miRNA研究策略及技术
miRNA研究方法
miRNA研究方法miRNA主要研究技术深度测序抽提分离小分子（例如18-30nt）RNA，通过RT-PCR扩增之后，利用solexa深度测序，并进行生物信息学分析，获得miRNA表达谱。
深度测序结合生物信息学分析手段，可以对海量数据进行分析，分别统计出已知的miRNA（miRNA-known）、新的miRNA（miRNA-new）以及可能的新miRNA（mi RNA-cadidate new），并对新发现的miRNA进行靶基因分析，功能预测等。
通过深度测序的方法，可以发现新的miRNA，为进一步的深入研究奠定基础。
miRNA芯片利用miRNA芯片（例如Agilent miRNA芯片），可以高通量分析miRNA表达的时空特异性、不同样本（例如癌组织和癌旁组织）中miRNA的差异表达，进而进行把基因分析，功能注释、通路分析，网络分析等，以了解miRNA在疾病发生中的作用。
与深度测序不同，miRNA芯片针对已知miRN A进行研究。
筛选到的差异miRNA可以利用q-pCR进行验证。
q-PCR q-PCR技术可以用来检测miRNA以及其靶mRNA和相关mRNA等的检测，主要方法有茎环法和加尾法等。
前者针对特定miRNA设计引物，特异性好，然而成本较高，周期长；后者采用通用引物，时间短，通量较大。
(欧易生物为您提供以上项目的优质服务，详情请关注：)Mimics以及Antogomirs 通常基因功能研究常常采用过表达或干涉（抑制、敲除）等方法，miRNA 研究也不例外。
通过导入化学合成的小分子miRNA mimics或拮抗miRNA 的antagomir，观察靶mRNA 及编码蛋白表达以及细胞、动物水平的表型变化，进行信号通路研究，是目前miRNA功能研究的常用方法。
萤光素酶报告系统在确定了靶mRNA之后，找到位于3ˊ-UTR区的miRNA结合位点是研究者下一步关心的内容。
通过生物信息学分析获得候选的miRNA结合区域，将野生型和结合位点突变的3ˊ-UTR序列克隆入商品化的萤光素酶报告载体（例如pMIR-REPORT? miRNA Expression Reporter Vector系统），通过观察miRNA对发光强度的影响对结合位点加以验证。
miRNA对心肌细胞肥大的调控作用及在心肌肥厚发病中的分子生物学作用机制研究进展
山东医药2020年第60卷第24期miRNA对心肌细胞肥大的调控作用及在心肌肥厚发病中的分子生物学作用机制研究进展朱贲贲，白在先,杨鹏杰内蒙古医科大学附属人民医院，呼和浩特010020摘要:心肌肥厚是由多种因素引起的心肌组织超负荷的适应性反应，为了维持心脏稳态及预防病理性心肌肥厚需要严格控制心肌细胞和非心肌细胞的信号通路。
微小RNA(miRNA)是真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA,长度为19~25个核昔酸。
miRNA可通过调节细胞代谢、增殖、免疫反应等参与调节心肌肥厚的发生发展。
miRNA影响心肌肥厚的分子生物学机制是多途径的,其参与miRNA正调控或负调控心肌肥厚都是多方面、多靶点的。
关键词：微小RNA;心肌肥厚;心肌细胞;miRNA再表达疗法;miRNA抑制疗法doi佛0.3969/j.issn.1002-266X.2020.24.030中图分类号:R541文献标志码:A文章编号心肌肥厚是由多种因素引起的心肌组织超负荷的适应性反应，可分为生理性和病理性。
生理性心肌肥厚常见于儿童、运动员以及妊娠期妇女,疾病进展缓慢且具有可逆性。
病理性心肌肥厚多是由高血压、心肌梗死等引起的，是心脑血管事件的独立危险因素。
持续的病理性心肌肥厚最终可导致扩张性心肌病、心力衰竭和猝死。
微/J、RNA(miRNA)是真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA,长度为19~25个核昔酸。
miRNA存在多种形式，最原始的Pri-miRNA,长度为300~1000个碱基。
Pri-miRNA经过一次加工后，成为Pre-miRNA 即microRNA前体,长度为70~90个碱基。
miRNA 在调控发育过程中具有抑制靶mRNA转录、翻译或者通过剪切靶mRNA促进其降解等重要作用。
近年来，因miRNA在生物过程中的调节作用及其在各类疾病(视网膜病症、神经退行性疾病、心血管疾病和癌症等)发生发展中的作用而被广泛研究[1]0在心血管系统中,miRNA控制各种细胞(如心肌细胞、内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞等)的功能，并在肌肥厚、心肌梗死、心肌纤维化、心力衰竭、心律失常、炎症反应和动脉粥样硬化等疾病中起至关重要的作用。
催化发夹自组装技术用于miRNA 检测的研究进展
