枯草芽孢杆菌ZC-7中性蛋白酶的分离纯化及酶学性质研究

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［１３］采用ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳＰＡＧＥ）。 ? ?
２．１．２脱盐浓缩超滤过程中用０．５ｍｏｌ／ｍｌ的ＢａＣｌ２
２－溶液检测滤出液中是否含有ＳＯ以滤出液滴入４，
１．７米氏常数（Ｋｍ）和最大反应速度（Ｖ）的测定ｍａｘ
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中国生物工程杂志ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｖｏｌ．２７Ｎｏ．１０２００７
２．１．４ＳｅｐｈａｄｅｘＧ７５分子筛层析由洗脱曲线（图 ? ３）可知，经ＤＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ离子交换后获得 ? ｅｐｈａｄｅｘＧ７５凝胶过滤后分成两个组的活性组分经Ｓ ?
１４］定［。蛋白酶活力定义为：ｌｍｌ液体酶，ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ７．５的磷酸缓冲液稀释成不同浓度，然后与酶液４０ ℃反应１０ｍｉｎ，用Ｆｏｌｉｎ法测定活力。根据ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒＢｕｒｋ法计算出Ｋ ? ｍ及Ｖ的值。ｍａｘ
关键词枯草芽孢杆菌中性蛋白酶纯化性质
中图分类号Ｑ８１４１中性蛋白酶是最早发现并广泛应用于工业化生产Ｈ条件下将大分子蛋白质迅的蛋白酶制剂，能在中性ｐ速水解成肽类和部分游离氨基酸。作为一种生物催化剂，该酶催化反应速度较快，无工业污染，且反应条件适应性宽，被广泛地应用于皮革脱毛、饮品澄清、洗涤
１，２］剂、化妆品以及医药治疗等行业和领域［。１０］１１］１２］近几年，邓靖等［，何胜华等［，肖怀秋等［分
别对米曲霉以及某些芽孢杆菌所产中性蛋白酶的提取及酶学特性进行了研究，表明同属中性蛋白酶，适用范围却并不相同。本试验选取了合适的纯化方法从枯草Ｃ７的发酵液中提纯了该酶，并对其酶学性芽孢杆菌Ｚ ? 质进行了研究，为该酶基因工程改造提供基础。
国内外对微生物蛋白酶的分离纯化进行了广泛的研
３］究，Ｂａｙｌｉｓｓ等［对发酵液进行浓缩加热，通过透析、
１材料与方法
１．１ＺＣ７中性蛋白酶发酵液 ? 菌株ＺＣ７为枯草芽孢杆菌ＡＳ１．３９８经Ｎ＋离子注 ? 入后的突变株。１．２有关试剂中空纤维膜购自天津膜天膜工程技术有限公司，蛋白质分子量标准购自上海生物工程有限公司，其余试剂均为国产分析纯或化学纯。１．３中性蛋白酶的分离纯化１．３．１盐析取４２小时发酵液在４ ℃下８０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，收集上清液，分成１５份，每份５０ｍｌ，加硫酸０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、铵分别至２５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％饱和度，４ ℃静置过夜，８０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，蛋白沉淀溶于适量０．１％的醋酸钙缓冲液（含２０％异丙醇）中，分别测定沉淀和上清的酶活，绘制硫酸铵盐析曲线。
２实验结果
２．１ＺＣ７中性蛋白酶的分离纯化 ? ２．１．１硫酸铵盐析当硫酸铵饱和度小于３０％时，沉淀中酶活力很低，上清液中酶活力几乎不变。沉淀量随硫酸铵饱和度的增加而增加，其酶活力也随之增加，当硫酸铵饱和度达到７０％时，沉淀量基本不再增加，其酶活力接近最高值。根据图１盐析沉淀曲线，采用３０％饱和度硫酸铵沉淀去除杂蛋白，然后对上清液补加硫酸铵至７０％饱和度沉淀目的蛋白。
ＳｅｐｈａｄｅｘＧ１００提纯酶液，但活力回收率不高。Ｙａｓｕｎｏｂｕ ?
４］等［对枯草杆菌中性蛋白酶采用ＤＥＡＥ纤维素和ＣＭ? ? ［５］纤维素二次层析进行了纯化，８０年代，Ｂｅｒｔｕｓ，［６］７］Ｔｅｔｓｕｏ，Ａｋｉｒａ等［研究了Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ和
分，通过酶活检测，第二洗脱峰为活性组分，第一洗脱峰没有活性。活性组分洗脱峰峰形基本对称，基线接近零，可与另ＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔ外一种蛋白组分分开，表明用其对Ｄ ? Ｆｌｏｗ离子交换后样品进行最后的分离纯化，效果很好。２．２酶的纯化回收通过对ＺＣ７中性蛋白酶提纯工艺各纯化步骤指 ? ）。ＺＣ７中性蛋白酶纯度最终提高标的跟踪测定（表２ ? 了７７．５倍，回收率为２７．７％。粗酶液经纯化后，得到分子量约为４２ｋＤａ的单一电泳条带（图４），目的蛋白纯度大于９０％。
２００７，２７（１０）
赵丛等：枯草芽孢杆菌ＺＣ－７中性蛋白酶的分离纯化及酶学性质研究
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１．３．２脱盐浓缩将盐析沉淀溶解于缓冲液中，用截流分子量为１０ｋＤａ～２０ｋＤａ的中空纤维膜超滤，对样品ａＣｌ以滤出液进行脱盐浓缩，除盐效果用Ｂ２溶液检测，ａＣｌ滴入Ｂ２溶液中无沉淀析出为终点。１．３．３ＤＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ（２．４ｃｍ× ３０ｃｍ）离 ? ．１％的醋酸钙缓冲液（含２０％异丙子交换层析用０醇）平衡层析柱，将脱盐后的活性组分用同样的缓冲液８０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，上样（２ｍｌ）后用同样的缓溶解，冲液先洗脱未吸附的蛋白，再用含０～１ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ的该缓冲液梯度洗脱，分步收集，测定Ａ２８０ｎｍ吸光值和酶活力。１．３．４ＳｅｐｈａｄｅｘＧ７５（１．６ｃｍ× ８０ｃｍ）凝胶层析离 ? ．１５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ的子交换得到的活性组分先用含００．１％的醋酸钙缓冲液（含２０％异丙醇）平衡，样品８０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，上样（１ｍｌ）后用相同的缓冲液．５ｍｌ／ｍｉｎ的速度洗脱，每管收集２．０ｍｌ，紫外检测器以０在线检测Ａ２８０ｎｍ，收集活性峰。１．４总蛋白测定总蛋白测定参见文献［１３］。１．５酶活力测定按部颁行业标准ＱＢ１８０５．３９３，采用Ｆｏｌｉｎ法测 ?
