAP蛋白家族分析
背景：水稻是世界上重要的粮食作物之一，但受到各种胁迫因素的影响，如盐碱、干旱等，导致其产量下降。
因此，学者们致力于研究水稻的遗传转化和蛋白家族，以
求得提高其适应性和生产性。
研究内容：
1. S5-n基因由于其广泛亲和力和较强的耐盐性而备受关注。
本研究将运用CRISPR-Cas9技术将S5-n基因引入水稻，通过遗传转化分析，探究S5-n基因对水稻
的影响和提高水稻耐盐性的途径。
2. OsAP（Alkaline Phosphatase）是一类磷酸酶蛋白家族，参与了许多生物学功能。
本研究将会分析水稻中OsAP家族的成员及其功能，为深入研究水稻生长发育和
抗胁迫机制提供基础。
研究意义：通过本研究，可以探究水稻的遗传转化和蛋白家族，理解水稻的生物学机制，提高水稻的抗胁迫能力和产量，为粮食生产做出贡献。
研究方法：本研究将运用CRISPR-Cas9技术将S5-n基因引入水稻，对遗传转化的水稻进行生理生化指标测定和耐盐性测试。
对OsAP家族的成员和功能进行分析，
采用生物信息学手段进行序列分析和结构预测。
预期结果：本研究预计可以得出以下结果：S5-n基因可以增加水稻的耐盐性，
提高其适应性和生产性；对OsAP家族的成员和功能进行分析，可以为水稻的生长发
育和抗胁迫机制提供基础。
研究限制：由于技术和时间的限制，可能不能探究出水稻中所有的OsAP家族成员和功能，研究结果仅是初步探究水稻遗传转化和蛋白家族的机制。
水稻遗传转化与改良研究
水稻遗传转化与改良研究水稻是中国传统的重要粮食作物之一，也是世界上最重要的粮食作物之一。
在中国，种植水稻被认为是一项非常重要的农业工作，因为它涉及到亿万人民的生计。
水稻遗传转化与改良研究，就是在这一背景下诞生的。
下面，我将从水稻遗传变异、水稻遗传转化和水稻遗传改良的角度入手，谈论水稻遗传转化与改良研究的内容及其意义。
一、水稻遗传变异水稻的遗传变异是指水稻基因组内的基因序列多样性。
一个基因序列对应着一个或多个基因，它们的差异性共同组成了水稻的遗传多样性。
水稻遗传变异的产生原因很多，比如基因重组、突变、外源基因导入等等。
在自然条件下，水稻的遗传变异是非常缓慢的，甚至可能需要数十年乃至数百年的时间，才能形成明显的遗传多样性。
而在科学研究中，我们可以采用人工方式来诱发、加速水稻的遗传变异。
例如，通过辐射、化学物质等方式来加速水稻基因重组和突变，或者将外源基因导入水稻中，从而实现水稻遗传变异。
水稻遗传变异的意义：水稻遗传变异是实现水稻遗传转化和改良的前提。
种植业界的经验表明，在保证水稻的生产安全和品质的同时，保持一定的遗传多样性，能够让水稻对环境变化更有抵抗力，育种更容易取得成功。
此外，基因变异还是新基因发掘和利用的重要途径之一，也是进一步理解水稻基因功能的重要途径之一。
二、水稻遗传转化水稻遗传转化是指将外源基因和其他物质导入水稻细胞、组织或个体中，从而实现水稻基因型的改变或性状的增强。
水稻遗传转化是一项非常复杂而微妙的工作，需要兼顾技术、所需物质、对种植业的影响等多种因素。
因此，在进行水稻遗传转化之前，必须做好充分的前期准备工作，包括建立适宜的目标基因、筛选合适的携带者和接受者、合理设计导入方案、筛选鉴别基因等等。
水稻遗传转化的意义：水稻遗传转化是实现水稻遗传改良、提高水稻品质和产量的关键手段之一。
它可以帮助我们更快地选育出优良新品种，增加水稻并能力和适应性，同时也可以开拓水稻种植业的新路径和新区域，为全球化的水稻种植提供更为丰富的选择。
水稻的遗传转化
水稻的遗传转化1）种子消毒：用75%乙醇浸泡去皮的水稻种子1min（剧烈摇动），再用2.5%的次氯酸钠分别处理两次，每次15min，然后用无菌水冲洗3-5次后均匀铺于诱导培养基上，不宜过多，一个培养皿大概14-20粒。
2）水稻愈伤组织的诱导和继代培养：消毒好的成熟种子在诱导培养基上28℃暗培养25-28天。
待愈伤组织长至合适大小，在培养基中来回剧烈摇动几次，使一些小块愈伤从大的组织块上脱离，从中挑选光滑、淡黄色、较硬、大小在2-3mm的胚性愈伤，均匀铺放在继代愈伤培养基上，28℃避光培养7-8天，即可用于农杆菌转化。
3）农杆菌介导的水稻愈伤组织转化及共培养：刮取已活化3天的农杆菌，放入液体共培养培养基中，用力打散，置摇床摇培0.5-2h，使得菌液的OD600在0.1-0.15（0.125最宜）之间。
将挑选的愈伤组织小粒放入已加农杆菌的液体培养基中，轻轻摇动几次，放置15-20min。
倒去菌液，用无菌滤纸吸干均匀的铺在已加滤纸的共培养基中。
愈伤在共培养培养基中22℃条件下暗培养3天。
4）转化愈伤组织的选择培养：共培养后的愈伤先用灭菌水洗涤三次，后用含头孢500mg/L的灭菌水浸泡30min，期间轻轻摇动，之后用滤纸吸干，均匀铺放在选择培养基上，28℃暗培养10天，之后进行第二次筛选，挑选淡黄色、生长状态良好的愈伤，均匀铺放在含潮霉素和头孢的选择培养基中，28℃暗培养15天。
5）愈伤组织的分化培养：挑选黄色、圆形的愈伤组织，均匀铺放在预分化培养基上，28℃暗培养7天。
之后挑选生长状态良好、淡黄色的胚性愈伤，放入分化培养基上，28℃光照培养30-60天左右，直至转基因小苗长出。
中间每隔25天左右将愈伤转移到新鲜的分化培养基上。
6）水稻的壮苗培养与移栽：将长出的小苗去掉周围的愈伤，在无菌条件下转移到1/2MS的壮苗培养基中，使根部浅插入培养基中，28℃光照培养（14h光/10h暗）。
当苗长至瓶口、约10cm以上时，打开瓶口所覆塑料膜，瓶内加入约1/3 的水，使苗暴露于空中炼化培养。
水稻遗传转化实验学习体会
水稻遗传转化实验学习体会
水稻（Oryzasativa）是世界上最主要的粮食作物之一。
近年来，DNA重组技术、遗传操作技术、水稻基因图谱的研究取得了显著发展，美国Monsanto公司2000年4月、Syngenta公司2001年2月先后宣告完成粳稻日本晴（Nipponbare）基因组测序草图。
我国也已宣布完成籼稻9311的序列框架图。
目前以大规模分离、鉴定基因组序列功能为特征的水稻功能基因组研究正在迅速发展，而这一研究之后必然是依托于高效的水稻遗传转化体系，因此水稻遗传转化研究越来越成为人们关注的焦点。
水稻遗传转化体系已比较完善，农杆菌介导法、基因枪法、PEG 法、花粉管通道法等方法均在水稻遗传转化中应用并获得转基因植株，但目前用的最多的方法是基因枪法和农杆菌介导法。
禾谷类作物由于不是农杆菌的天然宿主，曾一度限制了农杆菌介导法转化水稻。
基因枪法由于其没有宿主限制，对单子叶和双子叶植物都能进行有效地转化，因而得到了很大的发展。
农杆菌EHA105转化条件的优化及水稻愈伤组织遗传转化体系的初步建立
