海 马 神 经 元 培 养
新生大鼠海马神经干细胞的分离培养及分化研究
新生大鼠海马神经干细胞的分离培养及分化研究苗宗宁;吴卫江;钱寒光;赵基栋【摘要】研究新生大鼠海马区脑组织中神经干细胞体外培养方法，为治疗神经系统疾病寻找合适的细胞来源。
取新生SD大鼠的海马区脑组织，采用accutase结合机械分离法获取神经干细胞，在含有B－27、碱性成纤维生长因子和表皮生长因子的DMEM／F12无血清培养液中培养；Accutase酶消化后传代培养，取第3代细胞行抗巢蛋白免疫荧光染色鉴定并以含10％胎牛血清培养液诱导分化，神经元特异烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白免疫荧光染色检测NSCs向神经元及胶质细胞分化的能力。
分离的新生大鼠海马区脑组织中细胞，在无血清培养液中形成大量的神经球，部分神经球出现融合及贴壁分化现象，细胞呈典型NSCs 形态。
经巢蛋白染色鉴定，大部分为阳性细胞。
神经细胞球经含有胎牛血清培养液培养后，可分化为神经元特异烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白表达阳性的细胞。
从新生大鼠海马组织分离培养的NSCs具有自我更新和增殖能力，在含胎牛血清培养液中具有向神经元和神经胶质细胞分化的潜能。
%To establish the method of culture neural stem cells in the hippocampus of neonatal rats in vitro in order to find a suit-able cell source for the treatment of nervous system diseases.NSCs were isolated use accutase and mechanical separation method from hippocampus area of neonatal SD rat.The cells were cultured in completely medium and medium components include DMEM/F12 ser-um-free medium,B27,basic fibroblast growth factor and epidermal growth factor.Anti nestin immunofluorescence staining were used to identify the third generation cell after accutase enzyme digestion andsubculture.Culture medium containing 10%fetal bovine serum were usedto induce NSCs,NF-200 and GFAP immunofluorescence staining were used to identify the differentiation of NSCs to neu-rons and glial cell.In the hippocampus of neonatal rats,a large number of nerve cells were formed in the serum free medium,and some of the neural spheres appeared fused and adherent differentiation.The cells showed typical NSCs morphology.The expressions of nestin staining showed that most cells were positive.Nerve cell spheres could differentiate into neurons and glial fibers acidic protein expression positive cells after cultured with medium containing fetal bovine serum.The NSCs isolated from the hippocampus of neonatal rats has the ability of self-renewal and proliferation,which has the potential to differentiate into neurons and glial cells in the serum containing fetal bovine serum.【期刊名称】《生物医学工程研究》【年(卷),期】2016(035)004【总页数】6页(P303-308)【关键词】海马;神经干细胞;分离培养;细胞分化;新生大鼠【作者】苗宗宁;吴卫江;钱寒光;赵基栋【作者单位】江苏无锡市第三人民医院，江苏无锡214041;江苏无锡市第三人民医院，江苏无锡214041;江苏无锡市第三人民医院，江苏无锡214041;江苏无锡市第三人民医院，江苏无锡214041【正文语种】中文【中图分类】R3181 引言神经干细胞（neural stem cells，NSCs）是一类起源于神经外胚层，具有自我更新能力并在一定条件下分化为神经元和胶质细胞的多潜能干细胞［1-3］。
松果体素抑制大鼠海马神经元甘氨酸激活的全细胞电流
作者简介 ： 程新萍 （９ ３一） 女 ， １７ ， 硕士 ， 师 ， 究方 向： 经生物学 ， 讲 研 神
Ｔ ｌ ５ — ６ ７ ７ Ｅ— ｉ： ｘ ＠ ｕ ｔ ． ｄ ． ｎ； ｅ ：０ ５１ ３ ０ ７ ８， ｍａ ｌ ｃ ｐ ｓｃ ｅ ｕ ｃ
周江 宁（９ ６ ， ， １５ 一） 男 博士 ， 教授 ， 士生导 师， 博 研究方 向：
中国药理 学通报
Ｃ ｉｅ ｈ ｒ ａｏ ｇｃｌ ｕｌｉ ２ １ ａ ；８ １ ｈｎｓ Ｐ ａｍ ｃｌ ｉ ｌｔ ０ ２Ｊｎ２ （ ） ｅ ｏ ａ Ｂ ｅｎ 寸 ＿＿
ｖａｉｔ ｃｌ ｌｒｎ ｏｅｒｌ ｅ ｏ ｉｓ［ ］ ｉ ａ Ｒｓ２ ０ ｉ ｎｒ ｅｕａ ｄ ｌ ｅａ ｄｄｍａ ａ ｌ ｉ — ｔ ｎ Ｊ ．ＪＰｎ ｌ ｅ，０ ４， ｅ