微RNA (microRNA,miRNA)是一类小分子非编码RNA,仅由几十个碱基序列构成,主要调节基因表达,参与了细胞增殖、迁移、凋亡以及癌变等基本细胞生命过程,生物体所患有的很多疾病已被证实与miRNA 的异常表达密切相关[1-2]。
mi-RNA 凭借稳定地存在于人的外周血液中这一优势,被认为是液体活检的重要标志物,临床意义重要。
miRNA 在不同细胞中的表达是异质性的,研究单细胞miRNA 的表达对研究miRNA 介导的调控通路以及miRNA 相关疾病的复杂性和异质性具有重要价值[3-5]。
此外,在面对庞大而复杂的临床样本时,研发出快捷简单、准确有效的miRNA DOI:10.16605/ki.1007-7847.2022.05.0146催化发夹自组装技术用于miRNA 检测的研究进展龙禹同,万里,赵国杰*(中国医科大学生命科学学院,中国辽宁沈阳110122)摘要:微RNA (microRNA,miRNA)是一类小分子RNA,参与了众多的细胞过程,在生命体的生长发育过程中起到了关键作用。
鉴于miRNA 的重要性和结构特殊性,其对于疾病的预测与评估有着深刻的意义。
当前,miRNA 检测技术迅猛发展,其中,催化发夹自组装(catalytic hairpin assembly,CHA)是一项新型核酸恒温扩增技术,具有反应过程无需酶催化、检测灵敏度高特异性强、操作简单方便等优点,在miRNA 的检测领域有着巨大潜力。
本文将着重阐述CHA 技术的检测原理,从靶标识别、信号扩增、信号输出3个方面对基于CHA 技术的miRNA 检测策略进行介绍,并提出该技术当前面临的挑战及前景,旨在为医学、生物信息等相关领域的研究提供进一步参考。
关键词:微RNA (miRNA);催化发夹自组装(CHA);检测中图分类号:Q503文献标志码:A文章编号:1007-7847(2023)01-0086-09收稿日期:2022-05-11;修回日期:2022-08-11;网络首发日期:2022-09-30基金项目:沈阳市中青年科技创新人才支持计划项目(RC190235);中国医科大学大学生创新创业项目(X202210159088)作者简介:龙禹同(2000—),女,辽宁鞍山人,学生;龙禹同和万里对本文的贡献相同,为本文共同第一作者;*通信作者:赵国杰(1978—),男,辽宁沈阳人,博士,中国医科大学教授,主要从事核酸及核苷酸衍生物的生物化学、核酸相关酶学、核酸扩增等方面的研究,E-mail:**************.cn 。
汉恒生物-micorRNA研究整体策略
microRNA整体解决方案汉恒Th物技术服务手册microRNA研究总体策略功能模型芯片筛选芯片结果的QPCR验证过表达和抑制miRNA实验及功能分析靶基因Th物信息学预测及内源性分析靶标蛋白的内源性和外源性验证3’UTR靶标回复实验（rescue实验）研究实例8选用有功能差异对比的样本，进行mir 芯片筛选（mir-array ），筛选出变化明显的mir 。
现在主流的芯片平台是Agilent 和Affymetrix ，Agilent 只检出成熟体，而Affy 的芯片前体和成熟体皆 检出，假阳性率较高，但 Affy 的容量相比Agilent 的 大很多。
汉恒Th 物（Hanbio ）提 供Agilent 和Affymetrix 平 台的mirarray 筛选服务及后 续的芯片数据分析及靶基因聚类分析。
mir 进行QPCR 验证，挑选出丰度高且变化显著的mir （以下简称mir- X ）。
Mir 的QPCR 验证最首选的当然是Life 的Taqman 系列探针和kit 权威，但价格极其昂贵。
与之相比，特定引物SYBR 法检测mir 价 格适中，但误差率较高。
1汉恒Th物（Hanbio）特有一步反转技术，特异性好，简单易用。
汉恒已开发出针对不同种属mir的miRNA快速检测技术MiRQeasy，与市面一般的mir引物相比，信号更单一，且操作极其简便。
汉恒独有MiRTeasy一步法反转录试剂，一次性转录，兼顾了专一性和通用性。
过表达和封闭miRNA实验及功能验证原则：与mir变化相反的处理是否取缔功能表型的变化，而同向mir变化处理是否能模拟出功能表型变化。
比如我们发现mir-X在细胞某种诱导分化后升高，则诱导时取缔这种升高是否会抑制分化，而单单升高该mir 能否模拟出细胞分化表型。
1）初筛选：选取出若干芯片与QPCR验证变化一致，且组织表达丰度较高的Mir，运用Mimics（过表达）和inhibitor（封闭）分别在细胞中过表达和封闭特定的mir，观察细胞功能的变化。
miRNA的具体研究方法及研究思路
miRNA的具体研究方法及研究思路lin-4，第一个已知的miRNA，在1993年被发现。
自此，miRNA 的研究就一发不可收拾。
线虫、果蝇等模式生物的研究鉴定出miRNA的许多重要功能，包括发育期间细胞增殖和死亡的协调，抗逆性，脂肪代谢等等。