农杆菌EHA105转化条件的优化及水稻愈伤组织遗传转化体系的初步建立：以质粒PBI121和gfp作为外源DNA转化农杆菌EHA105，通过对EHA105生长状态的测定，并对重悬液Cacl浓度，速冻时间和热处理温度等实验条件逐一进行筛2选，以确定EHA105的最优转化条件。
然后，分别用被转化的农杆菌侵染水稻愈伤组织。
结果表明，农杆菌 OD值接近0.6经过20mmol/L Cacl2重悬细胞，液氮速冻5600分钟后于28?处理5分钟，农杆菌的转化效率最高。
愈伤组织经GUS染色或荧光观察，外源基因已经转入水稻种子中。
农杆菌；水稻愈伤组织；遗传转化: Agrobacterium tumefaciens EHA105 was transformed by the plasmid PBI121 and gfp. To difine the best experimental conditions for transformationof A.tumefaciens the growth rate of the A.tumefaciens EHA105 was measured ,andthe concentration of resuspension solution,freezing time and the thawingtemperature were tested. And then infected mature rice in order to inducecallus with Agrobacterium tumefaciens respective .Result: By resuspended inCaclbuffer, frozen in liquid nitrogen for 5 min and thawed in 28? for 5 2min, the efficiency of transformation was the best. The callus was dyed byGUS or seen by fluorescence, which can testify that exterior gene has beentransferred into rice.Agrobacterium tumefaciens; rice callus; Genetic transformation水稻是世界上重要的粮食作物，并已为分子生物学研究的模式作物之一。
农杆菌介导水稻快速转化-Bio-protocol
农杆菌介导水稻快速转化Agrobacterium-mediated Rapid Transformation of Rice崔莹，蔡朝霞，林拥军，陈浩*作物遗传改良国家重点实验室，华中农业大学，武汉*通讯作者邮箱：hchen@引用格式：崔莹，蔡朝霞，林拥军，陈浩. (2018). 农杆菌介导水稻快速转化. Bio-101 e1010176. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010176.How to cite: Cui, Y., Cai, C. X., Lin, Y. J. and Chen, H. (2018). Agrobacterium-mediated rapid transformation of rice. Bio-101 e1010176. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010176. (in Chinese)实验原理：Toki等(2006)发现，水稻成熟胚在诱导愈伤1 d后可以被农杆菌侵染，诱导愈伤5 d后可以被高效转化。
Toki (1997)研究表明在32 °C、光照条件下，水稻愈伤组织可以快速分裂。
在该条件下进行筛选培养，14 d可以得到明显的抗性愈伤组织。
本实验的目的是在实验室已有的遗传转化方法基础上，参考Toki等(1997，2006)发表的部分实验参数，建立快速的水稻转化方法，以缩短遗传转化周期。
本实验在32 °C、光照条件下诱导愈伤，对诱导5 d的水稻愈伤组织进行侵染，随后在32 °C、光照条件下以潮霉素作为筛选剂进行筛选培养，14 d后获得了抗性愈伤组织，对抗性愈伤组织进行分化培养，获得稳定的转化植株。
从愈伤组织诱导到转化再生植株生根，整个实验周期约为50 d。
关键词：水稻成熟胚，农杆菌介导，快速转化材料与试剂1. 滤纸2. 水稻种子3. 75%酒精4. 吐温205. 农杆菌菌株EHA105 (携带含目的基因载体)6. 6-Benzylaminopurine (6-BA) (Sigma, catalog number: B-3408)7. Kinetin (KT) (Sigma, catalog number: K-0753)8. Naphthalene acetic acid (NAA) (Sigma, catalog number: N-0640)9. Indole-3-acetic acid (IAA) (Sigma, catalog number: I-2886)10. 2, 4-Dichlorophenoxyacetic acid (2, 4-D) (Sigma, catalog number: D-7299)11. Kanamycin (USB, catalog number: 17924)12. Casein Enzymatic Hydrolysate (CH) (Sigma, catalog number: N-4642)13. Carbenicillin (Cn) (Bio Basic INC. catalog number: CDJ469)14. Hygromycin B (Hn) (Roche, catalog number: 10843555001)15. Nicotinic acid (Sigma, catalog number: N-0765)16. Pyridoxine HCl (VB6) (Sigma, catalog number: P-8666)17. Thiamine HCl (VB1) (Sigma, catalog number: T-3902)18. Inositol (Sigma, catalog number: I-3011)19. Phytagel (Sigma, catalog number: P-8169)20. Dimethyl Sulfoxide (DMSO) (Sigma, catalog number: D-5879)21. Acetosringone (AS) (Aldrich chem., CO 01531 EG)22. Agar powder (日本分装，catalog number: BM0212)23. Glycine (日本分装，catalog number: BA0802)24. Proline (进口分装，catalog number: A1122)25. D-sorbitol (上海生工，catalog number: SB0491)26. NH4NO327. KH2PO428. KNO329. MgSO4·7H2O30. CaCl2∙2H2O31. MnSO4·4H2O32. ZnSO4·7H2O33. H3BO334. KI35. Na2MoO4·2H2O36. CoCl2·6H2O37. CuSO4·5H2O38. (NH4)2SO439. FeSO4∙7H2O40. Na2EDTA∙2H2O41. KOH42. HgCl243. Glucose44. Sucrose45. LB培养基46. 封口胶47. MS max储备液(10x) (见溶液配方)48. MS min储备液(100x) (见溶液配方)49. N6max储备液(10x) (见溶液配方)50. N6min储备液(100x) (见溶液配方)51. Fe2+-EDTA储备液(100x) (见溶液配方)52. Vitamin储备液(100x) (见溶液配方)53. 6-BA储备液(1 mg/ml) (见溶液配方)54. KT储备液(1 mg/ml) (见溶液配方)55. 2, 4-D储备液(1 mg/ml) (见溶液配方)56. IAA储备液(1 mg/ml) (见溶液配方)57. NAA储备液(1 mg/ml) (见溶液配方)58. 200 mM AS储备液(见溶液配方)59. 1 N KOH储备液(见溶液配方)60. 0.15% HgCl2 (见溶液配方)61. 50% 葡萄糖(见溶液配方)62. 250 mg/ml Cn (见溶液配方)63. 50 mg/ml Kan (见溶液配方)64. 诱导培养基(见溶液配方)65. 悬浮培养基(见溶液配方)66. 共培养基(见溶液配方)67. 筛选培养基(见溶液配方)68. 分化培养基(见溶液配方)69. 生根培养基(见溶液配方)仪器设备1. 超净台2. 酒精灯3. 镊子4. 平皿5. 三角瓶6. 生根管7. 摇床8.培养箱实验步骤1. 愈伤诱导选取成熟饱满的水稻种子，去壳；75%酒精消毒1~2 min，倒去酒精；用灭菌蒸馏水冲洗2次；加入0.15%的升汞(含有0.1%的吐温20)浸泡15~18 min，其间摇动数次；倒掉升汞，用灭菌蒸馏水冲洗5次。
水稻遗传转化步骤
实验流程：种子灭菌（ms+, 28天，暗培养，28℃）---愈伤继代（ ms,7天，28℃自然光照）--转化共培养（co,暗培养3天，上面放一层滤纸19℃，很重要！）---第一次选择（S500，暗培养15天，28℃）---第二次选择（S500，暗培养15天，28℃）---第三次选择（选抗性愈伤，S250，暗培养7天，28℃）---预分化（m,暗培养8天，28℃）---第一次分化（f,先暗培养2天，28℃，后光照13天）---第二次分化（ f，光照15天）---壮苗（1/2，光照，时间不定）种子灭菌：（1）用75%酒精泡5分钟，倒出酒精，加2.5%次氯酸钠摇10分钟以上（2）倒出次氯酸钠，再加2.5%次氯酸钠15-20分钟，猛烈摇动，在超净台上倒去次氯酸钠，用灭菌水洗10次以上，然后放于滤纸上吸干，接种于ms+培养基。
共培养处理：种子愈伤处理28天左右，挑优质愈伤继代培养一次，挑颗粒用农杆菌浸泡15分钟，共培养三天后，挑无褐色愈伤颗粒，用灭菌水洗三次，放入NBL中，摇床摇2小时（200rpm），滤纸吸干后放入筛选培养基S中。
培养基配制；接种培养基（ms+）MS大量，微量，有机，2，4-D（2mg/L）Fe-EDTA，肌醇（0.1g/l）,蔗糖30g/l, 脯氨酸2.8g/l, 水解酪蛋白0.3g/l, phytagel3g/l接种继代培养基（ms）MS大量，微量，有机，2，4-D（1mg/L）Fe-EDTA，肌醇（0.1g/l）,蔗糖30g/l，Phytagel 3g/l共培养培养基（co，pH5.3）N6大量，B5微量，B5有机，2，4-D（1mg/L）Fe-EDTA，硝酸银1ml/l，肌醇（0.1g/l），蔗糖30g/l，葡萄糖10g/l，phytagel（3g/l），灭菌后加AS20mg/lNBL：就是co加上头孢500mg/l，不加AS选择培养基S500N6大量，B5微量，B5有机，2，4-D（1mg/L）Fe-EDTA，硝酸银1ml/l，肌醇（0.1g/l）,蔗糖30g/l, 脯氨酸0.5g/l, 水解酪蛋白0.3g/l, phytagel3g/l灭菌后加头孢500mg/l，潮霉素50mg/l抗性愈伤继代培养基（S250）N6大量，B5微量，B5有机，2，4-D（1mg/L）Fe-EDTA，硝酸银1ml/l，肌醇（0.1g/l）,蔗糖30g/l, 脯氨酸0.5g/l, 水解酪蛋白0.3g/l, phytagel3g/l灭菌后加头孢250mg/l，潮霉素50mg/l成熟培养基（m）N6大量，B5微量，B5有机，NAA1mg/l，Fe-EDTA，肌醇（0.1g/l）,蔗糖30g/l, 脯氨酸0.5g/l, 水解酪蛋白0.3g/l, phytagel3g/l灭菌后加头孢250mg/l，潮霉素50mg/l，ABA3mg/l，BA2mg/l分化培养基（f）N6大量，B5微量，B5有机，NAA0.5mg/l, Fe-EDTA，肌醇（0.1g/l）,蔗糖30g/l,水解酪蛋白0.3g/l, phytagel4.6g/l灭菌后加BA3mg/l壮苗培养基（1/2）MS大量，微量，有机，Fe-EDTA，肌醇（0.1g/l）,蔗糖30g/l，Agar5.8g/l 注：2，4-D浓度为2mg/l，溶于0.1NNaOH或酒精硝酸银浓度为0.85mg/ml，避光保存。
水稻基因遗传转化方法研究进展
华南农业大学学报 Journal of South China Agricultural University 2023, 44(6): 843-853DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.202307001郭涛, 沈任佳, 王加峰. 水稻基因遗传转化方法研究进展[J]. 华南农业大学学报, 2023, 44(6): 843-853.GUO Tao, SHEN Renjia, WANG Jiafeng. Research progress on genetic transformation methods of rice[J]. Journal of South China Agricultural University, 2023, 44(6): 843-853.特约综述水稻基因遗传转化方法研究进展郭 涛 ，沈任佳，王加峰(华南农业大学 农学院/国家植物航天育种工程技术研究中心, 广东 广州 510642)摘要: 介绍水稻遗传转化方法的发展历程和科研成果，为水稻遗传转化体系的研究和应用提供借鉴。