３ （ ：４ ６ ４） ２ ２—９ ．
制 大 鼠海马 神经 元 甘 氨 酸受 体 介 导 的 电流 ， 提 示 这 松果 体 素可 能对 海马 区域 神经 网络 的兴 奋性 产 生影
响。研究松果体素对甘氨酸受体的调控作用为更好 地理解松果体素的药理作用及其进一步的临床应用
提供 了重 要 的理论 依 据 。
Ｄ Ｍ（ ｉ ｏ Ｕ Ａ） 加 胎 牛血 清 （ ｉｃ ， Ｓ 和 ＭＥ Ｇｂ ， Ｓ 外 ｃ Ｇｂ ｏ Ｕ Ａ）
松 果 体 素 （ ｌｔ ｉ， Ｔ， 黑 素 ） 要 是 由脑 ｍｅ ｏ ｎ Ｍ 褪 ａｎ 主
内松 果 体腺 （ ｉｅｌ ｌｎ ） 泌 的一 种 神 经 激 素 ， ｐｎ ａ ｇ ｄ 分 ａ 通 过 与其 特异 性受 体 结合 ， 挥 了 多种 多样 的生 理 学 发 功能 －］如 调节 ２ ４， ４ ｈ生 物节 律 ； 强 免 疫 器 官 的 增
新生大鼠杏仁体基底外侧核的神经解剖及神经元的原代培养
ＨＥ ＬＯＮＧＪＡＮＧ ＥＤＩ ＮＥ Ｉ Ｉ Ｍ ＣＩ ＡＮＤ ＨＡＲＭ ＡＣ Ａｕ ． ０ ８ Ｖｏ． １Ｎｏ ４ Ｐ Ｙ ｇ ２ ０ ． １３ ．
・３・
新生大 鼠杏仁体基底外侧核的神经解剖及神经元 的原代培养
刘欣 秋 ， 爱华 ， 钱 马 南， 吕合作 ， 李 莹， 陆佩 华
—
１ 材 料 与 方 法 １ １ Ｂ Ａ 神 经 元 的 原 代 培 养 ． Ｌ
参 考 Ｂａｎ ｏ ｉ ｄＰ ｏ的 方 法 。 立 Ｂ Ａ 神 经 元 的 原 代 培 养 建 Ｌ 系 统 ［。 新 生 Ｓ 大 鼠 ， 无 菌 的冰 浴 解 剖 液 中 。 速 地 从 ８取 ］ Ｄ 在 迅 颅 骨 取 脑 ， 冠 状 平 面 的 中 部 切 开 鼠 脑 ， 当 于 大 鼠 图 谱 在 相 Ｂｅ ｍａ ． ２ ｍ 平 面 。 露 海 马 ＿ （ １ ． 海 马长 轴 ， ｒｇ 一２ １ ｍ 暴 ９ 图 Ａ）沿 ］ 作 个 浅 切 口 ， 露 海 马 嘴 。 显 微 镊 子 挟 住 海 马 嘴 上 方 的 颞 暴 用 叶 ， 转 颞 叶 ， 露 Ｂ Ａ（ １ ） 依 据 解 剖 位 置 和 外 囊 结 构 ， 翻 暴 Ｌ 图 Ｂ。 在 解 剖 显 微 镜 下 ， 显 微 镊 子 分离 双 侧 Ｂ Ａ。 Ｂ Ａ 放 入 冰 用 Ｌ 将 Ｌ 浴 的 解 剖 液 中 ， 成 两 段 。 分 离 后 的 所 有 Ｂ Ａ 团 块 放 入 剪 将 Ｌ １ｍＬ 的 圆 锥 形 管 中 ， ０ １ ５ ５ 加 ． ２ ％胰 酶 ２ ｍＬ。 置 在 ３ ℃、 ％ 放 ７ ５ Ｃ 养 箱 中 消 化 １ ～ １ ｍｉ ， ２ Ｏ培 ０ ｌ ｎ 用 ｍＬ 含 有 １ 胎 牛 血 清 ０ Ａ ｏ
（ 海 交通 大 学 医 学 院神 经 生物 学 实验 室 ， 海 ２ ０２ ） 上 上 ０ ０５
链脲佐菌素诱导培养皮层神经细胞损伤作用的观察
阿 尔 茨海 默 病 （ ｚ ｅ ｒ ｓｄ ｓａ ｅ ＡＤ 是 一 种 常 见 的 以 Ａｌ ｉ ’ ｉ ｓ ， ） ｈ ｍｅ ｅ 进行 性 记 忆 减 退 、 知 障 碍 为 主 要 临 床 表 现 的 中 枢 神 经 系 统 退 认 行性 疾病 。研 究 证 实 ， 代 谢 紊 乱 （ 尿 病 ） ＡＤ 发 病 机 制 有 糖 糖 和 密切 的联 系 。ＡＤ也 常伴 有 脑 内糖 代 谢 障 碍 。 因 而 有 专 家 一
新 近 研 究 结 果 表 明 ， 岛 素 是 中 枢 神 经 系 统 内重 要 的 神 经 胰 元 存 活 和 代 谢 的 调 节 冈 子 ， 有 神 经 营 养作 用 。研 究 显 示 ， 具 中
枢 的 胰 岛 素一 方 面来 自外 周 ， 一 方 面来 自神 经 元 自身 合 成 口 ， 另 一 这 些 胰 岛 素参 与 神 经 细 胞 的信 号 转 导 ， 挥 神 经 细 胞 的 代 谢 和 发
提出 Ａ 可能是一种 大脑特 异 的神经 内分 泌疾病 或者 称“ Ｄ ３型
糖 尿 病 ”７ 。 ＿ 链 脲 佐 菌 素 （ Ｔ ） 一 种 烷 基 化 物 ， 腔 内 注 射 可 通 过 破 Ｓ Ｚ是 腹
洗 涤 ３次 后 ， 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 （ ｙ ｕ ， Ｖ 一１０ ） 观 察 在 Ｏｌｍｐ ｓ Ｆ ００ 下
中西医结合心脑血管病杂志 ２ ｌ Ｏ Ｏ年 ６月 第 ８卷 第 ６期
・７ ９ １ ・
ห้องสมุดไป่ตู้
链 脲 佐 菌 素 诱 导培 养 皮层 神 经 细 胞损 伤作 用 的观 察
马 国英 ， 小 荣 ， 杨 赵 欣， 秦华 平 ， 史瑞 红 ， 王 晔， 张 策
摘要 ： 目的 研 究链 脲 佐 菌 素 （ Ｔ ） 原 代 培 养 大鼠 皮 层 神 经 元 是 否具 有损 伤 作 用 。 方 法 常 规 原 代 神 经 细 胞 培 养 的 方 法 ， Ｓ Ｚ对 培 养 新 生 １ｄ ３ｄ的 Ｗ ｉ ａ 大 鼠皮 层 神 经元 ， 过 检 测 Ｃ Ｋ一８ 乳 酸 脱 氢 酶 （ ＤＨ） 放 检 测 和 ｃ ｌ ｉ ～ ｓ ｒ ｔ 通 Ｃ ， Ｌ 释 ａｅ ｃ ｎ—ＡＭ 染 色 ， 察 加 入 不 同 浓 观
靶向SynDIG1的shRNA慢病毒载体的构建及功能鉴定
动物医学进展,2021 ,2(1)69-74ProgressinVeterinary Medicine靶向SynDIG1的shRNA 慢病毒载体的构建及功能鉴定李亚琳，史秀超，权美平(渭南师范学院环境与生命科学学院,陕西渭南714099)摘 要：为了构建靶向突触分化诱导基因1(SynDIG1 )的shRNA 慢病毒表达载体，设计出SynDIG1的 siRNA 的靶点序列,并合成含干扰序列的双链DNA 发卡结构shRNA,合成的Oligo 经过退火分别与双酶切处理后的pLKO. 1-GFP 载体连接。
将构建的重组质粒pLKO. 1-GFP-SynDIG1 shRNA 转化到DH5a 感受态细菌中，过夜培养后挑选阳性克隆子，扩增后提取DNA 进行质粒测序，得到两个序列正确的重组质粒。
用这些重组质粒转染HEK293T 细胞以及大鼠海马神经元细胞，蛋白免疫印迹及细胞免疫荧光检测SynDIG1 shRNA 对外 源性和内源性SynDIG1表达的敲减作用。
进一步用重组质粒转染HEK293T 细胞产生慢病毒颗粒，用病毒颗粒 感染DIV2和DIV14的神经细胞,免疫印迹检测SynDIG1的表达。
