荧光分析与化学发光分析

二、荧光定性分析
前文已述，由于物质分子 结构不同，所吸收的紫外波长 和发射的荧光波长具有特征性， 因此根据荧光物质的激发光谱 和发射光谱可鉴别化合物。最 直接的荧光定性分析方法是将 待分析的荧光发射光谱与预期 化合物的荧光发射光谱相比较。 这种方法比较简便并常能取得 较好的效果。图6-5(a)(b)是从 一个城市河流底泥试样中以荧 光法鉴定苯并(α)芘的实例。
具有刚性平面结构的分子有利 于荧光的产生。这可以比较荧光 素和酚酞的结构来说明: 又如芴和联苯在类似的测量条 件下的荧光效率分别为1.0和0.2。 这是由于芴上的亚甲基增强了分 子的刚性的缘故。 有些有机分子本身不会发荧光， 但与金属形成络合物后，由于增 强了他的刚性并大大减少了分子 的内振动作用，因而产生荧光。
化学发光分析是利用化学发光现象进行分析测定 的一类方法。与荧光分析一样，属于发光分析的范 畴。化学发光与荧光分子的发光相似，他的大部分 性质和荧光相同，不同点在于荧光的激发能来自外 光源的激发(照射)，而化学发光的激发能则产生自 化学反应，也即某些物质在进行化学反应时，由于 吸收了反应时产生的化学能，使分子或原子被激发， 这种受激分子或原子返回基态时，以光辐射的方式 释放能量。其光辐射的能量及光谱范围由化学反应 的物质所控制(处于可见光区)。每一个化学反应都 有其特征的化学发射光谱，其发光强度则与物质的 浓度有关，这是化学发光分析的依据。
荧光分析与 化学发光分析
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冯振涛 1203180234
§ 6-1 概 述
在前两章中我们讨论了物质对电磁辐射的吸收。吸收辐 射能后，处于电子激发态的分子在返回基态时以发射辐射的 方式释放这一部分能量，发射的辐射波长可以同分子所吸收 的辐射波长相同，也可不相同，这一现象称为光致发光。最 常见的两种光致发光现象是荧光和磷光。这两种光致发光过 程的机理不同(见§6-2)，可通过实验观察激发分子寿命的长 短来加以区别。对于荧光，当激发光停止照射后，发光过程 几乎立即停止(10-9 ～10-6)，而磷光则将持续一段时间(10-3 ～ 10s)。
此外还有其他类型的发光: 生物发光、热 致发光、放射发光(放射性分解引起激发)、声 致发光(声波激发)、点发光(电激发)、摩擦发 光(机械能激发)等。其中生物发光在分析化学 中得到重要的应用，在生物发光中导致激发 态的化学反应是在生物体内进行的。 磷光现象也被用于分析目的，但应用范围 有限。
§6-2 荧光分析法
在芳香化合物的芳环上进行不同基团的取代，对该化合物的荧光强度 和荧光光谱都将产生影响。通常有以下一些规律： (1) 给电子基团常使荧光增强，因为它们使最低激发单重态与基态之 间的跃迁几率增大。作用特别明显的基团是-NH2和-OH。 (2) 同π电子体系相互作用小的取代基如 -SO3H、 -NH3+和烷基等，对 荧光影响小。 (3) 吸电子基团如-COOH、-NO2、-N=N-及卤素会减弱甚至破坏荧光。 (4) 重原子或杂原子引入到π电子体系中常会减弱荧光，所以苯胺和苯 酚的荧光较苯强20倍，而硝基苯、苯甲酸和碘代苯则是非荧光或弱荧光 物质。表6-2表明取代基对苯的荧光的影响。
在基态分子的一个电子吸收光辐射而被激发的过程中， 通常它的自选不变(△S=0)，则激发态仍是单重态，如图6-2 所示。某些分子的激发单重态通过无辐射跃迁，在体系间跨 越的过程中发生自选反转，造成两个电子自旋平行的状态， 也即是激发三重态(6-2)。
这些分子在三重态稍事逗留后，在发射辐射而下 降至单重态各振动能级，所发射的光即为磷光(图61中f)。因自三重态降落至单重态时所给出的能量比 由单重第一电子激发态的最低振动能级直接降落至 单重基态时所给出的能量小，所以磷光的波长比荧 光波长长。如将温度降低，则由三重态降落至单重 态的时间将大为延迟，在很低的温度下，这些分子 有可能被“冻结”在三重态上。某些分子在跃迁至 三重态后，通过热激活作用可 以再回到第一电子激发态的 各个振动能级，然后再由第 一电子激发态的最低振动能 级降落至基态而发射出荧光， 这种荧光就被称为迟滞荧光 (图6-1中g和f)。