相对于这些低等的模式生物，哺乳动物的miRNA功能研究可就复杂得多。
在开始的几年，科学家们的首要目标是利用克隆、生物信息学和基因表达等方法编纂出完整的miRNA目录和它的表达方式。
随着这个目标日益接近，研究重心又转移至miRNA功能的阐释。
针对这一目标，涌现出多种技术，有报告基因分析、原位杂交、过表达和沉默、生物信息学预测算法等，它们都有助于miRNA功能的推断。
分析miRNA的表达在鉴定新的miRNA时，通常采用三种方法：正向遗传学、定向克隆和生物信息学分析。
正向遗传学主要运用于果蝇和线虫中，它通过一个突变表型来了解miRNA的功能。
第一个miRNA基因lin-4就是这么鉴定出的。
然而，正向遗传学这么多年来也就鉴定出寥寥几个miRNA。
这是因为miRNA很小，只要突变不影响种子序列，它们就有潜力耐受，因此很难击中。
另外，由于冗余，表型筛选不能识别很多miRNA突变体。
因此正向遗传学不可能成为鉴定miRNA的主力军。
之后，定向克隆技术的出现，让多种细胞系和组织中的miRNA 大规模鉴定得以实现，包括人、小鼠和斑马鱼等。
miRNA的克隆流程大致如下：在变性的聚丙烯酰胺凝胶上分离RNA样品，并回收大小在18-25 nt的片段。
接着，给RNA加上5’和3’接头，并进行RT-PCR，然后将片段克隆到载体上，构建出cDNA文库。
对单个克隆进行测序和分析，以确定小RNA。
目前测序技术的蓬勃发展也大大促进了这种方法。
然而对于某些只在特定细胞类型中表达，或以低水平表达的miRNA来说，鉴定起来还是有难度的。
另外，介于物理性质或转录后修饰，某些miRNA可能难以克隆，这也是一个棘手的问题。
miRNA的研究进展
miRNA在病毒感染诱发的免疫反应研究进展摘要：miRNA的发现给生物医药领域的研究带来了巨大的价值。
miRNA通过结合mRNA引起基因转录后沉默，达到调控基因表达的目的。
研究病毒感染细胞的miRNA表达谱是否可作为一种新的策略治疗病毒感染导致的疾病，本文就RNA 病毒与miRNA、miRNA与RNA病毒的复制、病毒与细胞miRNA这三个方面的研究进展进行综述。
关键词：miRNA, 病毒RNA，细胞miRNA，病毒miRNA1.miRNA的简介成熟miRNA是一条长约18-24nt的单链RNA，并由前体miRNA加工而成。
miRNA具有亚型，A.thaliana miRNA有稳定的miRNA亚型，比其本身多1-2个核苷酸。
miRNA亚型与miRNA共表达，常常显示为差异argonaute 复合物联系。
这些亚型是由父母剪接体miRNA的差异剪切形成的[4]。
miRNA首先在RNA 聚合酶II的作用下转录出前体miRNA，再经过Dicer加工，形成22nt的成熟miRNA。
成熟的miRNA将与RNA沉默复合体(RISC）相结合。
其中，RISC是由miRNA和mRNA靶点、Argonaute蛋白家族成员和辅助因子组成[1]。
其作用机理是miRNA与靶mRNA 3’-UTR内的靶序列互补配对，调节靶基因的表达[2]。
并且，一般不完全的互补配对导致靶基因的翻译受到抑制。
miRNA介导的翻译抑制或mRNA降解有可能在一种P小体中进行[3]。
真核生物基因组转录的98%是非编码RNA，占这么大比例的非编码RNA参与基因表达调控（101）。
miRNA参与多个生物过程，包括，转录、染色体结构、RNA形成和修饰、mRNA稳定性和翻译、以及蛋白稳定性和转运（12.，30,34）。
2.RNA病毒可以产生miRNAmiRNA是由22个碱基组成的非编码RNA。
其最主要的生物功能就是引起转录后基因沉默和调控基因表达。
目前，已有上百种保守细胞和病毒衍生的miRNA被识别和分离，发现miRNA对细胞转录组和病毒生命循环都具有调节作用。
microRNA过表达载体构建技术的实验研究
microRNA过表达载体构建技术的实验研究姜彬【摘要】目的：构建microRNA的表达载体，再转染生物体细胞观察该microRNA的转录或表达情况，以获知它的作用机理及对生物体的影响。
方法：以microRNA-21（简化为miR-21）为例说明构建表达载体的方法。
根据microRNA的成熟序列以及附近约200多碱基共约470个碱基序列，设计PCR 引物，PCR扩增，PCR产物和pcDNA3.1（＋）质粒双酶切后，用T4连接酶进行连接反应，并转化入感受态细胞，筛选后对重组质粒进行双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定及测序分析，并将其转染 Hela细胞，经 RT-PCR实验检测其表达情况。
结果：pcDNA3.1（＋）/miR-21过表达载体转染细胞后使得miR-21在细胞中过表达。
结论：成功构建了miR-21的真核表达载体，为进一步研究miR-21功能及作用机制奠定实验基础。