结果表明这两个重组质粒均能够有效地抑制外源性和内源性SynDIG1的表达，对HEK293T 中瞬时表达的SynDIG1敲减率达到75%，其慢病毒颗粒感染对早期神经细胞中内源性SynDIG1的表达抑制也很明显。
用pLKO. 1-GFP 成功构建了能够有效抑制外源性 和内源性SynDIG1表达的重组质粒，为探讨RNA 干扰技术抑制神经细胞SynDIG1基因表达的相关研究奠定基础，为研究SynDIG1基因在神经传导和突触发育及其可塑性调节中的作用提供了有力工具。
关键词：SynDIG1 ；慢病毒；shRNA ；基因敲减技术中图分类号:S852. 615；Q789突触分化诱导基因(synapse differentiation in duced gene1,SynDIG1)是一种高度保守的跨膜蛋 白，在中枢神经系统的兴奋性突触传递和突触可塑性调节中起着重要的作用［1］。
不同日龄大鼠颈上交感神经节神经元电转染方法
研 究 报 告
石 、 Ｉ
不 同 日龄 大 鼠颈 上 交 感 神 经 节 神 经元 电转 染 方 法
刘 丽 ， 志 英 ， 海林 赵 张
（ 北 医科 大 学药 理学 教研 室 ， 家 庄 河 石 ００ １） ５０ ７
【 要 】 目 的 建 立 一 种 高 效 电 转 染 不 同 日龄 大 鼠 颈 上 交 感 神 经 节 （ｕｅｉ ｅ ｉ ｌ ｙ ｐｔｅ ｃｇｎｌ ｎ 摘 ｓｐｒ ｒｃｒ ｃ ｍ ａ ｔ ａｇ ｏ ， ｏ ｖａｓ ｈｉ ｉ
养 液 转 染后 的成 活 率 （ ００ ）且 结 果 稳定 ， Ｐ＜ ． １ ， 细胞 状 态 良好 ， 够 满 足 后 续 实 验 研 究 的 要 求 ； 化 转 染 条 件 后 ， Ｎ 能 优 Ｄ Ａ 的转 染 率及 ｓ Ｎ ｉ Ａ的 干扰 率 显 著 提 高 ， Ｄ Ａ 与转 染 液 比例 为 １１０ Ｉ ： Ｌ 时 ， 胞 转染 率 最 高 ； ｓ Ｎ 与 转染 Ｒ 当 Ｎ ：０ （ ｇ ｘ ） 细 当 ｉ Ａ Ｒ 液 比例 为 １５ （ ： ） 干扰 率 最 高 。结 论 ：０ ｇ Ｌ 时 通过 改 良神 经元 培 养 液 及优 化 转 染 条 件 ， 功 提 高 了 电 转染 后 细 胞 的 成
２１ ０ １年 １ ０月
中 国 实验 动物 学 报
ＡＣ ＡＢＯＲＡＴ ＴＡ Ｌ ＯＲ Ｉ ＵＭ ＡＮＩ ＡＬ Ｓ Ｓ Ｉ ＮＴＩ Ｉ ＣＡ Ｍ Ｉ Ｃ Ｅ Ａ Ｓ ＮＩ
海马的养殖
第一节海马养殖技术一、海马简介海马俗称“水马〞属于鱼纲、海龙目、海龙科海马属。
成效：补肾壮阳、强心益脾、止咳平喘、消炎止痛、生肌明目等。
应用：干品入药、药膳、泡酒。
海马市场与行情：我国海马需求：90年代：5000kg。
2007年：7500-8000kg价格：2003年：800-1000元/kg 2004年：1300-1400元/kg 2006年：2000-2200元/kg 2007年：3000-3200元/kg 2008年：3200-3600元/kg药店：大海马：7200元/kg原因：一直以来，海马来自野生，靠渔业偶获。
二、海马的种类、分布与用途全世界海马有30种，我国分布有6种。
中心分布区：北纬30度～南纬30度。
1、斑海马〔Hippocamps trimaeutatus 〕2、大海马〔Hippocamps kuda 〕3、日本海马〔Hippocamps japonicus 〕4、刺海马〔Hippocamps histrix 〕5、克氏海马〔Hippocamps kelloggi 〕8、冠海马〔Hippocamps coronatus 〕三、海马的品种及鉴定克氏海马体长30～33厘米。
为海马中最大的一种。
头冠短小，尖端有5个短小的棘。
吻长，呈管状。
眼较大，侧位而高。
骨质环：体部11，尾部39～40；体上各环棱棘短钝呈瘤状。
背鳍线：18～19，较兴旺，位于躯干最后2体环及尾部最前2体环的背方臀鳍线：4，短小胸鳍18，短宽，略呈扇形，无腹鳍及尾鳍。
尾端卷曲，全体淡黄色，体侧具白色线状斑点。
分布：沿海一带；、沿海亦有。
大海马体长20～24厘米。
头冠较低，顶端具5个短钝粗棘。
吻长恰等于眶后头长。
骨质环体部11，尾部35～36；头部及体环与尾环上的小棘均不甚明显。
背鳍17，臀鳍4，胸鳍16。
体呈黑褐色，头部及体侧有细小暗黑色斑点，有弥散细小的银白色斑点，背鳍有黑色纵列斑纹，臀、胸鳍淡色。
分布：沿海及岛。
新生大鼠海马神经元的原代培养方法
维普资讯
３ Ｏ பைடு நூலகம்９
第３ ６卷 第 ５期 ２０ ０２年 １ ０月
哈尔滨医科大学学报
Ｊ ＯＵＲＮＡＬＯＦＨＡＲ Ｎ 艇 ＤＩ ＢＩ ＣＡＬ ＵＮ ＶＥＲ １ Ｉ ＳＴＹ
Ｖｏ ． ６． １ ３ Ｎｏ． ５ Ｏｃ ． ｔ．
新 生 大 鼠海 马神 经 元 的原 代 培 养 方 法
用膜 片钳全细胞记 录方法观察培养 好的神经元 电生理学 特性 。结果 培养 的神经元胞体清 晰 ， 晕光 明显 ， 达了多 表 种 电／ － ￣ｆ 控和化学 门控离子通道 。 结论 Ｊ 本实验方 法简单 、 可靠 ， 保持 了神经元结 构和功能特性 。
［ 关键词 】 海 马 ； 原代培养方 法 ； 子通道 离 ［ 中图分 类号】 ４１ Ｑ２ ［ 文献标识码 】 Ａ ［ 文章编 号】１ ０ １０（ ０ ） — ３０ ０ ０ — ９５２ ２０ ０９ — ２ ０ ０ ５
ｕ ｅ ａ ｕｎ ｔ ｈ ｒ ｃｅ ｓ ｔ ｒ ｄ ｆ ｃ． ｎ ｃ ａ ａ ｔｒ ． ｎ ｉ ｏ Ｋｅ ｒ ：ｈ ｐ ｏ ａ ｕ ， ｒｍａ ｙ ｃ ｌ ｒ ｔ ｄ，ｏ ｈ ｎ ｌ ｙ ｗｏ ｄｓ ｉ ｐ ｅ ｍｐ ｓ ｐ ｉ ｒ ｕ ｔ ｅ ｍｅｈｏ ｉｎ ｃ ａ ｎｅ ｕ 、
ｔ ｒ ．Ｒｅ ｕ ｔ Ｃ ｌ ｖ ｔｄ ｎ ｕ ｏ ｓ ｗ ｒ ｌａ ｄ ｅ ｐ ｅ ｓ ｄ ｄ ｆ ｒｎ ｏｔｇ － ａｅ ｄ ｃ ｅ ｃ ｌ ｇ ｔｄ ｉｎ ｕｅ ｓｌ ｓ ｕ ｔ ａｅ ｅ ＿ ｎ ｅ ｃｅ ｒ ａ ｘ ｒｓｅ ｉ ｅ ｔ ｖ ｌ ｅ ｇ ｔｄ ａ ｈ ｍｉａ ａｅ ｏ ｉ ｒ ｅ ｎ ｅ ａ ｎ ｃ ａ ｎ ｌ ． ｎ ｌ ｓｏ Ｔ ｅ ｍｅ ｈ ｄ ｗｅ ｉｔ ｄ ｃ ｅ ｅ ｉ ｓ ｌ ｄ ｔ ｓ ｂ ｅ Ｎ ｕ ｏ ｓｋ ｐ ｈ ｏ ｄ ｓ ｕ — ｈ ｎ ｅｓ Ｃｏ ｃｕ ｉｎ ｈ ｔｏ ｒ ｕ ｅ ｈ ｒ ｓ ｉ ｅ ａ ｕ ｔ ｌ ． ｅ ｒ ｎ ｅ ｔｔｅ ｎ ｍｕ ｔ ｃ ｎ ｏ ｍｐ ｎ ｒ ａ ｒ
