第三章 分子荧光光度法
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分子荧光光度法测定荧光素
分子荧光光度法测定荧光素分子荧光光度法测定荧光素，听起来就像是个神秘的科学实验，其实呢，它其实没那么复杂，反而充满了趣味。
想象一下，在实验室里，灯光微微暗下来，空气中弥漫着一股神秘的气息，心里暗自期待着将要发生的事情。
你手里握着的不是一把利器，而是一台看似普通的仪器，但它却能把荧光素的秘密一一揭开。
这种荧光素，它可不是个平凡的家伙，想当年可是在实验室里风光无限。
它的光芒就像是夜空中的星星，闪烁着耀眼的光辉，吸引着每一个好奇的目光。
嘿，别以为这只是个简单的过程哦。
要搞清楚荧光素是什么。
它是某些生物体内的产物，比如小青蛙的皮肤，或者某些海洋生物的体内，想想就觉得有点神奇。
我们用分子荧光光度法，简单来说，就是通过一种仪器，看看荧光素在光照下的表现。
那种色彩斑斓的光芒，简直是让人目不暇接，仿佛置身于一个色彩缤纷的梦境。
你可以想象，它在光照下跳动的样子，就像小孩在草地上追逐蝴蝶，活泼又可爱。
在这过程中，首先要准备好荧光素的样品，可能是提取自生物体的，也可能是实验室合成的，反正你得确保它的纯度。
要是杂质多，那可就麻烦了，可能会影响测量的结果。
就像做菜一样，食材的新鲜度很重要嘛，调味料也要放对了。
我们需要选择合适的波长，调好仪器。
这时候，你就像是一个调酒师，认真调整每一个细节，确保最终的“饮品”味道独特。
波长选择得当，荧光素的光芒就会如期而至，照亮整个实验室。
荧光光度法的关键在于灵敏度。
就像是你去酒吧喝酒，调酒师的手艺越好，喝到的酒就越美味。
荧光素在合适的光照下，表现得淋漓尽致，发出的光越亮，代表浓度越高。
想想看，那一瞬间，仿佛时间都静止了，你心里感到一阵小小的自豪。
看到数据一目了然，结果清晰可见，简直就像发现了新大陆，内心的小宇宙瞬间爆发。
但注意啦，处理数据也不能马虎。
这就像是填报高考志愿一样，得认真对待，不能掉以轻心。
根据测得的荧光强度，计算出浓度，公式在手，心里有谱。
将实验结果与标准曲线对比，这一步可别大意，做错了可就前功尽弃，像是拼图时缺了几块，怎么也拼不完整。
分子荧光分光光度分析解析
分子荧光分光光度分析第_章第二章第三章荧光分析基本原理荧光分光光度计定性与定量分析第一章荧光分析基本原理第一节荧光产生与测量第二节荧光参数第三节荧光与分子结构的关系第四节影响荧光测量的因素一、分子能级二、荧光产生三、磷光产生荧光测量一. 分子能级分子的结构比原子复杂，最简单的双原子分子，有配对电子形成化学键维系其结构，大多数分子有偶数个电子，每个轨道中的电子自旋相反，这种分子状态称为单线态。
当分子价电子被激发后，电子自旋取向有两种。
与低能级电子自旋方向相反，为单线态；与低能级电子自旋方向相同，为三线态（亦称三重态）。
单线态与三线态性质不同，单—单线态跃迁几率大，激发态平均寿命108So单—三线态跃迁几率小, 激发态平均寿命可达1S O二、荧光的产生分子荧光是一种光致发光，与紫外吸收过程相反。
在室温下，大多数分子处在基态的最低振动能级，当吸收特征频率光（激发光）后，可以激发到第一、二电子激发态单线态的各个不同振动能A | 禺久3级的各个转动能级（吸收光谱），通过无辐射跃迁（内转换）, 回到第一电子激发态的最低振动能级后，再跃迁到基态的各个振动能级，以光的形式弛豫便产生荧光。
分子荧光为单―单线态跃迁，荧光寿命仅10“s,激发光消失，荧光立即消失。
从荧光的产生可看出:①分子荧光的产生是由第一电子激发态的最低振动能级开始，与荧光分子被激发到哪个能级无关，故荧光光谱形状与激发光波长无关。
②荧光发射之前经内转换损失一部分能量，荧光波长比激发光波长长。
三、磷光的产生根据洪特规则，在不同轨道上有两个自旋相同电子的分子能量（三形态），低于同一轨道上有两个自旋相反电子的分子能量（单线态）。
因此，在太阳的分子轨道上, 处于三线态分子的能量低于单线态分子。
但是，处于第一电子激发三线态的一个振动能级几乎与第一电子激发单线态最低振动能级的能量相同。
这样，由第一电子激发单线态的最低振动能级，有可能通过系间跨越，跃迁至第一电子激发三线态，再经振动弛豫跃迁至最低振动能级，由此激发态跃迁至基态便产生磷光。
荧光分光光度法
整理课件
在生物、医药、环境和石油工业等诸多 领域，荧光分析法都有广泛的应用。不仅能 直接或间接地分析众多的有机化合物，而且 还能利用与有机试剂间的反应进行许多无机 元素的测定。
整理课件
随着科技的发展进步，荧光这种光致发 光（photoluminescence）的本质被进一步揭 开。
❖ 物质除了受紫外-可见光照射后会发出紫外 和可见（UV-Vis）荧光之外，受其它各种不 同波长光的照射之后，同样也有发光现象。 例如：X-荧光、红外荧光等。
整理课件
a. 直接比较法