从生物介导转化法和非生物介导转化法2类方法出发，介绍各种转化方法在水稻上的首次报道和重要进展并进行了展望。
生物介导转化法中，农杆菌Agrobacterium介导转化法通过侵染种胚、稻穗、愈伤组织和茎尖进行转化，种胚及其诱导的愈伤组织作为材料的转化体系较为成熟，稻穗和茎尖转化法则操作简便、转化再生周期短；此外，有研究尝试用根瘤菌Sinorhizobium和Rhizobium以及附着剑菌Ensifer adhaerens转化水稻。
非生物介导转化法中，物理方法转化法(基因枪法、电击法、花粉管通道法和显微注射法)是较为传统的转化方法，基因枪法应用较为成熟，花粉管通道法则取得较多育种成果；介质介导转化法中，纳米材料的应用正逐步成为研究热点。
水稻遗传转化体系的发展可从转化材料的筛选和优化介导转化的载体入手，同时将转化体系和DNA-free、单倍体诱导等技术结合起来，以提高转化效率和安全性，缩短转化再生周期。
水稻（Oryzasativa）遗传转化实验技术原理
水稻（Oryzasativa）遗传转化实验技术原理水稻是重要的谷类作物，世界上一半以上的人口以它为主食。
人们一直致力于水稻品质和产量的提高。
此外，水稻还是研究基因功能和调控机制的重要模式植物。
农杆菌介导的遗传转化由于转化效率高、T-DNA整合拷贝数少，因此目前是常用的水稻转化方法。
我们公司多种农杆菌介导的水稻转化方法，主要有以下几种：•共培养农杆菌与从成熟种子获得的愈伤组织（图1）。
•共培养农杆菌与不成熟的胚。
•在用液体培养基浸润过的滤纸上共培养水稻愈伤组织和农杆菌。
•共培养农杆菌与悬浮细胞。
该方法可以提供转化效率。
•将浸泡后的成熟种子的顶端胚性组织用针穿刺后与农杆菌共培养。
接种后的种子可不经过组织培养的过程直接长成植株然后结籽。
•原位蘸花法。
•组织培养和植物生长条件。
•多样的水稻品种： japonica品种： Nipponbare、 Zhonghua11、 Akdong、 Suweon330、Anjungbyeo、 Taipei309、 Cheniere和Katy；indica 品种：9311、 Minghui86、 Minghui63、Kasalath、ASD16、White Ponni、BR29和IR64。
•农杆菌菌株：GV3101、AGL-1、 EHA101、 EHA105和C58C1等。
•多种筛选标记：Kanamycin、Hygromycin、Phosphinothricin和G418等。
图 1. 农杆菌介导的indica水稻成熟种子诱导的愈伤组织转化（Sahoo and Tuteja, 2012）。
参考文献：•Sahoo R. K.; Tuteja N. (2012) Development of Agrobacterium-mediated transformation technology for mature seed-derived callus tissues of indica rice cultivar IR64, GM Crops and Food: Biotechnology in Agriculture and the Food Chain, 3 (2), 123-128.。
水稻遗传转化技术的研究
水稻遗传转化技术的研究水稻是世界各国普遍栽种的粮食作物之一。
然而，由于传统种植方式的限制，其产量难以满足日益增长的全球人口需求。
因此，科学家们在水稻的遗传转化技术方面进行了深入研究，旨在创造更优良的品种，提高水稻的产量和免疫能力。
水稻遗传转化技术是指将具有特定功能的基因导入水稻细胞中，从而实现对水稻基因组的改造。
这些外源基因可用于提高水稻的耐旱性、抗病性、对环境和气候变化的适应能力，并且提高了水稻的营养含量和食用品质。
近年来，许多研究表明，水稻的遗传转化技术已经成为改良水稻的首选方法。
例如，通过引入特定的抗病基因，可以提高水稻对某些病原体的抵抗力。
而通过提高水稻对干旱的耐受性，可以使其在干旱地区的产量显著增加。
此外，遗传转化技术还可以提高水稻的抗逆能力，使其能够在不同的环境条件下生存和繁殖。
然而，水稻遗传转化技术也存在一些争议。
在引入外源基因时，需要使用转基因技术，可能引起一些人类的健康问题。
此外，转基因作物由于生长性状和基因改变以及某些遗传特性的损失，可能引起对野生生态系统的影响。
尽管存在争议，但是关注水稻遗传转化技术的研究仍在继续，有许多新的突破和研究成果。
例如，研究人员已经开发出一种新的方法，其中使用了“基因枪”，可以将特定的基因粒子引入水稻细胞中，从而避免对整个基因组的改变。
此外，一些研究也表明，基因编辑技术可以用于修复水稻DNA序列中的突变，从而提高其产量和品质。
综上所述，水稻遗传转化技术在改良水稻和提高产量方面发挥着重要的作用。
随着技术的发展和改进，人们对它的应用范围和潜力也有了更深入的认识。
未来，随着更多的科学研究和技术创新的出现，水稻遗传转化技术将有望成为改良农作物和提高全球粮食安全的重要手段之一。
水稻遗传转化实验报告
一、实验目的本实验旨在探究农杆菌介导法在水稻遗传转化中的应用效果，通过构建基因表达载体，将目的基因导入水稻细胞中，从而实现基因功能的验证和水稻性状的改良。
二、实验材料1. 实验材料：水稻品种为南桂占，农杆菌菌株为Agrobacterium tumefaciens EHA105，目的基因（GFP基因）载体为pBI121。
2. 试剂：农杆菌转化培养基、抗生素、潮霉素、DNA提取试剂盒、PCR试剂盒等。
3. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、显微镜等。
三、实验方法1. 目的基因的克隆：将GFP基因从质粒载体pBI121中切出，插入到农杆菌载体pBin19中，构建重组载体pBin19-GFP。
2. 农杆菌的活化：将农杆菌菌株EHA105接种于YEB培养基中，在28℃条件下培养过夜。
3. 农杆菌转化：将活化后的农杆菌与重组载体pBin19-GFP混合，用涂布法将混合液涂布于农杆菌转化培养基上，28℃条件下培养2-3天。
