高效液相色谱法测定饮料中山梨酸和苯甲酸含量

实验八、高效液相色谱法测定饮料中山梨酸和苯甲酸含量
【目的与要求】
1．掌握高效液相色谱法测定碳酸饮料中苯甲酸和山梨酸的原理和方法
2．了解高效液相色谱仪的基本结构和使用方法
3．熟悉碳酸饮料样品的处理方法
【方法原理】
苯甲酸和山梨酸广泛用于食品防腐剂，能够引起人的再生障碍性贫血，粒状白细胞缺乏等。

因此国家严格限制其使用量。

在本实验中，样品首先经过超声和加热处理，以除去二氧化碳和乙醇。

然后经滤膜过滤后注入高效液相色谱仪，通过反相C18液相色谱柱分离后，紫外检测器230nm波长处检测。

以色谱峰的保留时间定性，色谱峰面积在一定范围内与浓度呈线性关系进行定量分析。

【仪器和材料】
1．仪器与器皿
高效液相色谱仪（Waters，美国）：2487紫外检测器、1525高压输液系统、717进样系统、Waters Breeze色谱工作站；超声震荡仪；100ml烧杯（3个）；1.00ml 和100µL移液枪；离心管若干个；离心管架；微孔滤膜（0.22µm）。

2．试剂
（1）甲醇（色谱纯）；醋酸铵溶液（0.02mol/L，色谱纯）；流动相使用前均超声脱气处理10min。

（2）山梨酸储备溶液(1.0 mg/ml）：准确称取0.2500g山梨酸，加超纯水定容至250ml。

（3）苯甲酸储备液（1.0 mg/ml）：准确称取0.2500g苯甲酸，加超纯水定容至250ml。

【操作步骤】
1．样品处理
碳酸饮料（雪碧）：移取10ml碳酸饮料于烧杯中，超声处理5min。

然后用微孔滤膜（0.22 µm）过滤于另一烧杯中，滤液备用。

吸取100 µL滤液于离心管中，并加入900 µL超纯水，混合均匀标记为样品。

2．标准溶液配制
（1）取一定量的苯甲酸储备液，经滤膜过滤于离心管中。

吸取50 µL 滤液于另一离心管并加入950µL 超纯水，得到50 µg/ml 的苯甲酸标准品，混合均匀后标记为苯甲酸标准品。

（2）同理得到50 µg/ml 的山梨酸标准品，做好标记。

（3）混合标准品配制：分别吸取500µL 苯甲酸标准品与山梨酸标准品与离心管中，混合均匀后得到25 µg/ml 的混合标样，标记为混标。

3．色谱条件
色谱柱：C18反相键合色谱柱
流动相：甲醇—醋酸铵溶液（体积比为5:95）
流速：1 ml/min 检测波长：230 nm 进样量：10 µL
4．标准品和样品测定
（1）色谱柱中分别进苯甲酸（50 µg/ml ）、山梨酸（50 µg/ml ）标准品，确定保留时间，填写下表：
保留时间（min ）
（2）记录混合标准品（25 µg/ml ）中两个物质的峰面积，并按下式计算样品中苯甲酸和山梨酸含量：
峰面积（mAU*min ） 【实验结果】
计算方法：
=x x s s A C C A ⨯⨯稀释倍数
式中：x C ——样品中被测物的含量（µg/ml ）；s C ——苯甲酸或山梨酸标准品的含量（µg/ml ）；x A ——样品的峰面积；s A ——标准品的峰面积。

【注意事项】
1．如果被测溶液含有气泡，对测定和仪器的使用均有影响，因此需要将被测溶液超声加热除去二氧化碳。

2．苯甲酸的灵敏波长为230 nm，山梨酸的灵敏波长为254nm，在此波长测定时苯甲酸的灵敏度较低。

因此波长选择230 nm。

3．平衡前用甲醇：水（5:95）冲洗柱子15min，再用甲醇—醋酸铵溶液（5:95）进行平衡。

i.开机顺序：高压输液系统、进样系统、柱温箱、检测器、电脑软件。

ii.使用盐做流动相的时候：水:甲醇=95:5冲洗柱子20min以上；然后用甲醇冲洗色谱柱20min以上，保存色谱柱。

iii.关机：清洗结束后，将泵流量设置为0，等压力降为0时，关掉泵电源，退出Breeze工作站，再关闭仪器各部分电源及计算机。

（蒋淑琴）。