设CX、CS分别为试样和标样溶液的浓度， FX、FS和FX0、FS0分别为试样、标样的荧光 值和试样、标样的本底荧光值，因为
FX - FX0=KCX、 FS - FS0=KCS, 所以： Cx/Cs=( FX - FX0)/( FS - FS0) 或
Cx =Cs( FX - FX0)/( FS - FS0) 直接比较法简单快速，它要求被测样品 浓度与其相应的荧光值必须处于线性范围内。
光光谱外，大多数无机盐类金属离子，在溶 液中只能发生无辐射跃迁，因而不能产生荧 光。
但是，在某些情况下，金属螯合物却能 产生很强的荧光，并可用于痕量金属离子的 测定。
整理课件
不少有机化合物虽然具有共轭双键，但 由于不是刚性结构，分子处于非同一平面， 因而不发生荧光。
若这些有机化合物和金属离子形成螯合 物后，伴随着分子的刚性增强，平面结构增 大，常会发出荧光。
整理课件
3.3 荧光分析的方法及影响因素 1. 荧光参数 （1）激发光谱和发射光谱
荧光的激发光谱和发射光谱是用荧光 法进行物质的定性、定量分析的基本参数 和依据。
整理课件
a. 激发光谱：选择并固定发射波长EM和狭 缝宽度S，让激发单色器进行波长扫描，记 录荧光强度（F）随激发波长的变化而变化 的关系曲线，叫激发光谱。
在生物、医药、环境和石油工业等诸多 领域，荧光分析法都有广泛的应用。不仅能 直接或间接地分析众多的有机化合物，而且 还能利用与有机试剂间的反应进行许多无机 元素的测定。
整理课件
随着科技的发展进步，荧光这种光致发 光（photoluminescence）的本质被进一步揭 开。
❖ 物质除了受紫外-可见光照射后会发出紫外 和可见（UV-Vis）荧光之外，受其它各种不 同波长光的照射之后，同样也有发光现象。 例如：X-荧光、红外荧光等。
整理课件
a. 直接比较法
设CX、CS分别为试样和标样溶液的浓度， FX、FS和FX0、FS0分别为试样、标样的荧光 值和试样、标样的本底荧光值，因为
FX - FX0=KCX、 FS - FS0=KCS, 所以： Cx/Cs=( FX - FX0)/( FS - FS0) 或
Cx =Cs( FX - FX0)/( FS - FS0) 直接比较法简单快速，它要求被测样品 浓度与其相应的荧光值必须处于线性范围内。
光光谱外，大多数无机盐类金属离子，在溶 液中只能发生无辐射跃迁，因而不能产生荧 光。
但是，在某些情况下，金属螯合物却能 产生很强的荧光，并可用于痕量金属离子的 测定。
整理课件
不少有机化合物虽然具有共轭双键，但 由于不是刚性结构，分子处于非同一平面， 因而不发生荧光。
若这些有机化合物和金属离子形成螯合 物后，伴随着分子的刚性增强，平面结构增 大，常会发出荧光。
整理课件
3.3 荧光分析的方法及影响因素 1. 荧光参数 （1）激发光谱和发射光谱
荧光的激发光谱和发射光谱是用荧光 法进行物质的定性、定量分析的基本参数 和依据。
整理课件
a. 激发光谱：选择并固定发射波长EM和狭 缝宽度S，让激发单色器进行波长扫描，记 录荧光强度（F）随激发波长的变化而变化 的关系曲线，叫激发光谱。
荧光分析法的应用
—NH2， — NHR ， —NR2， — OH， — OR ， — CN
化合物
苯
苯酚
苯胺 苯基氰
苯甲醚
λ
em max
(nm)
278~310 285~365 310~405 280~390 285~345
相对荧光强度
10
18
20
20
20
b.吸电子取代基减弱荧光、加强磷光
—C=O， — COOH ， —NO2
第一激发单重态的能级轨道上，也可能跃迁至能级更高的单
重态上，这种跃迁是符合光谱选律。如果跃迁至第一激发三
重态轨道上，则属于禁阻跃迁。
电子激发单重态与三重态示意图
在单重激发态中，电子的自旋方向仍然和处于基态轨道的电子 配对，表现出抗磁性，其平均寿命为10－5～10－8s； 在三重激发态中，两个电子平行自旋，表现出顺磁性，其平均 寿命为10－4～1s。
分子吸收辐射后可能激发为第一电 子激发态（或更高激发态）的任一振动 能级，这种激发态分子以热的形式损失 其振动能后下降为第一电子激发态的最 低振动能级（无辐射跃迁）；然后再以 辐射的形式跃迁为电子基态的任一振动 能级，即产生荧光，并进一步以无辐射 跃迁形式回到基态的最低振动能级。
二 分子荧光的性质
3、分子荧光（磷光）产生示意图
每个分子具有一系列严格分立的能级，称为电子能 级，每个电子能级中又包含了一系列的振动能层和转 动能层。图中基态用S0表示，第一电子激发单重态和 第二电子激发单重态分别用S1、S2表示，0、1、2、 3⋯表示基态和激发态的振动能层（见下图），第一、 二电子的激发三重态分别用T1和T2表示。
位移到较长的波长处，称为Stokes位移。
原因：激发与发射之间产生了能量损耗
分子荧光光度法
体系跨越 S1*→T1*
③ 外转换
受激分子与溶剂或其它溶质分子间的相互 作用和能量转移。
外转换使分子的荧光或磷光减弱甚至消失， 这一现象称为“熄灭”或“淬灭”。