%This article introduces how to construct miRNA-21 overexpression vector and transfect it into cell ( Hela). Then the level of expression of miR-21 was observed. The miR-21 precursor is amplified by PCR method ,then the recombinant vector pcDNA3.1 (+ ) and miR-21 are constructed. After screening and identifying the recombinant ,it is transfected into cancer cells (Hela).The miR-21 expressing level is detected by RT-PCR.The result shows that the level of the miR-21 expression increases significantly in the cells that are transfected the recombinant. The miR-21 overexpression vector is successfully constructed ,and a foundation for studying the function of miR-21 is established .【期刊名称】《实验技术与管理》【年(卷),期】2014(000)001【总页数】5页(P41-44,48)【关键词】微小RNA;miR-21;pcDNA3.1(+)【作者】姜彬【作者单位】北京大学医学部生化系，北京 100191【正文语种】中文【中图分类】Q5221 microRNA概述1993年，Lee等［1］在线虫中发现了小分子单链非编码RNA，其长度只有22nt，当时命名为1in－4。
microrna研究课件
THANKS
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MicroRNA与其他非编码RNA的相互作用研究
探索miRNA与其他非编码 RNA（如lncRNA、circRNA
等）的相互作用和调控机制 ，揭示它们在基因表达和细
胞功能中的相互影响。
研究miRNA与病毒或宿主基 因的相互作用，深入了解病 毒复制和致病机制，为抗病
毒治疗提供新思路。
探索miRNA与表观遗传学修 饰的相互作用，揭示它们在 基因表达调控中的协同作用 。
疾病发生与发展
miRNA的异常表达与多种疾病的发生和发展密 切相关，包括癌症、心血管疾病、神经退行性 疾病等。
miRNA可以作为疾病的生物标志物，用于疾病 的早期诊断和预后评估。
通过调控miRNA的表达，可以开发新的治疗策 略和药物靶点。
肿瘤转移与耐药性
miRNA在肿瘤转移和耐药性的发生中发挥重要作用。
MicroRNA在人类健康与疾病中的全面认识
01
全面了解miRNA在人类健康和疾病中的功能和作用机制，为疾病的早期诊断、 预防和治疗提供新策略。
02
深入研究miRNA与药物代谢和药物反应的相互关系，为药物研发和个性化治疗 提供依据。
03
探索miRNA在衰老和衰老相关疾病中的作用，为抗衰老研究和治疗提供新思路 。
02
MicroRNA可以作为癌症诊断的生物标志物，用于早期发现、病情监 测和预后评估。
03
MicroRNA可以作为癌症治疗的靶点，通过调控MicroRNA的表达或 功能，实现治疗癌症的目的。
04
针对MicroRNA的靶向治疗是当前癌症治疗领域的研究热点之一，有 望为癌症治疗提供新的策略。
MicroRNA与神经退行性疾病
MicroRNA通过调控心血管细胞的生长、分化、凋亡等过 程，影响心血管疾病的发生和发展。
mirna
miRNAMicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约20~25个核苷酸。
成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装进RNA诱导的沉默复合体，通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。
最近的研究表miRNA参与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等等。
MicroRNA (miRNA)：是含有茎环结构的miRNA前体，经过Dicer加工之后的一类非编码的小RNA分子（18~25个核苷酸）。
MiRNA，以及miRISCs（RNA诱导基因沉默复合物）在动物和植物中广泛表达。
