脂肪氧合酶的作用机理及对谷物陈化的影响研究进展-

脂肪氧合酶的作用机理及对谷物陈化的影响研究进展

摘要：脂肪氧合酶(LOX)广泛存在于生物中，并且具有不同种类的底物位置特异性，可以形成具有不同位置特异性的氢过氧化脂肪酸，进而生成具有不同生物活性的物质。本文综述了脂肪氧合酶的作用机理、对谷物陈化的影响及其抑制方法的研究进展，对谷物食品加工有一定的指导意义。

关键词：脂肪氧合酶；作用机理；谷物陈化；适口性

脂肪氧合酶(Lipoxygenase，LOX，EC 1.13.11.12)，又称脂肪氧化酶(Lipoxidase)或胡萝卜素氧化酶(Carotene Oxidase)，分子量范围一般在9000~100000之间（汪晓明等，2013）。LOX是一种含非血红素铁的蛋白，酶蛋白由单肽链组成，它专门催化具有顺，顺-1，4-戊二烯结构的不饱和脂肪酸及其酯的氢过氧化作用，通过分子内加氧，形成具有共轭双键的氢过氧化衍生物(Andreou A et al., 2009)。LOX广泛存在于各种动物、植物、真菌以及少数海生生物中，在豆类中具有较高的活力，尤其以大豆中的活力为最高，LOX占大豆总蛋白含量的1%-2%（S. Nanda et al,. 2003）。在植物中其底物主要是亚油酸(Linoleic acid)和亚麻酸(Lionlenic acid)，在动物体内其底物主要是花生四烯酸(arachidonic acid)。据脂肪氧合酶氧化花生四烯酸位置特异性，可将脂肪氧合酶分为5-LOX，8-LOX，12-LOX和l5-LOX。大豆脂肪氧合酶LOX-1属于15-LOX，它已被广泛应用于同类脂肪氧合酶功能和性质模型（何婷等，2008）。本文结合国内外文献资料综述了脂肪氧合酶的作用机理以及对食品品质的影响，对食品的加工贮藏有着重要的指导意义。

1 脂肪氧合酶的同工酶

1970年，Christopher等利用离子交换层析法将脂肪氧合酶分离成Ⅰ型和Ⅱ型两个组分，两组分在许多性质上都不同，如酶活最适pH、热稳定性、Ca2+相关性、等电点、底物专一性等。大豆脂肪氧合酶有四种电泳类型，LOX-1主要出现在层析法分离的Ⅰ型中，也正是最早被Theorell分离结晶的那一种。LOX-2和LOX-3出现在Ⅱ型中。层析法的不断改进又将LOX-3分离成3a和3b两种，这两者在许多性质上相似。LOX的几种同工酶的性质比较见表1（蔡琨，2004）。

表1 几种脂肪氧合酶同工酶性质比较

LOX-1LOX-2LOX-3a LOX-3b

最适pH 9 6.8 7 7

Ca2+相关性激活激活抑制抑制

热稳定性热稳定受热易失活受热易失活受热易失活

等电点 5.70 5.85 5.95 6.20

二硫键数 4 4 3 3

含巯基数 4 4.2 5.6或6 5.9

底物特性阴离子底

物

酯化底物单氧化物单氧化物

生成氢过氧化

物类型

13位9或13位9或13位9或13位2 脂肪氧合酶的作用机理

脂肪氧合酶分子中含有金属原子（非血红素铁），运用物理方法研究该金属原子的性质和环境，发现其处于一种八面体配位环境中。在一定的条件下，例如在脂肪酸氢过氧化物存在时，铁原子可以从高自旋的Fe2+静态转变为具有催化活性的高自旋的Fe3+态。在绝大多数脂肪氧合酶接触催化反应中，铁在Fe2+和Fe3+之间变动，但铁原子一般不会离开大豆脂肪氧合酶（蔡琨，2004）。

脂肪氧合酶途径，简称LOX途径，是脂肪酸氧化的途径之一。LOX途径是指多不饱和脂肪酸在有氧条件下经脂氧合酶催化生成氢过氧化物，再经一系列不同的酶的作用最终生成具有一定生理功能的化合物，是铁催化单电子的氧化还原反应（陈艳君，2008）。大豆脂肪氧合酶是研究脂肪氧合酶最好的模型，本文介绍了过氧化和自由基两种作用机制。

2.1 自由基机制

脂肪氧合酶反应包括三个连续反应：（1）从双等位亚甲基中立体选择性移去氢原子；（2）在与Z,E-二烯结合中，游离自由基发生重排；（3）立体特异性接入氧，氢过氧化自由基还原为相应阴离子。从立体化学角度考虑，每个阶段可通过不同途径进行。

图1 脂肪氧合酶的自由基氧化机理(Hartmut K et al., 1999)

黄友如等（2008）采用电子顺磁共振技术研究了大豆脂肪氧合酶催化亚油酸氧化与大豆蛋白相互作用过程中自由基的迁移，表明大豆蛋白聚集体的形成与脂肪氧合酶催化亚油酸诱导产生的自由基有关，借助于电子自旋共振(ESR)证实了导致大豆蛋白聚集体形成的自由基由氧化亚油酸到大豆蛋白的迁移，并确定了部分自由基的类型。