2. 辐射跃迁 ---- 荧光和磷光
处于电子激发态的分子（S1*或 T1*）通过光发射 回到电子基态，称为辐射跃迁
S1* → S0
---- 荧光
③ 电子能级分类：
电子自旋配对 ---- 单重态或单线态 S 自旋方向相反，S=(+ 12)+(- 12)=0, M=1
电子自旋非配对 ---- 三重态或三线态 T 自旋方向相同，S=1, M=3
基态能级 ---- S0
注意： a. 单线态是反磁性，三线态是顺磁性的 b. 允许跃迁：单线态→单线态，S*→S0，S0→S1、S2等 c. 禁阻跃迁：单线态→三线态，S0→T1、T2等 d. 能量大小：S1>T1 e. 寿命：激发单线态 ~ 10-8 s，激发三线态 10-4 ~ 1s
0‘
←F
S0
λ
↑
4
3 2
长
1
波
0
F→ 分子基态和激发态的位能曲线及电子跃迁示意图
三、物质分子结构与荧光的关系
（一）荧光强度（F）
1. 荧光量子效率 ΦF 激发态分子中以发射荧光的光量子数目和
分子吸收激发光的光量子总数之比：
F
发射荧光的量子数目 吸收激发光的量子数目
[ΦF∈（0，1）]
2. 荧光强度 F 荧光强度与吸收光的强度 Ia有关
① 振动驰豫
外转换
较高能级分子与其它分子（样品或溶剂）碰撞， 能量变为热能。
② 内转换和体系跨越 当两个相邻电子能级相距较近以致其振动能级重叠，
第三章 荧光分光光度法
化学工程与现代材料学院
荧光光谱（fluorecence spectrum）：固定激发 光波长（为最大激发波长）和强度，而让荧光物质 发射的荧光通过发射单色器分光扫描并检测不同发 射光波长下的荧光强度，以发射波长为横坐标，荧 光强度为纵坐标作图，得到物质的荧光光谱。
荧光物质的最大激发波长（lex）和最大发射 波长（lem）是鉴定物质的根据；也是定量测定最 为灵敏的条件。
1.标准曲线法 步骤： 1.配制不同浓度的标准 溶液 2.做IF～C关系曲线 3.求得浓度 IF IFX
CX 注意：固定仪器和测定条件
化学工程与现代材料学院
C
标准曲线
2.直接比较法 步骤： 1.配制标准溶液和试样溶液 2.测IF 3.求浓度
I F ( S ) I F ( 0) I F ( X ) I F ( 0) CS CX
化学工程与现代材料学院
五、影响荧光强度的外部因素
1）温度
温度降低，荧光效率和荧光强度升高。
2）溶剂 随着溶剂的极性的增加，荧光物质的π→π*
跃迁几率增加，荧光强度将增强，荧光波长也
发生红移；溶剂粘度降低，荧光强度降低；溶
剂应达到足够的纯度。
化学工程与现代材料学院
3）pH值 具酸或碱性基团的荧光物质，在不同pH值时，其 结构可能发生变化，因而荧光强度将发生改变。
1.跃迁类型 π →π*跃迁或n→π*跃迁 2.共轭π键结构（芳香环或杂环） 共轭度越大，荧光效率越大，荧光波长长移
lem
f
lex
205nm 278nm 0.11
286nm 321nm 0.29
356nm 404nm 0.36
化学工程与现代材料学院
荧光光谱（fluorecence spectrum）：固定激发 光波长（为最大激发波长）和强度，而让荧光物质 发射的荧光通过发射单色器分光扫描并检测不同发 射光波长下的荧光强度，以发射波长为横坐标，荧 光强度为纵坐标作图，得到物质的荧光光谱。
荧光物质的最大激发波长（lex）和最大发射 波长（lem）是鉴定物质的根据；也是定量测定最 为灵敏的条件。
1.标准曲线法 步骤： 1.配制不同浓度的标准 溶液 2.做IF～C关系曲线 3.求得浓度 IF IFX
CX 注意：固定仪器和测定条件
化学工程与现代材料学院
C
标准曲线
2.直接比较法 步骤： 1.配制标准溶液和试样溶液 2.测IF 3.求浓度
I F ( S ) I F ( 0) I F ( X ) I F ( 0) CS CX
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五、影响荧光强度的外部因素
1）温度
温度降低，荧光效率和荧光强度升高。
2）溶剂 随着溶剂的极性的增加，荧光物质的π→π*
跃迁几率增加，荧光强度将增强，荧光波长也
发生红移；溶剂粘度降低，荧光强度降低；溶
剂应达到足够的纯度。
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3）pH值 具酸或碱性基团的荧光物质，在不同pH值时，其 结构可能发生变化，因而荧光强度将发生改变。
1.跃迁类型 π →π*跃迁或n→π*跃迁 2.共轭π键结构（芳香环或杂环） 共轭度越大，荧光效率越大，荧光波长长移
lem
f
lex
205nm 278nm 0.11
286nm 321nm 0.29
356nm 404nm 0.36
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分子荧光分光光度法实验技术