4. 水稻叶片的消毒：将水稻叶片用70%酒精浸泡30秒，再用无菌水冲洗3次，然后用无菌滤纸吸干水分。
5. 农杆菌侵染：将农杆菌转化菌液滴加到水稻叶片上，用无菌滤纸轻轻擦拭叶片，使农杆菌均匀分布在叶片表面。
6. 愈伤组织诱导：将侵染后的水稻叶片放入农杆菌转化培养基中，28℃条件下培养5-7天，诱导愈伤组织形成。
7. 抗性筛选：将愈伤组织转入含有潮霉素的筛选培养基中，28℃条件下培养3-4周，筛选出转化成功的愈伤组织。
8. 转化植株再生：将筛选出的转化愈伤组织转入再生培养基中，28℃条件下培养2-3周，诱导再生植株。
9. 抗性鉴定：将再生植株种植于田间，对植株进行潮霉素筛选，筛选出抗潮霉素植株。
10. PCR检测：对筛选出的抗潮霉素植株进行PCR检测，验证GFP基因是否成功导入水稻基因组。
四、实验结果1. 目的基因的克隆：成功构建了重组载体pBin19-GFP。
2. 农杆菌转化：农杆菌转化效率较高，大部分叶片出现愈伤组织。
水稻OsTZF3基因敲除和过量表达载体的构建与遗传转化
水稻OsTZF3基因敲除和过量表达载体的构建与遗传转化水稻是全世界最主要、最重要的粮食作物之一，也是全球人口的主要粮食来源。
水稻在生长发育过程中会受到各种外界环境因素的影响，比如干旱、寒冷、盐碱等，这些因素都会影响到水稻的产量和质量。
提高水稻的抗逆性是参与水稻产量和质量提高的重要途径之一。
OsTZF3基因是水稻中一个重要的转录因子，它在水稻的生长发育过程中起着重要的调控作用。
通过对OsTZF3基因进行敲除和过量表达，可以进一步揭示其在水稻生长发育中的作用机制，为培育具有更高抗逆性的水稻品种提供理论依据。
本文将介绍水稻OsTZF3基因敲除和过量表达载体的构建与遗传转化的方法与过程。
一、 OsTZF3基因的克隆与分析1. 提取水稻总RNA，并进行cDNA合成从水稻幼苗的叶片中提取总RNA，然后通过逆转录酶逆转录成cDNA。
将所有实验操作在RNAase-free环境中进行，以避免RNA的降解。
2. 克隆OsTZF3基因的全长cDNA利用cDNA作为模板，设计引物进行PCR扩增OsTZF3基因的全长cDNA。
然后将扩增产物进行电泳检测，筛选出目的片段。
3. 构建OsTZF3基因的敲除载体将目的片段连接到敲除载体上，并通过酶切鉴定确认连接是否成功。
然后将重组的质粒转化到大肠杆菌中，进行扩增纯化。
二、水稻遗传转化1. 水稻愈伤组织的筛选与培养选用水稻的愈伤组织作为遗传转化的材料，通过对愈伤组织的筛选和培养，获取较好的愈伤组织,为后续的遗传转化做好准备。
2. 遗传转化载体的导入将构建好的OsTZF3基因敲除和过量表达载体导入到愈伤组织中。
常用的方法有生物弹射法、冷冻共转化法等，将质粒导入到愈伤组织细胞内。
3. 筛选转化株系通过对转化后的愈伤组织进行筛选，通过PCR或Southern blotting等技术鉴定出携带了目的基因的愈伤组织细胞。
4. 愈伤组细胞再生植株将转化的愈伤组织进行再生培养，得到植株。
通过对再生植株进行PCR鉴定，最终得到携带 OsTZF3基因敲除和过量表达载体的转基因水稻。
水稻遗传转化体系Protocol
一、接种
步骤：
1、保存在-20度的种子使用前取出（用多少取多少，用纸包好），置于37度恒温箱烘烤10-20小时左右（最好过夜）。
2、拨去种皮（1），尽量不要损害到种胚，拨皮后检查，将胚乳表面发黑或胚死亡的种子剔掉（2），用纸包好带入组培操作间。
3、（以下操作均在超净工作台内进行）将种子倒入干净的100ml三角瓶中，加入75%乙醇消毒2分钟，期间要不断的摇动，倒出酒精，再加入20ml2%的NaClO(3),覆盖种子即可，室温在摇床上160rpm摇25min，将NaClO倒掉，将种子用无菌镊子转移至高压灭菌过的滤纸上，在超净工作台上吹干为止，然后将种子接入诱导培养基（NB培养基）（5）上，每皿20粒（4），注明日期，封口膜封口，置于27℃恒温箱中暗培养（15）；
b．50mg/mlHyg：默克牌的买来就应该是这个浓度，即1g/20ml
c．Hyg30：是指潮霉素浓度为30mg/ml（即：480ul×1g/20mg÷800ul）。
d．有机、2,4-D、Cb、Hyg混匀，抽滤。
(23) 可以看到愈伤一天一天开始慢慢褐化，就像死了一样；
(19)AS的配制：
9.81mgAS用1mlDMSO溶解即可；一般称98.1mg,用10mlDMSO溶解,用1.5ml离心管分装，每管装1ml；-20°保存；
(20)AMM液体培养基的配制
(21) AS培养基（共培养培养基）的配制（800ml）：
780ml NB +16ml有机+1.6ml2 mg·L-12,4-D+800ulAS；
抗性愈伤的继代筛选当抗性愈伤在朝霉素30培养基22上生长15天后23将愈伤换到新朝霉素30培养基上15天后可观察到一些褐化愈伤开始长出的新的愈伤继续培养等新愈伤长出很多时转移至朝霉素50培养基24上筛选37分化从朝霉素50培养基中将继续增生分裂的抗性愈伤转入分化培养基25上再生成团而不是分散放置26一周后愈伤开始转绿三周后开始长出幼芽后根也长出当芽长至23cm时就可移至12ms培养基生根培养基上27
水稻转基因步骤
水稻转基因步骤在植物转基因过程中，为了有效地识别和筛选转化子，常将目的基因和标记基因构建在同一表达载体中。
这种载体结构导致转基因植物中目的基因和标记基因始终共存，而标记基因（尤其是抗生素抗性基因）的存在可能给转基因植物的生物安全带来隐患。
目前已研发了多种方法剔除转基因植物中的标记基因，其中最常见的是共转化法(Komari 1996，McCormac 等2001)。
共转化系统是采用2个质粒或1个含有两套T—DNA表达盒的表达载体共同转化植物，其中一套表达盒含有抗性选择标记基因，另一套表达盒含有目的基因，它们转化植物时可能整合到植物基因组的不同位置。
转基因植株在减数分裂过程中，标记基因和目的基因发生分离，从而可在转基因后代中筛选到只含目的基因而不含选择标记基因的个体。
共转化从根本上排除了转基因植物中的选择标记，是保证人畜和环境安全的重要措施，因此受到了广泛的重视。
Zhou 等（2003）认为，用分别含一个T-DNA区的两个载体共转化的效率低于双T-DNA区表达载体的共转化效率。
目前关于利用双T-DNA区表达载体，获得无选择标记转基因阳性株系的研究已有不少报道（唐俐等2006，张秀春等2006，于恒秀等2005）。
花药培养与遗传转化技术相结合，可以快速获得纯合转基因植株（斯华敏等，1999，付亚萍等，2001），但是应用花药培养快速获得只含目的基因而无选择标记的转基因研究尚未见报告。