图２ＺＣ７中性蛋白酶ＤＥＡＥ? ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ ? 离子交换层析洗脱曲线Ｆｉｇ．２ＩｏｎｅｘｃｈａｎｇｅｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｏｎＤＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗｏｆＺＣ７ｎｅｕｔｒａｌｐｒｏｔｅａｓｅ ? ?
％）活力回收（６３．７
中空纤维膜超滤
３０００
２２９．６
３００
１４６．３
１０
２．１．３ＤＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ柱层析从层析洗 ? 脱曲线（图２）可知，开始先用０．１％的醋酸钙缓冲液（含２０％异丙醇）洗脱，至少有两种蛋白组分被洗脱下来，然后用含０～１ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ进行梯度洗脱，在此期间又有两种蛋白被洗脱下来。通过酶活检测，第三洗脱峰为活性组分，其它洗脱峰均没有活性。ＺＣ７中性蛋白酶被ＤＥＡＥ ? ? ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ离子交换色谱介质吸附，从而与不带电荷的至少两种杂蛋白彻底分离，且目标蛋白活性组分峰与２８０ｎｍ蛋白质吸收峰完全重合，而且峰型比较对称，基线接近为０，说明这时目标蛋白已经达到了较高的纯度。
摘要枯草芽孢杆菌ＺＣ７的发酵液，经离心分离得到粗酶液，再经硫酸铵盐析、中空纤维膜除盐 ? ＤＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ离子交换层析、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ７５柱层析等步骤获得电泳纯的中性蛋浓缩、 ? ?
－３白酶。ＳＤＳＰＡＧＥ测得其分子量大约为４２ｋＤａ。以酪蛋白为底物时，该酶的Ｋｍ为５× １０，Ｖ ? ｍａｘ４为２．５× １０ｇ／ｍｉｎ，酶的最适作用ｐＨ为７．０，最适反应温度为５５ ℃，在ｐＨ６．５～８．０，４０ ℃以下较 μ ２＋２＋稳定，对１ｍｏｌ／Ｌｈ２Ｏ２具有一定的耐受性。ＥＤＴＡ、异丙醇和乙醇对该酶有抑制作用，Ｃａ、Ｍｇ和ｉ＋Ｌ离子对其具有保护作用。
图１中性蛋白酶盐析曲线Ｆｉｇ．１ＳａｌｔｉｎｇｏｕｔｃｕｒｖｅｏｆｔｈｅＺＣ７ｎｅｕｔｒａｌｐｒｏｔｅａｓｅ ?
７．５的条件下，ｌｍｉｎ水解酪素产生ｌｇ酪氨酸为１个酶 μ 活力单位，以Ｕ／ｍｌ表示。１．６纯度鉴定及分子量测定
９］ＤＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ６Ｂ层析，过程相对繁琐。活泼等［ ? ?
研究了嗜热芽孢杆菌所产中性蛋白酶，采用了硫酸铵、丙酮交替分级沉淀的方法。
收稿日期：２００７０６－１１修回日期：２００７０８０８电子信箱：ｔｊｄｕｌｉａｎｘｉａｎｇ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ通讯作者，
ＢａＣｌ表１）。２溶液中无沉淀析出作为除盐的终点（
表１超滤结果表Ｔａｂｌｅ１Ｒｅｓｕｌｔｓｏｆｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ
５５初始体积（ｍｌ）初始总活力（× ｍｌ）回收总活力（× １０Ｕ）回收体积（１０Ｕ）浓缩倍数
Ｓｔｅｐｔｏｍｙｃｅｓｎａｒａｅｎｓｉｓ中性蛋白酶，通过离子交换层析，凝胶柱层析等方法将它们分离纯化，并给这些酶以相应归类，但对相应的酶学性质没有做具体的研究。在国内，周
８］祖荫等［纯化了栖土曲霉３．９４２所产的中性蛋白酶，采
用了单宁酸沉淀、聚乙二醇洗脱、ＤＥＡＥＳｅｐｈａｄｅｘＡ２５和 ?
中国生物工程杂志ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７，２７（１０）：２８～３３
枯草芽孢杆菌ＺＣ－７中性蛋白酶的分离纯化及酶学性质研究
赵丛张敏王建玲杜连祥殷向斌
（天津科技大学生物工程学院天津３００４５７）