神经细胞培养方法及进展
成污染 ， 因此不便长期 培养。对此 Ｍ ｘ ｏ ａｉ ｗ在 １２ ｍ ９５ 年将单盖片法改为双盖片法 ： 将种植有植块 的基质盖 片先粘贴另一较大载体盖玻片上 ， 再将载体盖片密封 在 凹陷载 片上 Ｊ 。然 而 ， 论是 单 盖 片 法还 是 双 盖 片 不 法， 都有不足之处 ： 培养空间小， Ｃ ０ 和 Ｏ 供应少 ， Ｃ： ０ Ｏ 和 比例变化幅度大， 培养液中水分容易蒸发 ，
【 关键词】 神经细胞 ； 培养； 培养基
Ｔｈｅ ｍ ｅｈｏ ａ ｒ ｇ ｅ ｓｏ ｔ ｄ ｎｄ ｐ ｏ ｒ ｓ ｆｎｅ ｖ ｅｌｃ ｔ ｅ ｒ ｅ ｃ ｌ ｕｌｕｒ ＤＵＡＮ ｏ ｇ— ａｎ Ｙ ｎ Ｇ ｇ ， ，Ｌ ａ Ｉ Ｔ ｏ，ＷＡＮＧ ｏ ｇ Ｙｎ
１ 神经 组 织的植 块培 养
牢固后 ， 加一滴培养液并翻转基质盖片， 使植块及培养 液悬挂在生长基质表面 ， 再将基质盖片盖于凹载片上 ， 熔 蜡密封 后培 养 。该 法成 功 的关 键是植 块牢 固地粘 附 到生长基质表面， 其优点是可以直接使用油浸物镜活
体观察 ， 其缺点是更换培养液时容易损坏基质盖片 ， 造
【 ｅ ｏｄ 】 Ｎ ｕ ｌ ｅ ；ｕｕｅＣ ｌ ｒ ｍ ｄ ｍ Ｋ ｙｗ ｒｓ ｅｒ ｌ Ｃ ｌ ｒ；ｕ ｕｅ ｅｉ ａｃ ｌ ｔ ｔ ｕ
神经细胞是近代神经学科中研究重点之一 ， 神经 细胞体外培养是指在体外模拟建立体内生长条件， 使 神经细胞或神经胶质细胞在其生存和生长并维持其形 态和功能的方法。神经细胞体外培养技术已成为当今 神经科学研究 中的主要方法之一 ， 与各种先进 的技术 结合在一起渗透到各个学科 ， 因神经细胞对体外培 但 养条件要求条件较高难度大而又制约它的发展。
大鼠海马神经元的培养及细胞培养注意事项
1.成年大鼠海马神经元的培养●步骤1.获得海马细胞◆大鼠乙醚麻醉，断头处理；◆迅速解剖海马组织，置于含有2ml 4℃的HibernateA/B27的35mm的培养皿中；◆随后将其移入含有同上培养基的培养皿，去除脑膜及多余的脑白质（？）；◆将海马移入组织切碎机冷处理台面上事先用HibernateA/B27润湿的滤纸上，沿海马长轴将组织切成0.5mm的薄片，随后将其移入含有5ml4℃的HibernateA/B27的离心管中；◆30℃震荡8min。
◆大吸管将其移入含有木瓜蛋白酶（预热至30℃）的离心管，置于170rpm的旋转平台（保持组织片悬浮状态），30℃水域温育30min；◆将海马组织切片移入15ml含有2mlHibernateA/B27的离心管中，30℃温育5min，吸管吹打10次（30s），静置2min，将上清移入另一离心管，重复上述步骤2次；2.梯度分离◆将细胞悬液加入Nycoprep gradient（4ml）的上方，室温，1900rpm，离心15min；去除最上方的碎片；吸管收集含有细胞的部分；用5mlHibernateA 稀释；第三层富含神经元；将第四层用2 ml B27:NeurobasalA重悬，1100rpm离心1min；3.盖玻片处理：50ug/mL多聚-D-赖氨酸（无菌水溶解）包被过夜，吸去多余的多聚赖氨酸，无菌水漂洗一次，自然干燥1h；4.◆细胞接种：以目标密度稀释于B27:NeurobasalA，以每盖玻片60到120 Ul接种，置于5% CO2:9% O2中孵育1h；◆将盖玻片移入24孔培养板中,每孔以0.4ml 37℃ B27/NeurobasalA漂洗一次，去除未贴壁细胞及细胞碎片；改用0.4ml的生长培养基；◆培养后4天，每3-4天更换一半培养基；新的培养基中的FGF2含量是远培养基的2倍；1.培养器皿的准备：1）溶液瓶——装配各种溶液——输液瓶；2）螺口瓶——血清或培养基；3）培养瓶——细胞培养——一般采用带螺口的，清洗时注意防止盖子中垫片的丢失；4）培养皿——细胞组织的分离、培养、染色——包括直径为30mm、60mm、120mm5）血球细胞计数板——细胞计数6）移液管——连接上手动（吸耳球）或电动负压吸取装置——在移液管尾部塞入少量脱脂棉；7）离心管——分离、漂洗、收集细胞——一般选用螺口带盖的；Eppendorf——塑料尖底带盖的离心管8）磁力搅拌器：用于神经细胞的分离机溶液的配置；最好配合使用可调温度的加热装置；可用高压蒸汽消毒。
木瓜蛋白酶联合DNA酶法提取乳鼠原代皮层神经元及鉴定=廖益东，明江，张宇，廖一飞，徐卡娅
实验研究木瓜蛋白酶联合DNA酶法提取乳鼠原代皮层神经元及鉴定廖益东1，明江1，张宇2，廖一飞2，徐卡娅1，2△摘要：目的采用木瓜蛋白酶联合DNA酶法提取24h内新生SD大鼠皮层神经元，改进体外原代培养方法。
方法取24h内新生SD大鼠，剥离脑血管膜分离出大脑皮层，采用木瓜蛋白酶和DNA酶顺序消化、纯化后，以含10%胎牛血清的DMEM-F12培养基为神经元接种液，4h后更换为预热的含有B27的Neurobasal-A神经元培养液，连续培养7d。
分别以1×105、5×105、1×106细胞/mL接种于L-多聚赖氨酸浸泡后的6孔板内，并在显微镜下观察细胞的生长状态。
取培养7d后的神经元，采用β-Tubulin免疫荧光法和神经元特异性核蛋白（Neun）抗体免疫组化法鉴定神经元，神经元微管相关蛋白2抗体（MAP2）免疫荧光法鉴定神经元纯度。
结果神经元以密度为5×105细胞/mL接种最为合适，接种24h后，皮层神经元部分贴壁；接种3d后，贴壁细胞逐渐增多，神经元突触进一步生长并延长，交联成稀疏网络；接种7d后，神经元仍大量生长，胞体丰满，并形成更为紧密的神经元网络系统。
经β-Tubulin免疫荧光法和Neun抗体免疫组化法鉴定，提取培养细胞为神经元，并经神经元标志物MAP2免疫荧光法鉴定神经元纯度为（91.06±1.51）%。
结论采用24h内新生SD大鼠分离大脑皮层，经木瓜酶与DNA酶顺序消化，可提取到优质皮层神经元。