标准样品设置
2019/12/31
待测样品设置
2019/12/31
空白校零
2019/12/31
开始测定
2019/12/31
2019/12/31
2019/12/31
重新计算
2019/12/31
2019/12/31
九、荧光光度计使用注意事项：
1、比色皿使用之前应清洗干净。若比色皿很脏， 清洗方法为：先将比色皿置于铬酸洗液中浸泡半 小时左右，再用蒸馏水洗净，凉干留用。
2019/12/31
一、荧光分析法
物质的基态分子受一激发光源的照 射，被激发至激发态后，在返回基态时， 发射出与吸收光波长相等或较长的荧光。 若物质分子用X射线或红外光激发，则分 别产生X射线荧光或外光荧光。
2019/12/31
一、荧光分析法
通常所指的分子荧光是指紫外-可见光 荧光，即利用某些物质受到紫外光照射后， 发射出比吸收的紫外光波长相等或更长的 紫外荧光或可见荧光，通过测定物质分子 产生的荧光强度进行分析的方法称为荧光 分析。
2019/12/31
七、荧光分光度计的性能
可检测荧光、磷光及生物发光 扫描速度快，可达24000 nm/分，数据采
集速率达80次/秒 波长范围：190-1100 nm 光谱带宽：1.5、2.5、5、10和20 nm五档
切换 具有液体池和固体池，并具有自动控温设备。
2019/12/31
5、罩上仪器罩，打扫室内卫生，并在仪器使用登 记本上填写使用记录。
2019/12/31
操作软件包
2019/12/31
定性分析操作
2019/12/31
预扫描
2019/12/31
2019/12/31
分子荧光光度法
分子荧光光度法
分子荧光光度法是一种常用于检测物质浓度和反应动力学的分析方法。
它基于分子在受到光激发后发射荧光的原理，通过测量荧光的强度来确定物质的浓度。
在分子荧光光度法中，首先需要选择一个适合的激发波长，以激发待测物质中的荧光染料或标记物。
当激发波长的光照射到样品中时，样品中的分子吸收光能并跃迁到激发态。
在激发态停留的时间足够长时，分子会发生非辐射跃迁，即释放出荧光。
荧光的强度与待测物质的浓度成正比，因此可以通过测量荧光的强度来确定物质的浓度。
分子荧光光度法具有许多优点。
首先，它具有高灵敏度和高选择性，可以检测到极低浓度的物质。
其次，它具有快速和简便的特点，可以在短时间内完成测定。
此外，分子荧光光度法还具有广泛的应用领域，包括环境监测、生物学研究、医学诊断等。
然而，分子荧光光度法也存在一些限制。
首先，荧光信号受到许多因素的影响，如环境条件、荧光染料的性质等。
因此，在进行分子荧光光度法测定时，需要对这些因素进行严格的控制。
其次，某些样品可能会产生背景荧光干扰，这会降低测定的准确性。
因此，需要采取适当的方法来消除背景荧光的影响。
分子荧光光度法是一种重要的分析方法，它在物质浓度测定和反应
动力学研究等方面具有广泛的应用。
通过合理选择激发波长和采取适当的控制措施，可以获得准确和可靠的分析结果。
这种方法的发展将进一步推动科学研究和实际应用的进步。
第三章-荧光分析
一、基本装置及主要部件功能
光 源 单色器
激发单色器
ex
I0
Ia 样品池 If 单色器
发射单色器
It
em
记录仪 检测器
1. 光源
作用：提供稳定、发射强度大的辐射
常见光源：
①荧光光度计，以溴钨灯(300～700nm)为光源。 ②荧光分光光度计，以氙灯(250～600nm)为光源。
2. 单色器
本章小结
一、分子荧光基本原理
物质受到光照射时，吸收某种波长的 光之后还会发射出比原来所吸收光的波长 更长的光，这种现象称为光致发光，最常 见的光致发光现象是荧光和磷光。
激发
hv
激发态
去激发
hv f 基态
内转换 S2
振动弛豫 体系间跨越 T2
T1 发 射 荧 光
S1
能 量
外转换
发 射 磷 光
S0
通过有机化合物与金属离子形成配合物
HO
OH
HO
O
OH
C
O C O
C
O C O
酚酞
荧光素
f=0
f = 0.92
-OH N
Mg
-O N Mg1/2
8-羟基喹啉 弱荧光
8-羟基喹啉镁
强荧光
分子的刚性共平面使荧光效率增大：
①分子共平面越大，共轭程度越高。
②分子共平面越大，刚性越强，振动越 小，与其他分子发生碰撞造成无辐射 跃迁几率减小。
5. 读出装置
①记录仪 ②阴极示波器 ③显示器
光 源
单色器
样品池 If 单色器
It
记录仪
检测器
2．荧光光度计与紫外－可见分光光度计区别：
新编仪器分析第四版第三章分子发光分析法
a. 化学反应必须产生足够的化学能，且被发光物质
吸收形成电子激发态。
在紫外可见光区观察化学发光，160~420kJ· mol-1激发能。 化学反应多是在有O3、H2O2等参加的高能反应。
b. 处于激发态分子能够以光的形式释放能量返回基态
45
2.化学发光效率
化学发光效率CL
激发态分子的产率
发射的光子数 CL Ce em 参加反应的分子数 激发态分子数 发射的光子数 参加反应的分子数 激发态分子数