2.2 过氧化机制

LOX的作用机制可用大豆脂肪氧合酶的同工酶LOX-1 作用于通常底物亚油酸（ROOH）来解释(Srinivasulu S.，1996)。酶处在未活化状态时，酶分子中的Fe以还原态Fe2+存在。酶与微量的13-S-亚油酸氢过氧化物作用即激发为活化态，此时酶分子中的Fe以氧化态Fe3+存在。活化态脂肪氧合酶作用于亚油酸的第一步是从C11立体有择地取走一个氢，这是整个酶反应的限速步骤。在图中所指出的同工酶LOX-1作用机制中，酶取走了H，产生黄色的亚油酸自由基-酶络合物，同时，脂肪氧合酶分子中的Fe从三价氧化态变成二价还原态（曹慧等，2001）。

接下来的反应可分为两种途径：（1）在有氧条件下，O2 接到亚油酸自由基—酶络合物上去，有可能伴随着发生O2被活化成O2·的过程，O2通过反面机制接到亚油酸分子上被取走的H的相反一侧。氢过氧化亚油酸游离基从酶分子中的Fe 上取走一个电子并从介质中得到一个质子形成13-S-亚油酸氢过氧化物，同时酶中的铁转变为三价态，继续参与反应。在13-S-亚油酸氢过氧化物形成时，双键

从C12移到C11，构型从顺式转变成反式。在pH9时，大豆脂肪氧合酶的同工酶LOX-1以亚油酸为底物的主要产物是13-S-ROOH。此外，还可能产生其它三种异构体：13-R-ROOH、9-R-ROOH和9-S-ROOH。除了酶的特异性外，还有许多其它因素决定了脂肪氧合酶作用的产物究竟是哪一种异构体或哪几种异构体及其比例。

（2）在无氧条件下，亚油酸自由基-酶络合物分解成亚油酸自由基和酶（E-Fe2+），后者同13-S-ROOH 作用产生自由基RO·和OH·，同时酶中的铁变为三价。亚油酸自由基同RO·和OH·作用生成二聚体、氧代二烯酸和正戊烷等（刘欣，2007）。

理论上讲，在脂肪氧合酶催化过程中，氧原子可以加在顺，顺-1，4-戊二烯系统的任一末端，所以当以亚油酸为底物时，其氧化产物有9-或13-氢过氧化亚油酸（LA-HPOD）。酶的来源及反应条件的选择决定了反应产物中9-与13-HPOD 异构体比例。许多研究表明，在一般的水相反应体系中，大豆LOX-1催化生成的产物中13-HPOD的比例为70～96%，13-HPOD在任何pH值时都能生成，在有Tween 20存在的情况下，当pH值大于8.5时，基本不会生成9-HPOD；当pH值低于8.5时，随着pH值的降低，产物中9-HPOD的比例线性增加，至pH 6，9-HPOD 在产物中的比例增大到25％左右。Gardner和Weisleder在玉米中发现了一种只催化产生9-HPOD异构体的脂肪氧合酶。Iacazio等利用大豆脂肪氧合酶（LOX-1）合成了亚油酸13S-HPOD，反应在pH 9.0的硼酸盐缓冲液中进行，1小时后氢过氧化物产率达80%，经HPLC分析，产物中13S-HPOD占95%。（生吉萍，1999）

3 脂肪氧合酶对谷物陈化及其适口性的影响

在米种的贮藏期间，因其存在有多种LOX 而表现为很多生物物理性质和生物化学性质的改变，包括种子发芽率下降、不同细胞器膜完整性的丧失和遗传性质等改变（Kapoor et al., 2011）。谷物贮藏期间质量的恶化问题同样存在于玉米（Orak H et al., 2010）、大豆、胡椒当中（Kaewnaree et al., 2011）。

研究谷物在贮藏过程中的变化后，有学者提出禾本科作物水稻稻谷陈化变质是由多元不饱和脂肪酸酶促降解所致（Choudhury NH et al., 1980）。稻谷中含有2% - 3% 的脂质，在贮藏的过程中，由于脂质的降解，导致游离脂肪酸含量的迅速上升，从而使得稻谷败坏加速（Shin MG et al., 1986）。而谷物中LOX 能进一步催化不饱和脂肪酸过氧化生成脂氢过氧化物，如活性氧、丙二醛、羟基壬烯酸，这些物质可以通过和赖氨酸、半胱氨酸巯基、组氨酸咪唑基等反应而导致细胞蛋白损伤（Xiaozhao Xu et al., 2013）。活性氧会导致大分子和细胞的结构改变从而不能维持其原有的性质（WU Q et al., 2012），这些性质的改变会导致谷物营养品质的下降并影响种子的发芽率（Kaewnaree et al., 2011）。脂质的降解是导致其谷物品质下降的主要原因，而脂氧合酶是脂质降解的关键酶。

Zhang Ying等研究三个分别缺乏LOX同工酶LOX-1、LOX-2和LOX-3的水稻品种，以正常的水稻品种作为对照，在黑暗环境中放置42个月，并进行加速老化处理，发现含有LOX-1、LOX-2的品种在贮藏后品质下降明显，并且发芽率也有所下降，表明LOX-1、LOX-2与种子的贮藏稳定性有较大关系；此外，缺乏LOX-3的品种其虫害减小，表明LOX-3在水稻抗虫性方面可能发挥很重要的作用（Zhang Ying t al., 2007）。

理论上讲，LOX 的缺失可以明显地阻止脂质过氧化作用，减缓贮藏粮食氧