因之具有抑制靶mRNA转录、翻译或者能够剪切靶mRNA并促进其降解的功能，miRNA被认为在调控发育过程中有重要作用。
microRNAs（miRNAs）是一种小的，类似于siRNA的分子，由高等真核生物基因组编码，miRNA通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体（RISC）降解mRNA 或阻碍其翻译。
miRNAs在物种进化中相当保守，在植物、动物和真菌中发现的miRNAs只在特定的组织和发育阶段表达，miRNA的组织特异性和时序性，决定组织和细胞的功能特异性，表明miRNA在细胞生长和发育过程中起多种调节作用。
尽管在10多年前已经发表了第一篇关于miRNA的论文，但直到最近miRNA的普遍性和重要性才逐渐被人们所认识。
miRNA基因通常是在核内由RNA聚合酶II(polII)转录的，最初产物为大的具有帽子结构(7MGpppG)和多聚腺苷酸尾巴(AAAAA)的pri-miRNA。
pri-miRNA在核酸酶Drosha和其辅助因子Pasha的作用下被处理成70个核苷酸组成的pre-miRNA。
RNA–GTP和exportin 5将pre-miRNA输送到细胞质中。
miRNA的研究策略与方法
miRNA的研究策略与方法1. miRNA检测与鉴定：研究者可以使用多种方法来检测和鉴定miRNA。
最常用的方法是使用实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）来测量miRNA的表达水平。
此外，还可以使用Northern blotting、原位杂交、高通量测序等方法来检测miRNA的存在和表达水平。
2. miRNA功能的研究：为了了解miRNA的功能，研究者可以通过多种方法来探究miRNA与其靶基因之间的相互作用关系。
其中，miRNA靶向预测算法可以帮助确定可能的靶基因。
这些预测结果可以通过实验验证来评估其准确性。
常见的实验方法包括使用Luciferase报告基因系统、RNA结合蛋白共沉淀等技术。
3. miRNA在疾病中的研究：miRNA在人类疾病的发生和发展中起着重要的调控作用。
因此，研究miRNA与疾病之间的关系成为热门研究方向。
研究者可以使用高通量测序等方法，比较健康人群和疾病患者的miRNA表达谱，并通过使用生物信息学工具进行差异分析与生物信息学注释。
此外，还可以构建miRNA与疾病之间的关联网络，以揭示miRNA在疾病发生和发展中的调控网络。
4. miRNA药物的开发：近年来，miRNA药物的开发已成为治疗疾病的新领域。
研究者可以利用高通量筛选技术，如miRNA反义寡核苷酸（antimiRNA）筛选，来寻找具有特定功能的miRNA抑制剂。
此外，还可以使用miRNA模拟物或增强剂来恢复缺乏的miRNA表达水平，并开发具有治疗潜力的miRNA药物。
总之，miRNA的研究策略和方法是多样化的，包括miRNA检测与鉴定、miRNA功能研究、miRNA与疾病的关系研究以及miRNA药物的开发。
通过这些方法，研究者可以进一步了解miRNA在基因调控和疾病发生中的功能和机制，为疾病的治疗提供新的思路和方法。
microRNA实验方法
microRNA实验方法作者:Mary Johnson如果您想将您的microRNA实验方法,或想更新这里microRNA实验方法信息. 请与我们联系。
概观miRNAMicroRNAs(miRNAs)是一类非编码的小RNA分子，通过与靶RNA的3´UTR互补或部分互补结合，使其降解或介导其翻译抑制，参与细胞增殖、凋亡、分化、代谢、发育、肿瘤转移等多种生物学过程.miRNAs 基因通常位于基因间或编码蛋白基因的内含子中，在核内由RNA聚合酶II或III转录产生具有特征性茎环结构的pri-miRNA,然后在Drosha-DGCR8复合体的作用下，剪接成70nt的pre-miRNA,它由exportin5由核内运到胞浆。
在胞浆内，pre-miRNA在Dicer酶作用下剪切成22bp的成熟双链miRNA,其中的一条链与RISC结合而参与基因转录后水平的调控。
根据miRBase数据库，目前所发现的miRNAs已超过700个，随着高通量测序的应用，将会有更多的新的miRNAs被发现。
可能近90%的人类基因受到miRNAs调控，然而，当过表达或抑制某一个miRNA时，在发生调变的众多基因当中寻找并鉴定其中起关键作用的靶基因仍然具有相当大的挑战。
目前鉴定miRNA 靶基因的常用策略是利用生物信息学软件预测，结合基因芯片分析以及生物学实验方法来研究miRNA的功能及寻找其中起重要作用的靶基因。
此外，利用蛋白质质谱来寻找miRNA靶基因也成为一种新的途径。
microRNA的筛选在上千个miRNA中，哪些miRNA在特定的生物学功能起着关键的作用呢？这是研究miRNA功能所面临的首要问题。