由于物质分子的结构不同，所吸收的紫外 光波长和发射的荧光波长也有所不同，利用 这个特征可以对物质进行定性鉴定。同一种 分子结构相同的物质，用同一种波长的紫外 光照射激发，可发射特征波长的荧光，其强 度与物质的量有关。据此，可利用某些物质 被紫外光照射后所发射的能反映出该物质特 性的荧光进行定性以及定量分析，这种分析 称为荧光分析。
3. 化合物的荧光和化学结构的关系 产生荧光必须具备两个条件。首先，物质分子必须具有 能吸收紫外或可见光的生色基团；其次该物质应具有一定的 荧光效率。分子中能发射荧光的基团，称为荧光基团。荧光 基团一定是生色基团，但生色基团未必一定是荧光基团。这 是由于它的荧光效率不高，而将所吸收的能量消耗于与溶剂 分子或其他溶质分子之间的相互碰撞，因此不能发射荧光。 荧光效率(ΦF)又称为荧光量子产率，是荧光物质吸光后所 发射的荧光量子数与所吸收的激发光的量子数的比值，即
已知电子激发态的自旋多重性为2S+1，S是自 旋量子数的代数和。大多数分子含有偶数电子，在 基态时这些电子成对地存在于各个原子或分子轨道 中。然而，根据保利不相容原理，在一个轨道上的 这两个电子的自旋是相反的，自旋量子数为+½(↑) 和-½(↓)。由于自旋成对的结果，大多数分子的自旋 量子数的代数和S=0，此时这个分子所处的电子能 态称为单重态(singlet state)，即2S+1=1。如果分子 中有一个未成对的电子，则S=½，而2S+1=2，此 种状态称为双重态(doublet state)。若分子中有两个 未成对的电子，此时S=1,2S+1=3，这种状态称为 三重态(triplet state)。
图6-5 苯并(α)芘和苯并(κ)芘的荧光激 发光谱及发射光谱
对于一些复杂的样品来说，光谱鉴定有时会发生困难。可 以采用标准加入的办法。即在试样中添加拟存在的组分，若 此组分存在，则在添加该组分的纯物质加入后，该物质的特 征峰将加强。 同步扫描荧光法可使光谱简化和窄化，是原来互相重叠的 光谱分辨开来，从而提高了荧光法的选择。同步扫描法通常 在固定Δλ时进行，此时使激发单色器和发射单色器的波长差 Δλ(Δλ= λ - λ )保持固定地同时进行扫描，所得谱图称为同步光 谱，所测得的荧光信号为同步信号。
(- 2.3 ε b C )
2 3
(6-5)
对于很稀的溶液，投射到试样溶液上被吸收的激发光不到2％ 时，也就是 ε b C =A＜0.05时，括弧内第二项以后可以忽略不计，则上式可简化为 F = 2.3 ΦF ε b C I0 (6-6) 对于一定的荧光物质，当分析条件及仪器使用条件确定后，上式中ΦF 、 ε 、b 、I0 均为常数，当被测荧光物质的浓度C很小时(ε b C ≤0.05)，式 (6-6)可写作 F = kC (6-7) 即荧光强度与荧光物质的浓度呈线性关系。但当ε b C 增大时，从式 (6-5)可以看出浓度与荧光强度之间呈非线性关系，若ε b C 很大时，式 (6-5)成为 F = I0 ΦF (6-8) 此时荧光强度与浓度无关。因此在荧光分析中，荧光强度和浓度的线 性关系仅限于很稀的试液。
一般所谓荧光现象是指物质吸收紫外光后所发射 出的可见荧光，以及吸收波长较短的可见光后所发 射出的波长较长的可见光荧光。但实际上荧光现象 并不限于这些情况。有些物质吸收了比紫外光波长 短得多的Ⅹ光后，发射出波长比所吸收的Ⅹ光波长 稍长的Ⅹ光，这称为Ⅹ光荧光，并据此建立了Ⅹ光 荧光分析法(有关此法的详细讨论见第十四章)。此 外，有些物质吸收了红外光后发射出波长稍长的红 外光，这称为红外光荧光。近年来，随着红外探测 器灵敏度的不断提高，红外光荧光分析法已应用于 许多有机物质的结构分析。
2. 荧光激发光谱和荧光发射光谱 荧光发射光谱简称荧光光谱，它表示该荧光物质 所发射的荧光中各种不同波长组分的相对强度，是 以荧光强度对荧光波长所绘制的曲线。 如果把某物质的荧光光谱与他的吸收光谱进行比 较，可发现这两种光谱之间存在着密切的“镜像对 称”关系。荧光光谱好像是吸收光谱照在镜子中的 像，但又比吸收光谱缺少了一些短波 长的吸收峰。图6-4表示蒽的乙醇 溶液的荧光光谱和吸收光谱。
总的荧光强度(F) 同试样吸收的激发光的光量子数目和荧光量子效率(ΦF) 成正比 -ε b C F = ΦF(I0-I)= I0 ΦF(1-10 ) (6-4) 将上式括弧中指数项展开可得
(- 2.3 ε b C ) F = I0 ΦF[ 2.3 ε b C- ——————— - ———————··· ] 2! 3!