关键词：神经元；原代细胞培养；木瓜蛋白酶；脱氧核糖核酸酶类；大鼠，Sprague-Dawley；新生SD大鼠；细胞模型中图分类号：R329-33文献标志码：A DOI：10.11958/20212562Extraction and identification of primary cortical neurons of suckling rats bypapain and DNA enzymeLIAO Yidong1,MING Jiang1,ZHANG Yu2,LIAO Yifei2,XU Kaya1,2△1Guizhou Medical University,Guiyang550004,China;2Affiliated Hospital of Guizhou Medical University△Corresponding Author E-mail:**************Abstract:Objective To extract cortical neurons of newborn SD rats within24h by papain combined with DNA enzyme,and to improve the primary culture method in vitro.Methods The cerebral cortex of newborn SD rats was separated from the cerebral vascular membrane within24h.After sequentially digested and purified by papain and DNA enzyme,the neurons were inoculated with DMEM-F12medium containing10%fetal bovine serum.After4hours,it was replaced with pre-warmed Neurobasal-A neuronal medium containing B27,and cultured continuously for7days.1×105,5×105and1×106cells/mL were seeded into6-well plates soaked in L-polylysine,respectively and the growth state of the cells was observed under a microscope.The neurons cultured for7days were identified by immunofluorescence method ofβ-Tubulin and immunohistochemical method of neuron specific nuclear protein(Neun)antibody.The purity of neurons was identified by immunofluorescence method of neuron microtubule-associated protein2antibody(MAP2).Results The most suitable inoculation method was5×105cells/mL/well.The cortical neurons partially adhered to the wall after24-h inoculation.Three days after inoculation,adherent cells gradually increased,synapses further grew and extended,and cross-linked into sparse networks.Seven days after inoculation,the neurons still grew in large numbers,the cell body was plump, and a tighter neural network system was formed.The cells were identified by immunofluorescence method ofβ-Tubulin and immunohistochemical method of Neun antibody,and the neuron purity was(91.06±1.51)%by immunofluorescence method of neuron marker MAP2.Conclusion Newborn SD rats within24hours are used to separate the cerebral cortex,and after digestion with papain and DNA enzyme,high-quality cortical neurons can be extracted.Key words:neurons;primary cell culture;papain;deoxyribonucleases;rats,Sprague-Dawley;neonatal SD rats;cell model基金项目：国家自然科学基金资助项目（81901173，82060231）；贵州省普通高等学校青年科技人才成长项目（黔教合KY字［2021］190）作者单位：1贵州医科大学（邮编550004）；2贵州医科大学附属医院作者简介：廖益东（1992），男，硕士在读，主要从事干细胞移植治疗脑血管疾病研究。
原代海马神经细胞体外培养的纯化与鉴定
第４ ４卷
３２ ２
第 ４期
哈尔滨医科 大学学报
Ｊ ０ＵＲＮＡＬ ＯＦ ＨＡＲＢ Ｎ ＭＥＤ ＣＡＬ ＵＮＩ Ｉ Ｉ ＶＥＲＳ ＩＹ Ｉ
Ｖｏ ． ４， ． １ ４ Ｎｏ ４ Ａｕ ．，２ １ ｇ ００
２１ ０ ０年 ８月
原代 海 马 神 经 细胞 体 外 培养 的纯 化 与鉴定
在体外采用含血清结合无血清法进行培养 ， 并用 Ｎ Ｅ Ｇ Ｐ４ 、 Ｐ Ｓ 、 Ａ －３ ＭＡ ２等海马神经 细胞 特异抗体经 免疫细胞化学 方
法鉴定细胞性质及纯度。结果 度达 ９ ％以上。结论 ６ 至第 ７ ・ ８天神经元形态最为成熟饱满 ， 随后逐渐 出现 细胞 老化 ， 神经元 最长可 生存 ４周 。经鉴 定 ， 马神经元 纯 海 体外采用含血清和无血清法相结合进行原代 海马神经细胞 培养 ， 细胞纯度高 ， 杂细胞少 ， 可 为神经疾病体外研究提供 必要 细胞基础 。