miRNA基因技术可以快速有效的提供miRNA表达图谱。
通过比较正常样本与疾病样本中miRNA表达图谱的差异，寻找在生物学功能上起作用的miRNA。
该技术为临床肿瘤诊断提供了新的思路，也为miRNA作为肿瘤的标志物提供了依据。
miRNA
什么是MicroRNA (miRNA)?MicroRNA (miRNA) 是一类长度约为20-24nt的具有调控功能的非编码RNA。
miRNA 主要参与基因转录后水平的调控。
这些miRNA基因首先在细胞核内转录成前体转录本（primary transcripts miRNA, pri-miRNA），在核糖核酸酶Drosha的作用下剪切形成约60-70nt 的miRNA前体（或者称为pre-miRNA），然后Ran-GTP /Exportin 5将pre-miRNA转运到细胞质，随后，另一个核糖核酸酶Dicer将其剪切成约为22个核苷酸长度的miRNA :miRNA双链。
这种双链很快被引导进入RNA诱导沉默复合体（RISC）中，其中一条单链miRNA被降解，另一条成熟的单链miRNA分子，通过与靶基因的3’UTR区互补配对，对靶基因进行降解或者翻译抑制。
miRNA的特点1．细胞特异性：不同组织不同细胞miRNA的表达谱特征不同，从而可以作为某些组织或细胞的特异性分子标志。
2．“时空”特异性：细胞在不同发育阶段，miRNA组成不同，在特定细胞的特定阶段出现特定的miRNA，决定细胞的分化方向和分化时相，是细胞定时、定向分化的开关。
3．保守性：不同种属、不同组织器官以及不同细胞之间相同的miRNA分子具有相似的调控功能。
4．miRNA作用靶点：miRNA多为呈“时空”特异性表达的转录调控基因以及凋亡调控基因，通过调控细胞增殖和细胞凋亡，从而调控细胞功能和结构变化。
5．稳定性高：miRNA 在PH改变，DNA以及RNA裂解酶的作用下，不易降解，具有很高的稳定性。
miRNA 技术的应用免疫学应用（T/B 淋巴细胞）miRNA,作为生命过程中一类重要调节分子参与细胞的生长、发育、分化、凋亡等基本的生理过程,对于细胞的信号转导、组织器官的分化发育也有一定的调节作用。
在人类疾病（白血病、肿瘤、精神病及自身免疫性疾病等）中发现了特征性的异常miRNA表达,进一步说明该分子在生理病理状态下的重要作用。
miRNA_的研究策略与方法
miRNA_的研究策略与方法首先，miRNA筛选和鉴定是miRNA研究的重要步骤。
常用的筛选方法包括基于生物信息学的预测和实验验证。
生物信息学预测方法通过分析miRNA序列的保守性和结构特征，在基因组序列中寻找潜在的miRNA靶点。
实验验证的方法包括荧光原位杂交、Northern blot和实时荧光定量PCR 等。
荧光原位杂交可以用来检测miRNA的在组织和细胞中的表达位置，Northern blot可以分析miRNA的大小和表达水平，实时荧光定量PCR可以定量miRNA表达水平。
其次，miRNA功能研究是理解miRNA调控机制的关键。
常用的方法包括靶基因筛选、功能实验和信号通路调控研究等。
靶基因筛选可以通过预测和实验证实miRNA的靶基因，进而了解miRNA的调控效应。
功能实验常用的方法包括miRNA过表达和敲除实验。
miRNA过表达实验可以通过转染miRNA mimics来提高miRNA表达水平，进而研究miRNA在生物体内的功能。
miRNA敲除实验常用的方法包括化学合成抗义寡核苷酸和RNA干扰技术，可以降低miRNA的表达水平，进而研究miRNA在生物体内的功能。
信号通路调控研究可以通过分析miRNA在信号通路中的靶基因，揭示miRNA的调控机制。
最后，miRNA表达调控机制的研究是深入理解miRNA调控功能的重要途径。
常用的研究方法包括转录调控机制研究和转录后调控机制研究等。
转录调控机制研究可以分析miRNA的转录启动子和调控因子，揭示miRNA的转录调控机制。
转录后调控机制研究可以通过分析miRNA的生物合成和降解过程，了解miRNA的转录后调控机制。
总结：miRNA的研究策略和方法涵盖了miRNA筛选和鉴定、功能研究以及表达调控机制的研究等方面。
通过这些方法，可以深入了解miRNA的功能和调控机制，为进一步揭示miRNA在生命现象中的作用提供重要的研究手段。
哮喘发病机制中起调控作用的mirna研究进展
因环境污染加重ꎬ全球哮喘疾病的发生呈上升
趋势ꎬ影响约 ３. ３４ 亿人 [５] ꎮ 哮喘是一种由空气污染
物、过敏原或呼吸道病毒等因素诱发的慢性炎性气
道疾病ꎮ 哮喘的发病机制是以非特异性的支气管超
反应性增加为基础ꎬ且与异常的免疫应答有密切联
( ａｉｒｗａｙ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓꎬＡＳＭＣ) ] 是哮喘的主要
１９１４
