海 马 神 经 元 培 养

海马神经元培养

（1）材料

①孕鼠：海马：孕18d，皮层或纹状体：孕16d

②Neurobasal medium (Gibco-BRL, cat. no. 21103)

L-Glutamine (Gibco-BRL, cat. no. 25030) 谷氨酰胺

Glutamic acid (Sigma, cat. no. G-1626) 谷氨酸

B27 (Gibco-BRL, cat. no. 17504)

③Poly-D-lysine (mol wt 30,000—70,000) (Sigma, cat. no. P-7280)多聚赖氨酸

④Hank’s balanced salt solution (HBSS) (Gibco-BRL, cat. no. 14025)

⑤HBSS without Ca2+, Mg2+ (Gibco-BRL, cat. no. 14175)

⑥trypsin 胰酶

⑦NaHCO

3

⑧Na pyruvate (Gibco-BRL, cat. no. 11840)丙酮酸钠

⑨Trypan blue, 0.4% 台盘蓝

⑩巴氏吸管，前端用火抛光

刻度吸管

离心管

闪烁瓶

玻璃培养皿：小：3套

大：2套

冰袋、纱布

手术器械、筛网

培养瓶或培养板

（2）步骤

①准备

a．配制试剂

i) Poly-D-lysine（需保存在聚苯乙烯容器中，不能保存在玻璃、聚碳酸酯或聚丙烯容器中）

配制硼酸缓冲液（pH8.4）

A液（硼砂溶液）：1.907g硼砂溶于100ml纯水（0.05M），0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存

B液（硼酸溶液）：1.237g硼砂溶于100ml纯水（0.2M）0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存

4.5mlA液+

5.5mlB液

5mg P-D-L溶于10ml硼酸缓冲液中，配制成0.5mg/ml贮存液，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，-20℃保存使用时用硼酸缓冲液稀释10倍。

ii)HBSS without Ca2+, Mg2+（D-Hank’s溶液）配制

不含钙、镁的HBSS粉剂：4.75g溶于400ml纯水

NaHCO3：0.175g加入溶液

1M NaOH 调节pH至7.2-7.4

纯水定容至500ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存

iii）1M NaOH溶液配制

NAOH：4g 溶于100ml纯水

iv）0.125%胰酶+0.02%EDTA

D-Hank’s溶液10ml

EDTA 20mg 溶解后

D-Hank’s溶液80ml

胰酶125mg 溶解后

1M NaOH溶液调节pH至7.2

D-Hank’s溶液定容至100ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存

v）D-Hank’s溶液配制（0.035% NaHCO3，1mM Na pyrurate，10mM HEPES，pH7.4）

不含钙、镁的HBSS粉剂： 2.375g溶于200ml纯水

NaHCO3：0.088g加入溶液

HEPES：0.596g加入溶液

Na pyrurate（100mM）： 2.5ml加入溶液

1M NaOH 调节pH至7.4

纯水定容至250ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存

vi）Hank’s溶液配制（0.035% NaHCO3，1mM Na pyrurate，10mM HEPES，pH7.4）

含钙、镁的HBSS粉剂： 2.45g溶于200ml纯水

NaHCO3：0.088g加入溶液

HEPES：0.596g加入溶液

Na pyrurate（100mM）： 2.5ml加入溶液

1M NaOH 调节pH至7.4

纯水定容至250ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存

vii）10%FBS的DMEM/F12（D/F12）

90ml D/F12

10mlFBS

viii）Neurobasal/2% B27-A （0.5 mM glutamine， 25 μM glutamate ）

Neurobasal： 98ml

B27： 2ml

200mM glutamine： 0.25ml

25mM glutamate： 0.1ml

ix）Neurobasal/2% B27-B （0.5 mM glutamine）

Neurobasal： 98ml

B27： 2ml

200mM glutamine： 0.25ml

b．消毒：手术器械：眼科剪、眼科镊、筛网

培养皿：玻璃培养皿：小：3套，大：2套

纱布

闪烁瓶、离心管

巴氏吸管、刻度吸管

（培养瓶、盖玻片等）

c．塑料培养瓶或培养板的清洗、紫外消毒

d．Poly-D-lysine 包被：

将配制好的P-D-L铺于培养瓶或培养板，使其完全覆盖底面，置于培养箱1h或过夜。

回收P-D-L，并用纯水清洗培养瓶或培养板3遍，置培养箱中待其干燥。

②解剖

a．超净工作台中铺两块纱布，放冰袋，将一个大培养皿和5个小培养皿放于冰袋上，皿中加入无钙、镁HBSS，预冷。

b．另取一块纱布铺于超净工作台上，取手术器械置于其上备用。

c．戊巴比妥钠麻醉孕鼠，取出子宫，置一培养皿中，倒入75%酒精中消毒。

d．剖开子宫，取出胚胎，置另一培养皿中，75%酒精消毒后，剪下头部，移至冰袋上含无钙、镁HBSS 的大培养皿中备用。

e．剪开头部皮肤和颅骨，将完整的脑组织移入冰上一含无钙、镁HBSS的小培养皿中。

f．分离海马，移入另一含无钙、镁HBSS的小培养皿中。

g．仔细剥离脑膜和血管，将分离干净的海马，移入另一含无钙、镁HBSS的小培养皿中。

h．再次将分离干净的海马，移入另一含无钙、镁HBSS的小培养皿中清洗一下。

③消化和分离细胞

a．将海马组织移入一闪烁瓶中，加入2ml胰酶，用眼科剪将海马剪为1×1×1m m3左右的小块，放入培养箱孵育8～10min。

b．加入2ml含10%FBS的D/F12终止消化。

c．用巴氏吸管轻柔吹打消化后的海马组织（10～15次，尽量避免起泡），待液体呈乳状后静置3min，使未吹散的组织块沉底。

d．在超净台上放一干净小培养皿，筛网置于其上备用。

f．将静置后的上层液体经筛网滤入小皿中。（注意不要将组织块吸到筛网上）

g．在闪烁瓶中重新加入2mlHBSS，重复c～f（可重复2～3次）。

h．将得到的滤液移入离心管中，1000rpm，5min。

i．弃上清，用适量Neurobasal/2% B27-A（如果胎龄大于18d则用Neurobasal/2% B27-B）重悬细胞。

④细胞计数

a．将细胞悬液与等量0.04%台盘蓝溶液混匀。

b．用血球计数板计数活细胞数量

⑤细胞培养

a．用适量Neurobasal/2% B27-A（如果胎龄大于18d则用Neurobasal/2% B27-B）调节细胞密度。

b．按1×105/cm2的密度将细胞种入预先包被多聚赖氨酸的培养瓶或培养皿中，置培养箱培养（37℃，5%CO2，饱和湿度）。

c．4d时半量换液，以后每w半量换液一次。（换液用Neurobasal/2% B27-B）