ｍａ ｕｔｒ ｆ ｉｐ ｃ ｍｐ ｌ ｅ ｒｎ ｉ ｅｕ ｍｅ ｉｍ ｎ ｅｕ ｆｅ ｄｕ ｉ ｉ ｏｉ ｗ ｔ ｉｈ ｐ — ｙ ｒ ｃ ｌ ｅｏ ｐ ｏ ａ ａ ｕｏ ｓｗ ｔ ｓ ｒｍ ｄｕ ａ ｄ ｓｒ ｍ— ｅｍｅ ｉｍ ｎｖｔ ｓ ｉ ｈｇ ｕ ｕ ｈ ｎ ｈ ｒ ｒ ｈ
Ｌ Ｕ ｎ，ＺＨＡＮＧ — ａ，ＺＨＡＮＧ ｎ— Ｉ Ｘｉ Ｙｉｎ Ｙｕ ｈｅ，ｅ ｌ ｔａ
（ ｅａｔｅ ｔｆＧｒ ｔｃ，Ｔ ｅ ｅｏ ｄＣｉｉ ｌ ｏｌ ｅ Ｈ ｒｉ Ｄｐ ｒ ｎ ｏ ｅｉ ｒｓ ｈ ｃｎ ｌ ｃ ｌｇ ， ａｂ ｍ ａｉ Ｓ ｎａ Ｃ ｅ ｎ
原代海马神经元细胞培养
原代海马神经元细胞培养-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1原代海马神经元细胞培养溶液的配制：(1) 4%多聚甲醛溶液：4g多聚甲醛溶于100ml pH=7.4的0.01mol/l PBS中，混匀过滤，室温保存。
(2)磷酸盐缓冲液（PBS）（0.01mol l-1）：KH2PO4，0.1g；Na2HPO412H2O，1.7g；KCl，0.1g；NaCl，4.0g，双蒸水加至500ml，pH=7.2～7.4。
用0.2m滤膜过滤，4℃保存。
(3) 1%蛋白酶的配制：用磷酸缓冲液（pH=7.2～7.4）配制成浓度为1%的胰蛋白酶母液冻存。
使用时，用解剖液稀释至0.25%。
(4) 培养皿涂被多聚赖氨酸：配制0.01%的多聚赖氨酸，分装冻存。
将上述多聚赖氨酸放入培养皿中涂两遍，自然晾干后备用。
(5) 解剖液：葡萄糖，3.0g；蔗糖，7.5g；NaCl，8.0g；KCl，0.4g；Na2HP047H20，0.18g；KH2PO4，0.03g；HEPES，2.14g；加双蒸水1000ml，调pH=7.0～7.4，过滤，4℃保存。
(6) 种植液：DMEM 79%，胎牛血清，10%；马血清，10%；谷氨酰胺培养液1%。
(7) 饲养液：Neurobasal培养基，97%；谷氨酰胺培养液，1%；B-27，2%。
(8) 阿糖胞苷：用双蒸水配制成浓度为l mg ml-1的母液储存。
用0.2m 滤膜过滤，-20℃储存。
使用时，取6l母液加入2ml培养液中，终浓度为3g ml-1。
（根据实验情况调整浓度）大鼠原代海马神经元细胞的培养(1) 新生SD大鼠（＜12h），75%酒精浸泡消毒后断头，剥离出全脑并将其放入盛有解剖液的培养皿中。
(2) 在解剖液中解剖大脑，分离出海马，移入另一盛有解剖液的培养皿中。
在分离出全部的海马后，去除血管等组织，然后用剪刀将海马分成数小块，放入盛有0.25%胰蛋白酶的培养皿中，将培养皿放入9%CO2、37℃消化20min。
世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版讲解
世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版[精华]序言：国内外关于原代培养有很多文献，不幸的是，没有一篇是详细的，没有一篇解答过why. 为了让大家少走弯路，根据我杀过3000只老鼠的经验，我把我这几年摸索的经验和大家分享，请求多投几票得几个叮当。
相信你follow我的这篇文章一定会做的很好。
我的标题说的很像吹牛，但是我是严肃认真的说的，I earn it.note:这篇文章全是我个人的经验，99。
9%原创，经过无数失败的到的最完美的原代神经元培养法，除了最后那一副图是来自下面第2行那篇文献，所以我才说是99.9%原创。
（注：附录的图是常用的消化酶对实验的存活率影响，来自下面链接里的文献）另外，成年鼠的原代培养我没有摸索过，推荐一篇文献在我以前的帖子（无需叮当）（/bbs/post/view?bid=156&id=17651341&sty=3）本篇专门讨论胎鼠和新生鼠神经元的原代培养。
1.材料选择。
一定要严格按照国际上，NCBI数据库，其他文献的材料一致。
胎鼠就要胎鼠，新生鼠就要新生鼠，不能混淆。
因为新生鼠有一些受体，在培养的工作中失去功能，会不能再生，比如NMDA受体。
和文献不同会导致错误结论，甚至困惑。
很多人写信问我新生鼠的培养问题，我回答用新生鼠的实验很少，八成是你自己搞错了实验对象，请确认国际上的相关研究文献所用老鼠，再来问我下面的问题。
2，培养基选择（neurbasal/neurobasal-a,invitrogen Co.ltd)。
我强烈不建议用血清培养。
原因是：首先，血清刺激胶质细胞和杂细胞分裂，最后非常影响神经元产量；其次，为了抑制胶质生长，往往要加入阿糖孢苷。
严重的毒性会影响许多灵敏实验；再次，最重要的，血清培养的细胞状态很不均一，从正常到凋亡都有，严重影响试验准确，而无血清专用培养基所有的正常细胞都处于一样的状态，要么都好，要么都差，高度一致。
Invitrogen/GIBCO 无血清培养基neurobasal(neurbasal-A)被认为是最标准，最好的培养基。
灵芝孢子粉对无镁活化海马神经元NGF的影响
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
细 胞 ： 马 神 经 元 取 源 于 ２ 海 ４ ｈ以 内 的 新 生 Ｗ ｉ ａ 大 鼠 ， ｓ ｒ ｔ 购 自于 佳 木斯 大学 动物 实 验 中心 。 Ｉ Ａ 细 胞 裂 解 液 ： 汉 博 ＲＰ 武 士 德 公 司 。 白 酶 抑 制 剂 Ｐ Ｆ：碧 云 天 生 物 技 术 公 司 。 蛋 ＭＳ ＡＰ 标 记 的 山 羊 抗 兔 ＩＧ 抗 体 ： 京 中 杉 金 桥 生 物 技 术 有 限 公 ｇ 北 司 。 抗 大 鼠 ｐ ｃｉ 体 ： 京 博 奥 森 生 物 技 术 有 限公 司 。 兔 —ａｔ ｎ抗 北 Ｂ Ｉ ／ Ｔ碱 性 磷 酸 酯 酶 显 色试 剂 盒 ： 云 天 生 物 技 术 。 Ｃ Ｐ ＮＢ 碧 兔 抗 大 鼠 ＮＧＦ多克 隆 抗 体 ： 汉 博 士 德 公 司 。 武
１ ２ 实 验 方 法 ．
（ ） 膜 用 ＴＢ １将 Ｓ从 下 向 上 浸 湿 后 ， 至 含 有 封 闭 液 的平 移 皿 中 ． 温 下 脱 色 摇 床 上 摇 动 封 闭 ｌ 。 ２ 将 一 抗 用 Ｔ Ｓ 稀 室 ｈ （） ＢＴ 释 至适 当浓 度 （ １ ５ 在 ． ｍＬ离 心 管 中 ） 室 温 下 孵 育 １ ２ ； ～ ｈ后 ， 用 Ｔ Ｓ Ｂ Ｔ在 室 温 下 脱 色摇 床 上 洗 １ ｒｉ ×２ 再 用 ＴＢ ０ ｎ ａ ， Ｓ洗 一 次 ，０ ｎ （ ） 上 方 法 准 备 二 抗 稀 释液 并与 膜 接 触 ， 温 下 １ ｍｉ。 ３ 同 室 孵育１ ２ ～ ｈ后 ， ＴＢ Ｔ 在 室 温 下 脱 色摇 床 上 洗 １ｍｉ 用 Ｓ ０ ｎ×２ ； 再 用 ＴＢ Ｓ洗 １ ｍｉ 。 ０ ｎ
