高效液相色谱法概述

高效液相色谱法概述
摘要：本文概述了高效液相色谱的产生、发展，分类、应用、存在问题及发展前景。

关键词：高翔液相色谱、分类、应用
高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC) 是利用高压输液泵驱使流动相通过装填固定相的色谱柱，按照固液相之间的分配机制对混合物进行分离的方法。

一、高效液相色谱的产生及发展
在过去三十多年里, HPLC 已经成为一项在化学科学中最有优势的仪器分析方法之一, 1994年, HPLC 的市场销售量是14亿美元, 就是一个较好的证据。

现在, HPLC 几乎能够分析所有的有机、高分子及生物试样。

、
1941年, 马丁( Matin) 和辛格( Synge) 用一根装满硅胶微粒的色谱柱, 成功地完成了乙酰化氨基酸混合物的分离, 建立了液液分配色谱方法, 他们也因此获得了1952年诺贝尔化学奖。

从此开启了色谱技术的发展，紧接其后的塔板理论、速率理论的建立，使得色谱技术和理论得到了迅速的发展。

HPLC 的第一个雏形是由斯坦因( Stein) 和莫尔( Moo re) 于1958年发展起来的氨基酸分析仪( AAA) , 这种仪器能够进行自动分离和蛋白质水解产物的分析, 由于这种研究的重要性, 别的研究者也被吸引来进行这一方面的重要课题的研究, 最终直接促成了HPLC 方法的建立。

在此期间, 哈密顿( Hamiton) 在柱效率和选择性方面的成就而使得他的工作特别有价值。

在六十年代早期的相关进展是莫尔( Moo re) 发展起来的凝胶渗透色谱( GPC) 。

不久以后, 华特斯(Waters) 有限公司制造了商业GPC 仪, 这种仪器经过微小的改进之后可用于HPLC 分离。

在1968～1971年间, 推出了第一台普遍适用的HPLC 商用系统。

1971年以后, 对映体( 手性异构体) 和大生物分子如蛋白质的HPLC 分离逐步建立起
来。

到了八十年代中期, HPLC 分析技术很明显成了一种成熟的技术, 激动人心的新发展日益减少, 许多领先研究者纷纷转向相关领域的研究, 如超临界流体色谱法( SFC) 毛细管电泳( LZE) 、制备色谱法( PC) 等等。

在仪器方面, 近年来, 毛细管液相色谱的理论塔板数已大大提高, 电化学和激光诱导荧光法已获得很大发展, 对紫外可见光谱的快速扫描检测, 使液相色谱能提供的信息量大幅度增加, 为化学计量学中的许多手段, 如模式识别等提供了重要的应用领域。

二、高效液相色谱的分类
高效液相色谱法按照分离机制可分为以下4 种：
1、液-液分配色谱法（liquid-liquid chromatography)
LLC 根据流动相和固定相的极性不同又可分为，①正向LLC：流动相极性<固定相极性，极性小的组分先流出色谱柱，适合极性物质分离。

②反向LLC：流动相极性>固定相极性，极性大的组分先流出色谱柱，适合非极性物质分离。

理论上应不相溶的固定相和流动相，实际上仍有少量微量固定相溶解，并且机械冲击作用也会导致固定相流失，从而使柱的分离效率和选择性降低, 目前主要采用化学键合固定相(即通过固定相的有机基团与载体（硅胶）表面的游离羟基发生化学反应，从而使固定相与载体键合起来)来克服这一问题。

2、液-固吸附色谱法（liquid-solid adsorption chromatogramphy）
在吸附色谱中，组分分子和流动相分子对吸附剂（固定相）表面产生竞争性吸附，利用组分和固定相吸附力的不同而分离。

3、离子交换色谱法(ion exchange chromatography)
离子交换剂上可解离的离子与流动相中组分离子进行可逆的离子交换，利用试样中不同组分与离子交换剂具有不同的亲和力而将它们分离的方法。

4、空间排阻色谱法（凝胶色谱法）
试样中分子量大小不同的组分进入凝胶柱时，组分分子渗入微孔的程度不同，大分子直接从间隙中越过，首先出柱，分子越小，进入微孔越深，保留值越大，溶剂分子通常最小，最后流出。

主要用来分离高分子化合物，如蛋白质、多糖等。

三、高效液相色谱的应用
HPLC 已成为应用最为广泛和有效的分离分析手段，应用非常广泛，目前，HPLC 在医药、生化、天然产物主要成分的分析、食品分析、环境分析等方面都有广泛的用途
：
1、医药方面
广泛用于药物的分离、分析、定量等。