如果把蒽的乙醇溶液装入试管，并放在液氮中， 并用紫外光照射，停止照射后，还能见到蒽溶液辐 射出的橙色光，而光的强度随时间的延长而逐渐变 弱，最终消失为止。这种即使停止用光激励，还能 继续发光的现象，就是蒽的磷光。图6-3表明了蒽吸 收了波长366nm的光，生成最低激发单重态S1， S1 辐射荧光到基态，同时激发单重态S1体系间跨越到 三重态T1，T1辐射磷光回到基态。
发射的量子数
ΦF=
吸收的量子数
此外，一种物质吸收光的能力及量子产率又与物质所处 的环境紧密相关，因为环境条件(如溶剂、pH、温度等)常常 是物质量子产率高低，甚至能否产生荧光的重要因素。
荧光通常发生于具有刚性平面结构的π电子共轭体 系的分子中，随着π电子共轭度和分子平面度的增 大，荧光效率也将增大，它们的荧光光谱也将移向 长波方向。任何有利于提高π电子共轭度的结构改 变，都将提高荧光效率，使荧光波长向长波长的方 向移动。 绝大部分的荧光(磷光)物质都是环状化合物(芳香 环或杂环)，芳香环越多，荧光效率越高，荧光光谱 也移向长波长方向(表6-1)。但环状结构并不是发生 荧光的绝对条件，如吡啶( )、呋喃( )、噻吩( ) 和吡咯( )是非荧光或弱荧光物质。但取代上苯基 后，由于共轭体系的增大，荧光效率将大为增加。 例如苯并呋喃( )、吲哚硫茚的荧光和笨相近。
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图6-7 菲、蒽、苝的光谱图
图6-8 萘、菲、蒽、苝、 并四苯混合物的常规荧光 光谱及混合物的同步光谱 图
图6-9 工厂区大气 样品萃取物中强致癌 物苯并(α)芘及其共 存物的荧光光谱和同 步光谱
三、 荧光定量分析
1. 荧光强度与浓度的关系 荧光的发光是由于物质在吸光之后发射出波长较长的荧光，因此溶液的荧光强度 与该溶液的吸光程度以及溶液中荧光物质的荧光效率有关。溶液被入射光(I0)激 发后，可以在溶液的各个方向观察到荧光强度(F)。但由于激发光源能量的一部 分被透过，因此，在透射光的方向观察荧光是不适宜的。一般是在与激发光源垂 直的方向观测。 根据比耳定律，透过光的比例为 I -ε b C (6-1) - =10 I0 式中： I0为入射光(激发光)强度； I为透过光强度；C为浓度，b为液层厚度；ε 为摩尔吸光系数。 相应地被吸收的部分是 I -ε b C (6-2) 1- - =1-10 I0 将上式重新排列，可得被吸收的光的量为 -ε b C I0-I= I0 (1-10 ) (6-3)
一． 二．
三．
四．
基本原理 荧光定性分析 荧光定量分析 荧光计与荧光分光光度计
一、基本原理
1. 荧光的发生 处于基态的分子吸收一定波长的辐射能后。电子发生跃迁。此时由 原来的能级跃迁至第一电子激发态或第二电子激发态中各个不同振动 能级和各个不同的转动能级，如图6-1中(a)和(b)所示。分子在吸收了 光而被激发至第一或更高的电子激发态的各个振动能级之后，通常急 剧降落至第一电子激发态的最低 振动能级，在这一过程中他们和 同类分子或其他分子(例如溶剂分 子)碰撞而消耗了相当于这些能级 之间的能量，因而不发射光(无辐 射跃迁，图6-1中c)。由第一电子 激发态的最低振动能级继续往下 降落至基态的各个不同能级时， 则以光的形式发射，所发生的光 即荧光(图6-1中d)。某些物质的分子在被激发至较高的能级并通过无 辐射跃迁降落至第一电子激发态的最低振动能级之后，并不继续直接 降落至基态，而是通过另一次无辐射跃迁至一个中间的亚稳的能级— —三重态(图6-1中e)。