第三章 分子发光分析法
1
第一节 概述 分子发光（molecular luminescence）
某些物质分子吸收能量跃迁到较高的电子激发态后， 返回基态的过程中伴随发光的现象。以此建立的起来 的分析方法很为非自发光分析法。
hγ
M+ 能量 →M＊
M
2
分子发光分析法: 根据物质所发射的光谱线的位置及强度 进行物质鉴定和含量测定的方法。
620
17
二、分子荧光的性质
1、荧光激发光谱
18
（1）激发光谱的绘制
固定第二单色器波长，改变第一单色器波长进行扫描 反映了激发光波长连续变化时，某一固定荧光测定波长强度
的变化。Fλ—纵坐标， λex(激发波长)—横坐标
光源 第一单色器 或滤光片
激发
Fλ
记录仪 荧光
固定em 荧光波长
第二单色器 或滤光片
22
镜像关系?
IF4800
4400
固定em=620nm(MAX)
1→ 4 1→ 3
固定ex=290nm (MAX)
1→4 1→3 1→2
4 3 2 1
S1
4000 3600 3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400
吸收形成电子激发态。
在紫外可见光区观察化学发光，160~420kJ· mol-1激发能。 化学反应多是在有O3、H2O2等参加的高能反应。
b. 处于激发态分子能够以光的形式释放能量返回基态
45
2.化学发光效率
化学发光效率CL
激发态分子的产率
发射的光子数 CL Ce em 参加反应的分子数 激发态分子数 发射的光子数 参加反应的分子数 激发态分子数
第三章 分子发光分析法
1
第一节 概述 分子发光（molecular luminescence）
某些物质分子吸收能量跃迁到较高的电子激发态后， 返回基态的过程中伴随发光的现象。以此建立的起来 的分析方法很为非自发光分析法。
hγ
M+ 能量 →M＊
M
2
分子发光分析法: 根据物质所发射的光谱线的位置及强度 进行物质鉴定和含量测定的方法。
620
17
二、分子荧光的性质
1、荧光激发光谱
18
（1）激发光谱的绘制
固定第二单色器波长，改变第一单色器波长进行扫描 反映了激发光波长连续变化时，某一固定荧光测定波长强度
的变化。Fλ—纵坐标， λex(激发波长)—横坐标
光源 第一单色器 或滤光片
激发
Fλ
记录仪 荧光
固定em 荧光波长
第二单色器 或滤光片
22
镜像关系?
IF4800
4400
固定em=620nm(MAX)
1→ 4 1→ 3
固定ex=290nm (MAX)
1→4 1→3 1→2
4 3 2 1
S1
4000 3600 3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400
现代生物仪器分析第三章 分子荧光光谱法
第二节 荧光分析的原理
（一）荧光发生机理 物质的基态分子受一激发光源的照射， 被激发至激发态，在返回基态时，产生 波长与入射光相同或较长的荧光。 通过测定物质分子产生的荧光强度进行
分 析 的 方 法 称 为 荧 光 分 析 (fluorescence analysis)。
1、分子的激发态
荧光和磷光这两种光致发光过程的机理不同， 可从实验观察激发态分子寿命的长短来加以区 别： 对于荧光来说，当激发光停止照射后，发光 过程几乎立即停止（在10-9～10-6秒，荧光寿 命fluorescence life time ）。 磷光则将持续一段时间（在10-3～10秒）。
荧光分析法发展简史
2、分子荧光和磷光的产生
分子在室温时基本上处于电子能级的基态。当吸 收了紫外—可见光后，基态分子中的电子只能跃 迁到激发单线态的各个不同振动—转动能级，根 据自旋禁阻规律，不能直接跃迁到激发三重态的 各个振--转能级。 处于激发态的分子是不稳定的，它可能通过辐射 跃迁和无辐射跃迁等分子内的去活化过程释放多 余的能量而返回至基态，发射荧光是其中的一条 途径。
世界上第一次记录荧光现象是16世纪 西班牙的内科医生和植物学家 N.Monardes。 1575年他提出在含有一种木头切片的 水溶液中，可观察到极可爱的天蓝色。
1852年，stokes在考察奎宁和叶绿素的 荧光时，用分光光度计观察到其荧光的 波长比入射光的波长稍微长些，从而导 入了荧光是光发射的概念。 18工作。应用铝—桑色素配 合物的荧光进行铝的测定。 19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行 的，直到1928年，才由Jette和West完成 了第一台荧光计。
激发单重态与激发三重态的性质不同
分子荧光光谱法(原理和方法)
1. 激发
在室温下物质分子大部分处于基态的最低振动能级且电子自旋配对为单重
态．当吸收一定频率的电磁辐射发生能级跃迁时，可上升到不同激发态
的各振动能级，其中多数分子上升至第一激发单重态这一过程约需１０-
15秒.