水稻是最主要的粮食作物，转基因水稻的安全显得尤为重要。
本实验室通过农杆菌介导的水稻转化体系，将包含人乳铁蛋白(hLF)、高赖氨酸(SB401)、高甲硫氨酸(RZ10)基因的表达载体p13HSR成功转化脆茎稻，由于该表达载体采用双T-DNA结构，将检测出含选择标记潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）和目的基因的转基因阳性T0植株按单株直接进行花药培养。
在189株二倍体花培植株中检出23株有目的基因没有选择标记hpt的转基因纯合植株，得率为9.87％。
水稻花粉及精细胞优势表达基因遗传转化
鬯！！：羔竺：芏！！：！！一一Ｈ８０，５—————了Ｆ————————一石彳…一——亍｝：·而活山诧粉ｎ争舟Ｂ花粉中的【Ｅ牢二核花粉分离效率：Ｅ．１４５．４ｍｇ／ｉｉ根花穗。
Ｆ．１３７．５ｍｇ／百根仡德。
３．３三核花粉分离ｊ：核仡粉卡于料处理后，６０ｉ．ｔｍ滤暧过滤除去宅花药及未破碑佗药。
３５ｕｍ滤哎过滤后除ｋ．－ｄ、杂质。
由衷２．３可知，经４５％蔗糖／６０％蔗糖不连续梯度离心，分离效果比不纾梯度离心效果好，岛纯度高活力花粉沉于管底。
表２．３三核花粉分离结果坠：型竺竺三！型！竺智！…分离疗法Ｅ粉ｅ，ｋｇ：（％）花粉活力（％）花粉分离效率（ｍｇｌｆＥ｛根佗传’３２提取的ＲＮＡ及分析Ｒ＼Ａ琼艇船ｔ疑胶ｆ乜泳照片见圈２．７、图２．８。
电泳枪删砬，Ｊ：２８Ｓ及１８Ｓ条带ｉＪ｝Ｉ晰、比率ｄ：确，无弥散带，ｉ征，ＪＪ得到的ＲＮＡ质量较好，可用＿Ｆ进一步实验。
图２．７单核、二核花粉ＲＮＡ电泳照片图２．８三核花粉ＲＮＡ电泳照片＂１ｌＩ凡辛碗Ｉ节ｆ￣坨土扎。
１１人午砌１节ｐ觅土等其丌仡结果后收取种＝Ｆ，用Ｆ下一步实验。
３结果与分析３．１药ＲＮＡ提取及读码框ＰＣＲ扩增抽提的成熟仡药Ｒ＼Ａ经电泳检测，显示条带清晰，比例』卜Ｉ确（见图３．３）。
总Ｒ＼Ａ经反转爿乏成ｃＤ＂，Ａ后，用引物ｃｘｃｌ，ｃｘｃ２进行ＰＣＲ扩增，得到长度约为８５０ｂｐ的片段。
测序结果显示扩增得到了正确的胁掰的阅读框。
３．２构建植物表达载体ｐＢＩ１２１－ＲＳＧ６并转入农杆菌中将ＲＳ（；６片段从Ｔ载体｛：切Ｆ后与Ｈ样鹃切的ｐＢｌｌ２１连接，转入大肠ｆＩ甬中，菌落ＰＣＲ挑选有８５０ｈｐ定矗条带的菌落（见图３．４）。
再提取质牲舣胁切。
电泳结泉｜『１ｊｆ￥得到８５０ｂｐ的片段，证明转化成功。
ｐＢｌｌ２１拷贝数比较低，矗＋提取过程中加大菌液晕提取结果／ｊ‘较好。
图３．３成熟花药ＲＮＡ提取结果图３．４大肠杆菌菌落ＰＣＲ从夫肠ｆｆ荫研ｊ性克隆中提取质粒，将霞组质粒转入农ｆｌ菌中，¨样泊藩Ｉ】【Ｒ（见图３．５）并提取质粒双晦切验证。
水稻OsCOI基因表达载体构建及其遗传转化
水稻OsCOI基因表达载体构建及其遗传转化水稻OsCOI基因表达载体构建及其遗传转化引言：水稻作为世界上最重要的粮食作物之一，已经成为了人类生活不可或缺的一部分。
然而，由于自然环境的限制以及病虫害的侵袭，水稻的产量仍然面临较大的挑战。
因此，通过遗传工程的手段，改良水稻的抗病虫害能力以及提高产量已成为当前研究的热点领域。
本文主要介绍了水稻OsCOI基因表达载体构建及其遗传转化的方法与意义。
一、水稻OsCOI基因表达载体的构建1. 基因序列获取：首先，我们需要获取水稻OsCOI基因的完整序列。
通过生物信息学的分析，我们可以在公共数据库中查询到该基因的序列信息。
2. PCR扩增：利用聚合酶链反应（PCR）技术，我们可以选择适当的引物并将水稻OsCOI基因扩增出来。
在PCR反应体系中，我们还需要加入适当浓度的dNTPs、Taq聚合酶以及缓冲液等试剂。
3. 酶切与连接：将扩增出来的水稻OsCOI基因与表达载体进行酶切，使两者能够具有互补的黏性末端。
然后，我们可以利用DNA连接酶将水稻OsCOI基因与表达载体连接起来。
4. 转化大肠杆菌：将连接好的表达载体转化到大肠杆菌中，通过筛选和培养，可以得到带有水稻OsCOI基因的大肠杆菌。
5. 提取载体：从大肠杆菌中提取出带有水稻OsCOI基因的载体。
可以使用溶解裂解法、玻璃珠破碎法等不同的方法进行载体提取。
二、水稻OsCOI基因的遗传转化1. 感受器准备：在水稻培养基中加入适当浓度的激素，促使水稻愈伤组织的形成。
然后，将愈伤组织与表达载体进行共培养。
2. 培养基筛选：根据表达载体中的抗性标记基因，在培养基中添加相应的抗生素。
只有带有水稻OsCOI基因的愈伤组织可以存活下来。
3. 愈伤组织再生：将带有水稻OsCOI基因的愈伤组织进行再生培养，促使其形成幼苗。
4. 控制培养：在培养条件的控制下，使幼苗正常生长。
5. 地上部移栽：将生长良好的幼苗移栽到含有适宜养分的培养基中。
农杆菌EHA105转化条件的优化及水稻愈伤组织遗传转化体系的初步建立
农杆菌EHA105转化条件的优化及水稻愈伤组织遗传转化体系的初步建立：以质粒PBI121和gfp作为外源DNA转化农杆菌EHA105，通过对EHA105生长状态的测定，并对重悬液Cacl浓度，速冻时间和热处理温度等实验条件逐一进行筛2选，以确定EHA105的最优转化条件。
然后，分别用被转化的农杆菌侵染水稻愈伤组织。
结果表明，农杆菌 OD值接近0.6经过20mmol/L Cacl2重悬细胞，液氮速冻5600分钟后于28?处理5分钟，农杆菌的转化效率最高。
愈伤组织经GUS染色或荧光观察，外源基因已经转入水稻种子中。
农杆菌；水稻愈伤组织；遗传转化: Agrobacterium tumefaciens EHA105 was transformed by the plasmid PBI121 and gfp. To difine the best experimental conditions for transformationof A.tumefaciens the growth rate of the A.tumefaciens EHA105 was measured ,andthe concentration of resuspension solution,freezing time and the thawingtemperature were tested. And then infected mature rice in order to inducecallus with Agrobacterium tumefaciens respective .Result: By resuspended inCaclbuffer, frozen in liquid nitrogen for 5 min and thawed in 28? for 5 2min, the efficiency of transformation was the best. The callus was dyed byGUS or seen by fluorescence, which can testify that exterior gene has beentransferred into rice.Agrobacterium tumefaciens; rice callus; Genetic transformation水稻是世界上重要的粮食作物，并已为分子生物学研究的模式作物之一。