１２ ４ ．． 显 色
Ｗｓｅｎ ｌ 观 察 Ｂ ＮＦ和 Ｎ ｔｒ —ｂｏ ｔ Ｄ ＧＦ 的表 达海 马 神 经 元 用 含 ５ 的 特 级 胎 牛 血 清 和 ２ 的 Ｂ ２ 的 Ｎｅ ｒ ｂ ｓ ｌ 养 液 ％ 一 ７ ｕｏ ａ ａ 培 培 养 于 ３ ５ Ｃ 胞 培 养 箱 内 培 养 。 ２ 孔 板 内 培 养 至 ７ Ｃ、 ０ 细 在 ４ 第 ９ 时 ， 机 选 取 培 养 的 细 胞 进 行 分 组 ： 常 对 照 组 ： 维 天 随 正 将 持 培 养 液 全 液 换 成 正 常 细 胞 外 液 处 理 ３ ． 片 ； 型 组 ： 维 ｈ爬 模 将 持 培 养 液 全 液 换 成 无 镁 细 胞 外 液 处 理 ３ ， 且 在 ０ ｉ， ｈ 并 ａ ｒ ｎ ３ ｍｉ ， ｈ ６ １ ｈ等 ５ 时 间 点 上 爬 片 ； 芝 孢 子 粉 组 ： 维 ０ ｎ ２ ，ｈ， ２ 个 灵 将 持 培 养 液 全 液 换 成 无 镁 细胞 外 液 的 同 时 ， 入 ０ １５ ／ 加 ． ２ｇ ｍＬ 的 灵 芝 孢 子 粉 处 理 ３ ， 样 在 ０ ｎ ３ｍｉ， ｈ ６ ，２ ｈ同 ｍｉ，０ ｎ ２ ，ｈ １ｈ等 五 个
丝素纤维与海马神经元的生物相容性细胞培养研究
（ 南通 大 学 江 苏 省神 经再 生重 点 实验 室 ， 南通 ２ ６ ０ ） ２ ０ １ 摘 要 目的 ： 究 丝 素 与 体 外 培 养 的 大 鼠 海 马 神经 元 的 生 物 相 容 性 ： 方 法 ： 用 制 备 丝 素 与 Ｓ 大 鼠胎 鼠 海 研 采 Ｄ 马 神 经元 共培 养 ７天 ， 天倒 置 显微 镜 观 察 ， 每 免疫 细 胞 化 学 染 色 激 光 共聚 焦 显 微 镜 观 察 、 析 ＝结 果 ： 过 光 镜 观 分 通
Ｔ Ｎ ｉ， Ａ Ｇ Ｙ ｍｉ， Ｉ Ｇ ＦｉＧ ｉ ｓｎＵａｇｕＫ ｙＬ ｂｒｔｒ ｏ ｅｒｒｇｎｒｔｎ Ｎ ｎｏ ｇＵ ｉ ｒ ｔ Ｊ ｎｓ ２ ０ １ Ａ ＧＸ ｎ Ｙ Ｎ ｕ ｎ Ｄ Ｎ ｅ， Ｕ ｘａ ｏｇ ｉ ｓ ｅ ａｏａｏ ｆ ｕｏｅｅ ｅ ｉ ， ａ ｔ ｎｖ ｓｙ ｉ ｇｕ２ ６０ ） ｏ ｎ ｙ ｎ ａｏ ｎ ｅ ｉ， ａ Ａ ｓｒｃ Ｏｂｅｔ ｅ Ｔ ｘｌｒ ｔｅｂ ｃｍｐｔ ｉｔ ｏ ｌ ｆ ｒ ｎｗｔ Ｃ— ｕｔｒ ｈｐ ｏａ ａ ｎ ｕｏｓ Ｍｅｈ ｄ ： ｉ ｏ ｉ Ｏ ｃｌ ｅ ｉｐｃｍｐｌ ｅｒｎ． ｔｏ ｓ Ｓｌ ｆ ｒｉ ｖ ｏ ｂ ｉ ｓｋ ｂ ｉ ｈ ｕ ｋｉ
ｗｅ ｅ ｐ ｅ ａ ｅ ｅｏ ｅ ｃ － ｕ ｔｒ ｔ ｉ ｐ ｃ ｍｐ ｌｎ ｕ ｏ ｓ ｔ ｅ ｉｈ ｎ ａ ｅ ｏ ｆｃ ｌｍｉ ｒ ｓ ｏ ｙ ｗｅ ｅ ｃ ｎ ｕ ｔｄ ｗ ｔ ｈ ｔ ｏ ｒ ｒ ｐ ｒ ｄ ｂ ｆｒ ｏ ｃ ｌ ｅ ｗｉ ｈｐ ｏ ａ ａ ｅ ｒ ｎ ， ｈ ｎ ｌ ｔａ ｄ ｌｓ ｒ ｃ ｎ ｏ ａ ｃ ｏ ｃ ｐ ｒ ｏ ｄ ｃｅ ｉ ｔ ｅ ｍｅ ｈ ｄ ｕ ｈ ｇ ｈ ｏ ｍｍｕ ｏ ｙｏ ｈ ｍｉ ｒ ． ｓ ｌ ：Ｔ ｅ ｃ ｌ ｌｓ ｅ ｒ ｕ ｄ ｓ ｋ ｆ ｒ ｉ ｆｅ ｄ ｃ － ｕｔ ｒ ｎ ｈ ｅｌ ａ ｐ ｄ ｕ ｈ ｉ ｂ ｏｎ ｆｉ ｎ ｃ ｔ ｃ ｅ ｓ ｙ Ｒｅ ｕ ｔ ｔ ｓ ｈ ｅ ｌ ｃａ ｐ ｄ ａ ｏ ｎ ｉ ｉ ｏ ｎ ａｔ ｒ３ ， ｏ ｃ ｌ ｅ ａ ｄ ｔ ｅ ｃ ｌ ｗｒ ｐ ｅ ｐ ｔｅ ｓ ｋ ｆ ｒ ｉ ｓ ｌ ｂ ｕ ｓ ｌ ｉ ｉ ａ ｎｓ ｆ ｄ Ｃ — ｕ ｔ ｅ Ｔ ｅ ｓ ｔ ｈ ｄ ｃ ｌ ｏ ｈ ｉ ｂ ｏｎ ａ ｅ ｎ ｕ ｏ ｓ ｔ ａ ｅ ｅ ｉｅ ｔ ｄ ｂ ｍｍｕ ｏ ｙ０ ｈ ｍｉｔ ．Ｃｏ ・ ｆｌｍｅ ｔ ａｔ ｒ７ Ｏ ｃ ｌ ｒ ． ｈ ｔｅｃ ｅ ｅｌ ｎ ｔ ｅ ｓ ｋ ｆ ｒ ｉ ｒ ｅ ｒ ｎ ｈ ｔｗ ｒ ｄ ｎ ｉ ｅ ｙ ｉ ｅ ｕ ｒ ｓ ｌ ｉ ｉ ｆ ｎ ｃ ｔｃ ｅ ｓｒ ｙ ｎ ｃｕ ｉ ｎ ：Ｎ ｕ ｉ ｓ ｏ ｉ ｐ ｃ ｍｐ ｌ ｅ ｒ ｎ ａ ｘ ｅ ｄ ａｏ ｇ ｓ ｋ ｆ ｒ ｉ ｌ ｍｅ ｔ， ｈ ｅ ｕ ｔ ｓ ｇ ｅ ｔｄ ｔ ａ ｉ ｉ ｒ ｉ ａ ｏ ｄ ｂ ｏ ｌ ｓｏ ｓ ｅ ｒ ｉ ｆｈ ｐ ｏ ａ ａ ｎ ｕ ｏ ｓ ｃ ｎ ｅ ｔｎ ｌｎ ｉ ｂ ｏｎ ｆ ａ ｎ ｓ ｔ ｅ ｒ ｓ ｌ ｕ ｇ ｓｅ ｈ ｔ ｌ ｆ ｏ ｎ ｈ ｓｇ ｏ ｉ — ｔ ｌ ｉ ｉ ｓ ｓｋ ｂ ｃ ｍｐ ｔ ｉ ｔ ｔ ｉ ｐ ｃ ｍｐ ｌ ｅ ｒ ｎ ． ｏ ａｉ ｌｙ ｗｉ ｈ ｐ ｏ ａ ａ ｕ ｏ ｓ ｂｉ ｈ ｎ Ｋｅ ｏ ｄ ｈｐ ｏ ａ ａ ｅ ｒ ｎ ； ｉ ｉ ｒ ｉ ， ｉｃ ｍｐ ｔ ｉ ｙＷ ｒ ｓ ｉ ｐ ｃ ｍｐ ｌｎ ｕ ｏ ｓ ｓｌ ｆ ｏ ｎ ｂ ｏ ｏ ａｉ ｔ ｋ ｂ ｌｙ
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
海马神经元培养
（1）材料
①孕鼠：海马：孕18d，皮层或纹状体：孕16d
②Neurobasal medium (Gibco-BRL, cat. no. 21103)
L-Glutamine (Gibco-BRL, cat. no. 25030) 谷氨酰胺
Glutamic acid (Sigma, cat. no. G-1626) 谷氨酸
B27 (Gibco-BRL, cat. no. 17504)
③Poly-D-lysine (mol wt 30,000—70,000) (Sigma, cat. no. P-7280)多聚赖氨酸
④Hank’s balanced salt solution (HBSS) (Gibco-BRL, cat. no. 14025)
⑤HBSS without Ca2+, Mg2+ (Gibco-BRL, cat. no. 14175)
⑥trypsin 胰酶
⑦NaHCO
3