1）药物合成的分离精制在药物合成反应中，作为人工合成药物的精制手段，用于除去少量杂质，特别是那些异构体的分离。

值得提出的是，药物中R-型和S-
型的光学异构体具有不同的生理作用。

为了研究药物的作用机制，需要拆分
光学异构体(即对映体)，这是很困难的工作，而高效液相色谱在这方面显示了独特的长处。

利用不同类型的手性固定相与对映体能生成稳定性不同的非对映异构体，从而达到分离目的。

2）天然产物的分离分析天然产物的组分非常复杂，例如中草药等，用高效液相色谱法进行分离分析，具有简单快速的特点。

2、生命科学中的应用
其在生化领域的应用主要集中于两个方面：①低分子量物质，如氨基酸、有机酸、有机胺、类固醇等的分离和测定。

②高分子量物质，如多肽、核糖核酸、蛋白质和酶（各种胰岛素、激素、细胞色素、干扰素等）的纯化、分离和测定。

过去对这些生物大分子的分离主要依赖于等速电泳、经典离子交换色谱等技术，但都有一定的局限性，远远不能满足生物化学研究的需要。

因为在生化领域中经
常要求从复杂的混合物基质，如培养基、发酵液、体液、组织中对感兴趣的物质进行有效而又特异的分离，通常要求检测限达ng 级或pg 级，或pmol，fmol，并要求重复性好、快速、自动检测；制备分离、回收率高且不失活。

在这些方面，HPLC 具有明显的优势。

3、食品方面
高效液相色谱法已经被广泛应用于下面二个领域：①食品营养成分分析：蛋白质、氨基酸、糖类、色素、维生素、香料、有机酸（邻苯二甲酸、柠檬酸、苹果酸等）、有机胺、矿物质等；②食品添加剂分析：甜味剂、防腐剂、着色剂（合成色素如柠檬黄、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、亮蓝等）、抗氧化剂等；③食品污染物分析：霉菌毒素（黄曲霉毒素、黄杆菌毒素、大肠杆菌毒素等）、微量元素、多环芳烃等。

4、环境方面
在对大气中污染物的成分分析，废水、废汽和汽车尾气中有害组分的分析中，高效液相色谱法发挥着很大的作用。

5、农业方面
在农业的发展中，高效液相色谱也发挥着很大的作用。

它主要用来对各种农作物中营养成分进行分析，特别是对多糖、脂肪酸、蛋白质等分析都是极为有效的方法。

四、高效液相色谱法存在的问题
1、涡流扩散（Eddy diffusion）
流动相碰到较大的固体颗粒，就像流水碰到石头一样产生涡流。

如果柱装填得不均匀，有的部分松散或有细沟，则流动相的速度就快；有的部位结块或装直紧密则流速就慢，多条流路有快有慢，就使区带变宽。

因此，固相载体的颗粒要小而均匀，装柱要松紧均一，这样涡流扩散小，柱效率高。

2、分子扩散（Molecular diffusion）
分子扩散就是物质分子由浓度高的区域向浓度低的区域运动，也称纵向分子扩散。

要减少分子扩散就要采用小而均匀的固相颗粒装柱。

同时在操作时，如果流速太慢，被分离物质停留时间长，则扩散严重。

3、质量转移（Mass transfer）
被分离物质要在流动相与固定相中平衡，这样才能形成较窄的区带。

在液相色谱中，溶质分子要在两个液相之间进行分配，或在固相上被吸附和解吸附均需要一定的时间。

当流速快时，转移速度慢，来不及达到平衡流动相就向前移，产生物质的非平衡移动，使区带变宽。

4、流动相流速
当流速太低时，分子扩散严重。

如将理论塔板高度对流速作图，理论塔板高度随流速增加而急速下降，当达到最低值时，流速再加大则质量转移起主要作用，理论塔板高度又加大。

在高效液相色谱中，流速稍快影响不大，但在凝胶过滤色谱中，因为物质要渗透到凝胶内部，所以质量转移影响大，
流速加大会降低柱效率。

5、固定相颗粒大小
固定相颗粒越小柱效率越高，对流动相流动的阻力越大，需要加大压力才能使它流动。

五、结语
高效液相色谱法虽存在上述不足之处，但由于分析速度快、分离效率高、检测灵敏度高、检测自动化、适用范围广、组分易回收、样品处理较简单等优点，从而在医药、食品、生化、环境分析等领域还是有着广泛的应用前景。

参考文献
[1] 丁明玉,陈培榕,罗国安.食品中有机酸的高效液相色谱分析法[J].色
谱,1997,15(3):212-215.
[2] 李军,雍炜,李刚,等.食品中苏丹色素的液相色谱分析方法[J].食品工业科技,2005,26(11):157-160
[3] 吕娟涛7 杨伟丽7 潘秋燕高效液相色谱法在药学研究中的应用与进展卫生职业教育2005,23（22）:91-92
[4] 贾晓渊. 生物化工原理［J］. 华西药学杂志，2000，14(2) :123.
[5］杨长龙. 超临界流体色谱在生物工程中应用的新进展［J］. 分析科学学报，2005，15(4) :32.。