激发
2 去活化过程
激发态分子的失活: 激发态分子不稳定，它要以辐射 或无辐射跃迁的方式回到基态
kf
k f ki kec kic
ห้องสมุดไป่ตู้
凡是使荧光速率常数kf增大而使其他失活过程 （系间窜越、外转换、内转换）
的速率常数减小的因素都可使荧光增强。
根据朗伯-比尔定律
Ia=I0-I=I0(1-10-εbc)
则F=ΦI0（1-10-εbc)=φI0(1-e-2.303εbc) 又因
e-2.303εbc=1-2.303 εbc-(-2.303 εbc)2/2!-(-2.303 εbc)3/3!
对于很稀的溶液，投射到样品溶液上的被吸收的激发光不到2%时， 即εbc＜=0.05时，上式的第二项后的各项可以忽略不计。则
F = φI0[1-(1-2.303 εbc)]=2.303 φ I0 εbc
当I0一定时 并且浓度C很小时,荧光强度与荧光物质浓度成正比
F = K·C
(K = 2.303 φ I0 εb)
荧光团杂化纳米二氧化硅微球
Molecular fluorescence spectroscopy
概述
分子荧光光谱法(Molecular fluorescence spectroscopy )又称
为荧光光谱法或荧光分析法．是以物质所发射的荧光强度 与浓度之间的线性关系为依据进行的定量分析，以荧光光 谱的形状和荧光峰对应的波长进行行的定性分析．
第三章 分子荧光光度法
其原因在于它们的分子和离子的电子构型不同。 如苯胺在pH=7∼12的溶液中会发出蓝色荧光， 而在pH2或13的溶液中，都不发荧光：
上式表明能发射荧光的是苯胺分子，而苯 胺离子是不发射荧光的。
金属离子与有机试剂形成的荧光化合物受 pH值的影响更大。
pH一方面影响配合物的形成，另一方面影响配 合物的组成。
而第一电子激发态中各振动能级的分布与基 态中各振动能级的分布相类似，因此荧光光谱与 吸收光谱形状相似，并呈镜像对称关系。
三．荧光和分子结构的关系 产生荧光的分子必须具备下列条件：
(一)物质分子必须具有与所照射的光辐射相同频 率的吸收结构，才能吸收激发光。
(二)吸收了与其本身特征频率相同的能量之后， 必须具有一定的荧光效率。 荧光效率也称为荧光量子产率，表示物质发
射荧光的本领，为发出荧光量子数和吸收激发 光量子数的比值。
值一般＜1，如罗丹明B的乙醇溶液，=0.97； 蒽乙醇溶液的=0.30；菲乙醇溶液的=0.10。
有许多吸光物质不发荧光的原因在于激发态 分子释放激发能（去活化）过程中，除荧光发射 以外，还有许多非辐射跃迁与之竞争。显然荧光 效率与物质结构以及所处的环境密切相关。
当两电子能级非常靠近以至其振动能级有 重叠时，内转移就容易发生。
如激发单重态S1的高振动能级常与S2的低振 动能级重叠，两激发态的位能一样，内转移过程 即容易发生，一般需10-13~10-11秒的时间。
(4)体系间的系间窜跃： 受激分子从激发单重态转至能量较低的激发
三重态的过程称为系间窜跃。
如果两个能态的振动能级重叠时，这种跃 迁的几率较大；这些处于激发三重态的分子， 继续通过辐射光能而回到基态单重态的各振动 能级，所发出的辐射称为磷光。
一.光源 在紫外可见光区，可供荧光激发用的光源
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测器，检测方向与激发光成直角。
由光源发射的光经激发单色器得到所需的激发波 透光强度为I；荧光物质被激发后，发射荧光F。 为消除入射光的影响，荧光测量通常在与激发光 成直角的方向上进行。
长I0，经样品池后，一部分光能被荧光物质吸收，
第二发射单色器的设置是为了消除可能共存的
其它光线的干扰，如散射光以及溶液中其它杂 质所发生的荧光，以获得所需要的荧光，让其 作用于检测器上，得到相应的电信号，经放大 后作记录。 §3-5 分子荧光光度法的特点及应用
一.荧光光度法的特点 1.灵敏度
与紫外—可见光度法比较，荧光法检测是在
黑背景下进行，所以其灵敏度要高出2∼4个
数量级，测定下限为0.1∼0.001g/mL。
2.选择性强
荧光法既能依据特征发射又能依据特征吸收
来检定物质。如某几个物质的发射光谱相
似，则可从激发光谱的差异来区分；而如果
它们的激发光谱相同，则可通过发射光谱将
激发光谱和荧光发射
光谱的特点：
(1)荧光发射光谱与激
发波长无关，如前所述，
无论引起物质激发的波
长是1还是2，但荧光
发射波长都为3。
这是由于分子吸收了不同能量的光子可由基 态激发到不同的电子激发能级而产生几个吸收