现代中西医结合杂志 Ｍｏｄｅｒｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０２０ Ｊｕｎꎬ ２９(１７)
ｍｉＲＮＡ 的调控方式十分复杂ꎬ首先 ｍｉＲＮＡ 基因在
在 Ｄｒｏｓｈａ － Ｐａｓｈａ 复合体的作用下ꎬｐｒｉ － ｍｉＲＮＡ 被
剪切 为 具 有 发 夹 样 结 构 的 前 体 ＲＮＡ ( ｐｒｅ － ｍｉＲ￣
ＮＡ) [９] ꎻ胞核内的 ｍｉＲＮＡ 转运蛋白 ｅｘｐｏｒｔｉｎ５ 将 ｐｒｅ －
ｍｉＲＮＡ 转运至细胞质ꎬ经 Ｄｉｃｅｒ 酶剪切ꎬ生成具有识
系 [６] ꎮ 现有大量研究证实 ｍｉＲＮＡ 在哮喘的识别及
治疗中发挥了重要作用ꎮ Ｐａｎｇａｎｉｂａｎ 等 [７] 使用血浆
样本进行 ｍｉＲＮＡ 分离、定量和分析ꎬ利用血浆样本
来区分哮喘、变应性鼻炎患者和健康对照组ꎬ为诊断
该疾 病 和 选 择 疗 法 提 供 了 一 个 新 的 思 路ꎮ Ｚｈａｎｇ
ｒｅｇｉｏｎｓꎬ５’ ＵＴＲ) 以 及 其 他 非 编 码 ＲＮＡ ( ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ
ＲＮＡꎬｎｃＲＮＡ) 的超级保守序列( ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｕｌｔｒａｃｏｎ￣
miRNA_在糖尿病肾病足细胞损伤中作用及其机制的研究进展
第 49 卷第 6 期2023年 11 月吉林大学学报（医学版）Journal of Jilin University（Medicine Edition）Vol.49 No.6Nov.2023DOI：10.13481/j.1671‑587X.20230637miRNA在糖尿病肾病足细胞损伤中作用及其机制的研究进展Research progress in effect of miRNA on podocyte injury in diabetic nephropathy and its mechanism杨佳楠, 姜同连, 朱福彬, 汪婷, 周旭玲, 赵冰海, 李洪志（北华大学基础医学院吉林省肾脏病基因测序精准医疗创新中心，吉林吉林132013）［摘要］足细胞损伤在糖尿病肾病（DN）的发生发展过程中起重要作用，可导致肾小球滤过屏障功能障碍和蛋白尿的出现。
有关DN的综述报道多围绕肾脏组织纤维化、炎症反应和氧化应激等方面展开，而针对调控足细胞损伤的相关综述报道较少。
微小RNA（miRNA）作为重要的基因表达调控因子，可通过抑制或降解靶基因调控其表达。
部分miRNA表达水平变化与足细胞损伤有关联。
现结合近年来国内外相关研究进展，总结miRNA 的形成过程和生物学功能、DN足细胞损伤发生的可能机制及不同miRNA表达水平对DN足细胞损伤的影响，阐明其调控机制和作用途径，为DN的诊断、治疗和预防提供参考。
［关键词］微小RNA；糖尿病肾病；足细胞损伤；信号通路；肾小球［中图分类号］R587.2［文献标志码］A糖尿病是目前全球广泛流行的慢性病之一，已成为严重危害人类健康的全球性公共卫生问题。
糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）作为糖尿病最常见的微血管并发症，是引起终末期肾病的主要因素之一，其发病机制尚未完全阐明［1］。
既往研究［2］显示：炎症介质释放、细胞凋亡和氧化应激等可以通过破坏肾小球滤过屏障引起DN发生。
肿瘤进展的microRNA调控机制及靶向治疗策略
肿瘤进展的microRNA调控机制及靶向治疗策略一、项目简介：肿瘤是威胁人类健康的重大疾病，其持续进展是导致患者死亡的主要原因。
肿瘤的进展过程受到基因控制，而微小RNA（microRNA，miRNA）在其中的作用备受关注。
miRNA通过靶向结合特定mRNA，引起后者降解或抑制蛋白质的翻译，从而对肿瘤相关基因的表达发挥关键调控作用。
因此，鉴定肿瘤进展过程中的关键miRNA，进而揭示其调控的信号通路，对于肿瘤的靶向治疗具有重要意义。
本项目围绕肿瘤进展中的主要结点分子，阐明了miRNA在其中的作用及其构成的调控网络，为肿瘤的治疗提供了新的有效靶点。
（1）在核心癌蛋白c-Myc 介导的肿瘤进展中，我们发现c-Myc能够结合到miR-101的启动子区并募集以EZH2为核心的PRC2复合物，进而催化组蛋白发生H3K27me3的修饰，导致miR-101的表观遗传学沉默；miR-101通过负性调控下游靶基因STMN1、CXCR7和JUNB 的表达来控制细胞的增殖、转移、血管新生等过程；miR-101还能负性调控PRC2复合物中的两个组分——EZH2和EED，从而在miR-101与PRC2之间形成一个双负反馈环路，该环路的失衡是导致肝癌细胞中miR-101完全沉默以及下游信号通路出现异常的关键原因。
而在其他肿瘤中，c-Myc还受到miR-200 家族和miR-106b-93-25簇的靶向抑制。