以潮霉素B抗性基因为选择标记的水稻立枯丝核菌遗传转化体系的构建
以潮霉素B抗性基因为选择标记的水稻立枯丝核菌遗传转化体系的构建由立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）引起的水稻纹枯病是世界性水稻三大病害之一。
立枯丝核菌的致病机理相当复杂，其致病能力是毒素，细胞壁降解酶和菌丝的机械压力这些因子共同作用的结果[2，5]。
至于以哪种因子为主，以及各因子间如何相互协调作用还有待于进一步研究。
本文构建了针对水稻立枯丝核菌的原生质体遗传转化体系，为从分子水平上研究该菌，进而揭示其致病机理奠定了坚实的基础。
1 材料与方法1.1 菌株与培养基水稻立枯丝核菌菌株Rh9由扬州大学分离保存。
大肠杆菌E.coli DH10B用于载体分子的扩增和转化子中潮霉素B抗性基因的克隆。
液体PDA培养基用于水稻立枯丝核菌菌丝的培养。
固体PDA培养基用于水稻立枯丝核菌原生质体的再生和转化子的继代培养。
液体TB3培养基用于原生质体的复苏。
选择培养基（含30μg/ml 潮霉素和0.015%（W/V）琼脂的液体TB3培养基）用于转化子的筛选。
1.2 质粒DNA用于转化的质粒载体pSM565（GenBank登录号为AY*****）由福建农林大学功能基因组学实验室保存。
它带有潮霉素B磷酸转移酶基因（Hyg）和氨苄青霉素抗性基因（Amp）。
1.3 主要试剂裂解酶(来自Trichoderma harzianum)购自Sigma公司。
*****购自Seebio Biotechnology公司。
山梨糖醇（Sorbitol）购自Bio Lab公司。
限制性内切酶购自New England Biolab（NEB）公司。
1.4 水稻立枯丝核菌原生质体的分离裂解液：10%（W/V）裂解酶；0.8 mol/L NaCl（pH5.8）。
SuTC 溶液：20%（W/V）蔗糖，50 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，50mmol/L 无水CaCl2，抽滤灭菌。
挑取已生长4-6天的水稻立枯丝核菌Rh9菌丝块，捣碎后放入100ml液体PDA（包含50μg/ml amp）中，28℃下振荡培养2-3天。
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水稻遗传转化体系ProtocolIntroduction1．水稻的遗传转化研究历史与现状20 世纪80年代末, 水稻的遗传转化首获成功。
1988 年, 3 个不同的研究小组以水稻原生质体为受体,采用“电击法”或“PEG 介导法”等方法将外源3]。
1991 年, 基因枪转化的方法在水稻中基因导入到水稻中并获得再生植株[1~获得成功[4],随后成为水稻遗传转化的常用方法之一。
1993 年，Chan 等人[5]首先采用农杆菌介导的方法获得了转基因水稻。
Hiei 等人[6]以水稻成熟种子诱导的愈伤为受体, 建立了农杆菌介导的粳稻高效转化体系, 使得农杆菌介导法逐渐成为了水稻转化最常用的方法。
此后, 粳稻的转化方法被进一步优化, 使粳稻的遗传转化周期大幅缩短[7]。
虽然Hiei等[6]建立的农杆菌介导的转化体系使得粳稻的转化不再困难, 但是许多籼稻的转化依然存在障碍, 主要是转化效率低下。
因此, 一些研究者对籼稻的转化体系进行了一些优化, 使得籼稻的转化效率得到了一定的提高[8,9]。
最近, Hiei 和Komari[10]发表了一个粳稻和籼稻均适用的农杆菌高效转化的方法.根据他们的结果, 采用幼胚作为外植体, 籼13 个稻的转化可以在两个半月内完成，且转化效率非常高(一个幼胚可以得到5~独立的转化植株)。
2. 转基因技术在水稻上的研究与应用[11]a. 转基因抗虫水稻对于水稻最主要的害虫——螟虫(二化螟、三化螟、稻纵卷叶螟等)在水稻中尚未发现有效的抗性种质资源. 目前,最有希望和前途的方法就是利用转基因技术把外源抗虫基因引入水稻中创造出新的抗虫品种。
虽然水稻中已经发现和鉴定了19 个抗褐飞虱的基因[12], 但是由于褐飞虱有多个生物型且易产生变异, 抗性品种往往推广数年后就会失去抗性。
b. 转基因抗病水稻见抗水稻病毒研究c. 转基因抗旱水稻d. 转基因营养高效利用水稻e. 转基因优质水稻f. 转基因高产水稻g. 转基因抗除草剂水稻3.转基因技术在水稻抗病毒基因工程上的应用随着RNA干扰技术（包括siRNA和miRNA介导的RNA干扰）在抗病毒18 ]，结合RNA干扰技术和水稻遗传转化技术基因工程上的广泛研究和应用[13~来研究水稻，获得对水稻病毒高抗的品系越来越受研究人员的重视，成为国内外水稻病毒研究的热点。
目前，国内在这方面属于起步阶段，仅仅做了一些构建干27]，但并没有获得高抗植株，国外，特别是日扰载体和获得RNA干扰植株[19~本在这方面有着较大优势，Omura T实验室分别在2009年和2010已获得了对RDV、RSV高抗植株[28，29]，另外Himani在2007年也获得了对RTBV高抗的植株[30]。
（重要是看以上文献，一定要认真体会）Materials and methods一、接种步骤：1、保存在-20度的种子使用前取出（用多少取多少，用纸包好），置于37度恒温箱烘烤10-20小时左右（最好过夜）。
2、拨去种皮（1），尽量不要损害到种胚，拨皮后检查，将胚乳表面发黑或胚死亡的种子剔掉（2），用纸包好带入组培操作间。
3、（以下操作均在超净工作台内进行）将种子倒入干净的100ml三角瓶中，加入75%乙醇消毒2分钟，期间要不断的摇动，倒出酒精，再加入20ml 2%的NaClO(3),覆盖种子即可，室温在摇床上160rpm摇25min，将NaClO倒掉，将种子用无菌镊子转移至高压灭菌过的滤纸上，在超净工作台上吹干为止，然后将种子接入诱导培养基（NB培养基）（5）上，每皿20粒（4），注明日期，封口膜封口，置于27℃恒温箱中暗培养（15）；二、掐芽种子在培养箱中培养7天后，长出可见的芽和遁片，根据种子的生长状态，将芽掐掉（16），继续在27°C恒温箱中暗培养。