⑧Na pyruvate (Gibco-BRL, cat. no. 11840)丙酮酸钠
⑨Trypan blue, 0.4% 台盘蓝
⑩巴氏吸管，前端用火抛光
刻度吸管
离心管
闪烁瓶
玻璃培养皿：小：3套
大：2套
冰袋、纱布
手术器械、筛网
培养瓶或培养板
（2）步骤
①准备
a．配制试剂
i) Poly-D-lysine（需保存在聚苯乙烯容器中，不能保存在玻璃、聚碳酸酯或聚丙烯容器中）
配制硼酸缓冲液（pH8.4）
A液（硼砂溶液）：1.907g硼砂溶于100ml纯水（0.05M），0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存
B液（硼酸溶液）：1.237g硼砂溶于100ml纯水（0.2M）0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存
4.5mlA液+
5.5mlB液
5mg P-D-L溶于10ml硼酸缓冲液中，配制成0.5mg/ml贮存液，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，-20℃保存使用时用硼酸缓冲液稀释10倍。
ii)HBSS without Ca2+, Mg2+（D-Hank’s溶液）配制
不含钙、镁的HBSS粉剂：4.75g溶于400ml纯水
NaHCO3：0.175g加入溶液
1M NaOH 调节pH至7.2-7.4
纯水定容至500ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存
iii）1M NaOH溶液配制
NAOH：4g 溶于100ml纯水
iv）0.125%胰酶+0.02%EDTA
D-Hank’s溶液10ml
EDTA 20mg 溶解后
D-Hank’s溶液80ml
胰酶125mg 溶解后
1M NaOH溶液调节pH至7.2
D-Hank’s溶液定容至100ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存
v）D-Hank’s溶液配制（0.035% NaHCO3，1mM Na pyrurate，10mM HEPES，pH7.4）
不含钙、镁的HBSS粉剂： 2.375g溶于200ml纯水
NaHCO3：0.088g加入溶液
HEPES：0.596g加入溶液
Na pyrurate（100mM）： 2.5ml加入溶液
1M NaOH 调节pH至7.4
纯水定容至250ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存
vi）Hank’s溶液配制（0.035% NaHCO3，1mM Na pyrurate，10mM HEPES，pH7.4）
含钙、镁的HBSS粉剂： 2.45g溶于200ml纯水
NaHCO3：0.088g加入溶液
HEPES：0.596g加入溶液
Na pyrurate（100mM）： 2.5ml加入溶液
1M NaOH 调节pH至7.4
纯水定容至250ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存
vii）10%FBS的DMEM/F12（D/F12）
90ml D/F12
10mlFBS
viii）Neurobasal/2% B27-A （0.5 mM glutamine， 25 μM glutamate ）
Neurobasal： 98ml
B27： 2ml
200mM glutamine： 0.25ml
25mM glutamate： 0.1ml
ix）Neurobasal/2% B27-B （0.5 mM glutamine）
Neurobasal： 98ml
B27： 2ml
200mM glutamine： 0.25ml
b．消毒：手术器械：眼科剪、眼科镊、筛网
培养皿：玻璃培养皿：小：3套，大：2套
纱布
闪烁瓶、离心管
巴氏吸管、刻度吸管
（培养瓶、盖玻片等）
c．塑料培养瓶或培养板的清洗、紫外消毒
d．Poly-D-lysine 包被：
将配制好的P-D-L铺于培养瓶或培养板，使其完全覆盖底面，置于培养箱1h或过夜。
回收P-D-L，并用纯水清洗培养瓶或培养板3遍，置培养箱中待其干燥。
②解剖
a．超净工作台中铺两块纱布，放冰袋，将一个大培养皿和5个小培养皿放于冰袋上，皿中加入无钙、镁HBSS，预冷。
b．另取一块纱布铺于超净工作台上，取手术器械置于其上备用。
c．戊巴比妥钠麻醉孕鼠，取出子宫，置一培养皿中，倒入75%酒精中消毒。
d．剖开子宫，取出胚胎，置另一培养皿中，75%酒精消毒后，剪下头部，移至冰袋上含无钙、镁HBSS 的大培养皿中备用。
e．剪开头部皮肤和颅骨，将完整的脑组织移入冰上一含无钙、镁HBSS的小培养皿中。
f．分离海马，移入另一含无钙、镁HBSS的小培养皿中。
g．仔细剥离脑膜和血管，将分离干净的海马，移入另一含无钙、镁HBSS的小培养皿中。
h．再次将分离干净的海马，移入另一含无钙、镁HBSS的小培养皿中清洗一下。
③消化和分离细胞
a．将海马组织移入一闪烁瓶中，加入2ml胰酶，用眼科剪将海马剪为1×1×1m m3左右的小块，放入培养箱孵育8～10min。
b．加入2ml含10%FBS的D/F12终止消化。
c．用巴氏吸管轻柔吹打消化后的海马组织（10～15次，尽量避免起泡），待液体呈乳状后静置3min，使未吹散的组织块沉底。
d．在超净台上放一干净小培养皿，筛网置于其上备用。
f．将静置后的上层液体经筛网滤入小皿中。
（注意不要将组织块吸到筛网上）
g．在闪烁瓶中重新加入2mlHBSS，重复c～f（可重复2～3次）。
h．将得到的滤液移入离心管中，1000rpm，5min。
i．弃上清，用适量Neurobasal/2% B27-A（如果胎龄大于18d则用Neurobasal/2% B27-B）重悬细胞。
④细胞计数
a．将细胞悬液与等量0.04%台盘蓝溶液混匀。
b．用血球计数板计数活细胞数量
⑤细胞培养
a．用适量Neurobasal/2% B27-A（如果胎龄大于18d则用Neurobasal/2% B27-B）调节细胞密度。
b．按1×105/cm2的密度将细胞种入预先包被多聚赖氨酸的培养瓶或培养皿中，置培养箱培养（37℃，5%CO2，饱和湿度）。
c．4d时半量换液，以后每w半量换液一次。
（换液用Neurobasal/2% B27-B）。