带；由于较高激发态可通过内转换及振动弛豫
回到第一激发态的几率很高，远远大于由高能
决定于第一电子激发态中各振动能级的分布状况；
三．荧光和分子结构的关系 产生荧光的分子必须具备下列条件： (一)物质分子必须具有与所照射的光辐射相同频
率的吸收结构，才能吸收激发光。
(二)吸收了与其本身特征频率相同的能量之后， 必须具有一定的荧光效率。 荧光效率也称为荧光量子产率，表示物质发 射荧光的本领，为发出荧光量子数和吸收激发 光量子数的比值。
级激发态直接发射光子的速度。 故在荧光发射时，无论用哪一个波长的光 辐射来激发，电子都从第一激发态的最低振动 能级返回到基态的各个振动能级，所以荧光发
射光谱与激发波长无关，只出现一个荧光谱带。
(2)荧光光谱与吸收光谱呈镜像对称关
系
将某一荧光物质的荧光光谱和它的吸收光
谱对比时，将发现这两个光谱间呈镜像对称关系。
效率成正比：
F Ia
根据Beer定律：A=lg(I0/It)=bc Ia=I0-It=I0· (1-10-bc) 代入上式： F I0 (1 e2.303 bc ) 式中I0是激发光强度, 是摩尔吸光系数, b 是 液层厚度, c是样品浓度。
ห้องสมุดไป่ตู้
又∵ e2.303 bc
值一般＜1，如罗丹明B的乙醇溶液，=0.97； 蒽乙醇溶液的=0.30；菲乙醇溶液的=0.10。 有许多吸光物质不发荧光的原因在于激发态 分子释放激发能（去活化）过程中，除荧光发射 以外，还有许多非辐射跃迁与之竞争。显然荧光 效率与物质结构以及所处的环境密切相关。
什么样的物质会发生荧光?
激发光谱与吸收光谱不仅形状相同,而且波
长位置也一样,这是因为物质分子吸收能量的过
程就是被激发的过程.
二.荧光发射光谱 简称荧光光谱或发射光谱。如果将激发光波 长固定在最大激发波长处，然后扫描发射波长， 测定不同发射波长处的荧光强度，即得到荧光发
射光谱。下图为萘的激发光谱、荧光发射光谱和
磷光发射光谱。
上式仅适用于稀溶液，对于较浓的溶液，
其bc超过0.05时，F与c的线性关系将发生偏离。 由于浓度过高，使荧光物质分子间以及荧
光物质分子同溶剂分子间的碰撞增加，导致无
辐射去活增加而发生自熄灭。 另外在荧光发射波长同化合物的吸收波长 有重叠的情况下，物质发射出的荧光可能有部
分被自身吸收，造成结果负偏差。
时间经紫外光照射，其F值没有显著变化；但
如果溶液的浓度在0.02g/mL以下时，F值就有
显著变化。
二.溶剂 同一种荧光物质在不同溶剂中，其F值和荧 光光谱都可能有显著不同。一般荧光峰的波长 随溶剂介电常数的增大向长波长方向移动，即 增大。
但也有相反的情况，如苯氨萘磺酸在戊醇、 丁醇、丙醇、乙醇、甲醇中,随极性，；且 荧光光谱的位置与F和溶剂极性之间的关系没有 明显的规律。 三.温度 温度对荧光强度的影响较敏感。一般来说， 温度，荧光强度。如荧光素的乙醇溶液在 0℃以下，每降低10度，荧光效率约增加3%。
其原因在于它们的分子和离子的电子构型不同。 如苯胺在pH=7∼12的溶液中会发出蓝色荧光， 而在pH2或13的溶液中，都不发荧光：
上式表明能发射荧光的是苯胺分子，而苯 胺离子是不发射荧光的。 金属离子与有机试剂形成的荧光化合物受 pH值的影响更大。
pH一方面影响配合物的形成，另一方面影响配 合物的组成。
第三章 分子荧光光度法
§3-1 分子荧光概述 分子荧光法的分 析一般都在溶液 中进行，如前所 述每个分子都具
有一系列严格的
分立能级：
图中S0表示分子
的基态，S1、S2
分别为第一激发
单重态和第二激
发单重态；T为激
发三重态；基态 和激发态都存在 几个不同的振动 能级。P.82
物质吸收了电磁辐射并发射出荧光的过程中 大致会经历以下几个过程：
(4)体系间的系间窜跃：
受激分子从激发单重态转至能量较低的激发
三重态的过程称为系间窜跃。
如果两个能态的振动能级重叠时，这种跃 迁的几率较大；这些处于激发三重态的分子， 继续通过辐射光能而回到基态单重态的各振动 能级，所发出的辐射称为磷光。 由于不同物质的分子结构及分析时所处的
化学环境不同，因此各去活化过程的速度也就
但很多无机阳离子能与一些有机试剂形成荧光 配合物而被测量。目前以形成荧光配合物方式 进行测定的元素达到了60余种。而常采用该方 法测定的元素主要有Be、Al、B、Ga、Se、Mg 及某些稀土元素。 某些阴离子如氟、氰等的存在能使共存物 质的荧光减弱，即所谓的熄灭效应，根据这一 效应可测定氟和氰等离子的浓度。
(2.303 bc)2 (2.303 bc)3 1 2.303 bc 2! 3!