三、继代掐芽后7天左右，进行第一次继代，用镊子将新长出的愈伤夹成小块（17），转入新的NB培养基中，每皿20粒，在27度恒温箱中暗培养15天后进行第二次继代，培养15天后，就可以长出颜色鲜黄，表面光滑，直径大小为2-3mm的胚性愈伤组织颗粒。
大小合适的愈伤可以进行预培养，小的就进行第三次继代。
四、农杆菌介导的水稻遗传转化共培养（整个操作过程需8天）第一天：选取自然分散，颜色鲜黄，直径约为2-3mm的颗粒愈伤，置于27度暗培养4天。
第三天：农杆菌划线28°培养，两天后农杆菌长满即可洗脱（18），用于转化。
第五天：悬浮农杆菌，悬浮于添加有100uM乙酰丁香酮（AS）(19)20ML的AMM液体培养基(20)中，剧烈震荡1min后，静置1h，让农杆菌形成悬浮液，取菌液于三角瓶中加入经预培养的愈伤，略微摇动静置30min，于无菌纸上晾干愈伤后置于添加有100uM的乙酰丁香酮的NB培养基（AS培养基（21）上27度暗培养3天。
第八天：等农杆菌生长至可见的愈伤下的菌斑，但未长满愈伤时，挑取愈伤于无菌培养瓶中，用无菌水冲洗，直至无可见菌丝为止，最后用含300mg/l的羧苄无菌水静置1h，置于无均滤纸上晾干后，转移至筛选培养基上。
五、抗性愈伤的继代筛选当抗性愈伤在朝霉素30培养基（22）上生长15天后（23），将愈伤换到新的朝霉素30培养基上，15天后可观察到一些褐化愈伤开始长出的新的愈伤，继续培养，等新愈伤长出很多时转移至朝霉素50培养基（24）上，筛选3-7天。
六、分化从朝霉素50培养基中将继续增生分裂的抗性愈伤转入分化培养基（25）上再生，成团而不是分散放置（26），一周后愈伤开始转绿，三周后开始长出幼芽，随后根也长出，当芽长至2-3cm时，就可移至1/2MS培养基（生根培养基）上（27）。
分化间进行，25°（28），光14小时，暗10小时。
七、生根超净工作台内进行，每个培养瓶中只放一个抗性愈伤诱导出来的苗（29），在生根培养基上生长10天。
（30）分化间进行，25°，光14小时，暗10小时。
八、炼苗生根十天后开盖，加已晾两天或晒过的水，泡过培养基即可（28），2天后（28）用水洗掉生根培养基，加晾两天或晒过的水浸过根，3-7天后待生长状态好了后移栽大田。
（期间每天要加水，确保根都泡在水中）。
分化间进行，25°，光14小时，暗10小时。
九、移栽大田土、水提前晒上两天，移栽盆装4/5体积的土，用水浸透即可，不能太多水，刚好浸过土面最好。
移栽：在盆上标记好，盆宽移栽两株，长四株；移栽时不能插深，植株能站住即可。
10天后可以施一点肥，不能太多。
20天后可以每10天施肥一次，同样不能太多，太多会烧苗（如烧苗，施肥3天后可以观察到，应马上将水换掉）。
要保证白天29°（30），晚上23°；光14小时，暗10小时。
（31）Notes(1) 不用一粒一粒用手拨皮，在桌上垫一些白纸，用书压。
力道要掌握好，太用力把种子压碎了，用力不够只能去个别的种皮，效率低。
注意：接触种子的纸必须是全白色的，不能有印刷有子的，否则用力压时，墨就着黑色上种子。
(2) 不正常的种子，一律丢弃。
因为后期若是一粒种子长菌的话就污染了整盘。
(3) a. 20ml 2%的NaClO的配制：实验室买的是有效浓9%的NaClO，所以取4.5ml 9%的NaClO加16ml蒸馏水即配成2%的NaClOb.2%的NaClO现用现配，因为NaClO见光分解，所以配了就要赶紧用。
(4) 20粒共三圈，外圈12粒，中圈7粒，里一粒。
(5) NB培养基的配置（800ml）：实验准备：所有玻璃仪器必须洗净再用双蒸水润洗步骤：取一升三角瓶→加24g蔗糖↓依次加入80ml N（10×） (6)6max16 ml 铁盐（50×） (7)8 ml 肌醇（100×） (8)（200×） (9)4 ml B5miin↓加多点（勿超500）三蒸水摇使其溶解，倒入1升量筒中，再加三蒸水定容至780ml↓此时PH应为4.2-4.3PH调至5.8（用pH计，KOH调）↓加2.1g植物凝胶（10）↓高压灭菌（121°20min）↓灭完前30min，拿出16ml有机，化为液态加1.6ml2.4-D（1mg／ml）(11)至16ml有机(12)中↓待培养基稍烫手抽滤（13），倒培养基(14)(6) N6max（10×）的配制（配1L）：① KNO3 28.3 g② KH2PO4 4.0 g③（NH4）2SO4 4.63 g④ MgSO4·7H2O 1.85 g⑤ Cacl2·2H2O 1.66 g 或Cacl2 1.25 g注：a．①②③④一起溶解混匀成A，b．⑤单独溶解，再与A交替混匀，以免长期存放产生沉淀；c．4℃冰箱保存；(7) 铁盐（50×）的配制（配500mL）：① FeSO4·7H2O0.695g g② NA2EDTA·2H2O0.9325 g注：a．①②分别溶解，再交替混匀，边加边摇匀；b．棕色瓶装；c．4℃冰箱保存；(8) 肌醇（100×）的配制（配1L）：10 g肌醇（Inositol）用双蒸水定容至1L； 4℃冰箱保存；(9) B（200×）的配制（配500mL）：5miin①MnSO4.H2O 0.758 g②H3BO3 0.3 g③ZnSO4·7H2O 0.2 g④CuSO4·5H2O 0.0025 g⑤CoCl2·6H2O 0.0025 g⑥KI 0.075 g⑦NaMoO4·2H2O 0.025 g注：a．一起溶解，三蒸水定容至500mL；b．棕色瓶装；c．4℃冰箱保存；(10) 非琼脂粉。
(11) 2,4-D（1mg/ml）配1100ml）：加1ml无水乙醇用枪吸吹，可溶解。
再用纯水定容至100ml；4℃冰箱保存；(12) 有机（50×）的配制（配1L）：①盐酸硫胺素（VB1）0.5 g②盐酸吡哆醇（VB6）0.05 g③尼克酸（烟酸）0.05 g④水解酪蛋白15 g⑤谷氨酰胺12.5 g⑥脯氨酸25 g⑦甘氨酸0.1 g注：a．以上药品均要求Sigma的，一起溶解，三蒸水定容至1L；b．再分装，每个16mL；c．用滤纸、漏斗过滤分装；d．-20°冰箱保存；e．用时提前拿出来；（13）抽滤：在超净台中把有机倒入一培养皿中，抽滤（先要试下过滤膜有没有装好：注射器抽一些有机并抽入些空气，打出有机，若弹起，才可以进行抽滤。
所以通常过滤的应多准备几个；若使用一次性过滤器则直接抽滤即可；过滤膜为0.2um）,摇荡三角瓶（混匀），酒精灯烧瓶口再倒培养基。
(14) 倒培养基：a．六皿培养皿一摞，从下至上倒培养基b．每皿倒一半稍多厚（水稻组培要厚点）,800ml倒22皿左右。