当bc≤0.05时，可略去第二项后的各项。 ∴ e-2.303bc =1–2.303bc F=I0∙(1–e-2.303bc) F=I0∙[1–(1–2.303bc)]=2.303I0bc 当激发光(入射光)强度I0一定，并且浓度c 很小时，荧光强度F与荧光物质浓度c成正比。 即： F=K· c
其区分。
3.试样量少，方法简便
因灵敏度较高，所以试样用量较少，如采用微 量池测定，用量仅为10L。 4.提供较多的物理参数 该方法能提供激发光谱和发射光谱以及荧光强 度、荧光效率、荧光寿命等许多物理参数。
这些参数反映了物质的各种特性，从不同的角
度提供被研究的分子的各种信息。
荧光法的缺点是它的应用范围还不够广泛。 原因：(1)本身能发荧光的物质相对较少。可采 用加入某种试剂的方法将非荧光的物质转化为 荧光物质进行分析；(2)由于方法灵敏度高，测 定时对环境较敏感，所以干扰因素也较多。 二.荧光分析法的应用 1.无机物分析 无机离子中除少数离子外，一般不发荧光。
吸收光谱是物质分子的外层电子由基态激
发至第一电子激发态的各振动能级所致，其形状
荧光光谱是激发态分子从第一电子激发态 的最低振动能级回到基态中各振动能级所致， 其形状决定于基态中各振动能级的分布状况； 而第一电子激发态中各振动能级的分布与基 态中各振动能级的分布相类似，因此荧光光谱与 吸收光谱形状相似，并呈镜像对称关系。
如镓离子与邻苯二羟基偶氮苯在pH3∼4的
溶液中形成1:1配合物，产生荧光。但在pH6∼7 的溶液中则形成1:2配合物，不产生荧光。 §3-4 荧光光度计 荧光分析所用的仪器种类很多，简单的有目 测荧光计，光电荧光计等。较精密的有荧光分光 光度计；它们的结构、功能和价格差别很大。
组成荧光光度计的有四大部分：激发光源、样 品池、 测量荧光的检测器及用于选择激发波 长和荧光波长的滤光片或单色器。
不同。如果荧光发射过程比其他去活化过程的
速度快，就可看到荧光发射现象；相反，则看
不到荧光，或其强度减弱。
§3-2 荧光分析法定量依据
任何荧光化合物都具有两个特征光谱：激发 光谱和发射光谱。它们是荧光定性和定量分析的
基本参数和依据。
一.激发光谱 以激发光波长为横坐标，荧光强度为纵坐 标，绘得的谱图称荧光化合物的激发光谱。 绘制激发光谱曲线时，在荧光的最大发射波 长处，改变激发光波长来测量相应的荧光强度。
实验表明：
1.具有共轭双键结构体系的分子容易发荧光；其
共轭度愈大，电子越易被激发,分子的荧光效率
也越大，荧光发射光谱向长波长方向移动。
2.具有刚性平面结构的分子，具有较强的荧光。 这两个物质的荧光效 率分别为1.0和0.2。
这是由于加入了亚甲基使芴的刚性和共平面
性增大的缘故。这种结构可减少分子振动，即减
之则荧光减弱。
了解荧光和物质分子结构的关系，可以帮 助我们考虑如何将非荧光物质转化为荧光物质， 或将荧光强度不大或选择性不高的荧光物质转
化为荧光强度大及选择性高的荧光物质以提高
分析的灵敏度。
四.荧光强度和溶液浓度的关系 按荧光发生机理，可得到溶液的荧光强度
和该溶液吸收光的强度Ia以及荧光物质的荧光
1.激发：
通常在室温下，大部分分子处于基态的最 低振动能级，含有偶数个电子且自旋配对，处 于基态单重态(sinlet state；Pauli原理)；当 其吸收一定频率的电磁辐射(光量子)后电子可 发生能级跃迁至第一激发单重态(S1)，这一过程 称为激发。
2.去活化过程： 处于激发态的分子是不稳定的，可通过几 种不同的途径回到基态，这一过程称为去活化。 去活化过程主要有以下几种：
温度增加，荧光效率下降的主要原因是分
子内部能量发生变化，溶质与溶剂分子之间的 碰撞机会增大，把能量消耗了。 四.溶液pH值的影响 如果荧光物质本身为弱酸或弱碱时，溶液