上述主要研究结果发表在Hepatology、Endocrinology等杂志，并获杂志同期专文评述。
（2）在干细胞因子Oct4介导的肿瘤进展中，发现Oct4是miR-145的靶基因，肝癌细胞中高表达的假基因Oct4-pg4的转录产物通过与Oct4的mRNA竞争性结合miR-145，解除了后者对Oct4的靶向抑制作用，从而促进肝癌进展。
研究结果发表在Carcinogenesis 杂志。
（3）在HER2阳性进展性乳腺癌中，发现miR-200c的失调是导致肿瘤对治疗性HER2单抗Trastuzumab耐药的重要机制。
microRNA在医学中的应用
miRNA的生物信息学分析策略
1.获得microRNA的序列信息，包括成熟和前体microRNA (PremicroRNA)序列、 microRNA的基因组定位信息、 microRNA的基因分布特点，即确定目的microRNA是属于 基因间分布性，还是基因内分布性microRNA。
miRNA的分子生物学研究方法
利用分子生物学技术开展microRNA功能研究的策略
microRNA的功能分析
miRNA 的上调可用于鉴定功能获得表型；抑制或下调可以 研究功能缺失表型。上调与下调的结合可用于鉴定被特定 miRNA 调节的基因，以及特定miRNA 参与的细胞进程。 主应用包括： ◇miRNA 靶定位点的鉴定和验证 ◇筛选调节某个特定基因表达的miRNAs ◇筛选影响某个特定细胞进程的miRNAs
Sens 未知
SPL-3
功能作用 人B细胞淋巴瘤和肺癌 人粒系分化 小鼠神经发育 鸡骨骼肌发育 蒺藜苜蓿结细胞发育 调节原癌基因的表达 调节拟南芥叶缘形状的发育 影响人脂肪基质细胞成肌潜能 人肌细胞发育 调节果蝇感官发育 人肝癌发生 促进拟南芥由营养期向花期 的转换
microRNA的功能范例
miRNA的研究方法和技术
6.在数据库中每个miRNA名称前加上了物种的名称，如 has-miR-208。
7.植物中的miRNA基因用斜体表示，如MIR156。
miRNA分子的形成过程
miRNA的功能
调节内源基因表达 参与细胞周期调控
参与个体发育过程
miRN14 miR-430 miR-196 miR-181 miR-375 miR-15/16 miR-155
进一步的研究表明，microRNA分子参与了包括发育、细 胞分化、细胞凋亡、脂类代谢和激素分泌等多种生理过程， 以及包括白血病、肺癌、结肠癌、糖尿病和病毒感染等多 种病理过程。
《microRNA-128对牛骨骼肌卫星细胞增殖和成肌分化的调控机制研究》
《microRNA-128对牛骨骼肌卫星细胞增殖和成肌分化的调控机制研究》MicroRNA-128对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的调控机制研究一、引言在肌肉生长与发育的过程中，骨骼肌卫星细胞扮演着至关重要的角色。
这些细胞不仅负责肌肉的修复与再生，还参与肌肉的生长与发育。
MicroRNA（miRNA）作为一类重要的内源性非编码RNA，通过调控基因表达在多种生物学过程中发挥关键作用。
其中，microRNA-128（miR-128）在肌肉发育与功能维护中具有重要作用。
本研究旨在探讨miR-128对牛骨骼肌卫星细胞增殖和成肌分化的调控机制。
二、材料与方法1. 实验材料本实验选用健康的成年牛骨骼肌样本，从中分离并培养骨骼肌卫星细胞。
此外，还需miR-128的模拟物（mimics）和抑制剂（inhibitors）等实验试剂。
2. 实验方法（1）细胞培养与处理：分离并培养牛骨骼肌卫星细胞，通过转染技术将miR-128的mimics和inhibitors分别转入细胞中，以研究miR-128对细胞的影响。
（2）细胞增殖检测：利用细胞计数、MTT等方法检测细胞增殖情况。
（3）成肌分化诱导与鉴定：通过特定条件诱导细胞成肌分化，并利用免疫荧光等技术鉴定分化情况。
（4）基因与蛋白质表达分析：利用qPCR、Western Blot等技术分析相关基因与蛋白质的表达情况。
三、实验结果1. miR-128对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响实验结果显示，过表达miR-128能显著促进牛骨骼肌卫星细胞的增殖，而抑制miR-128的表达则会导致细胞增殖速度降低。
这一结果说明miR-128在牛骨骼肌卫星细胞的增殖过程中发挥了促进作用。
2. miR-128对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的影响通过成肌分化诱导与鉴定实验，我们发现过表达miR-128能显著提高牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化率，而抑制miR-128的表达则会导致成肌分化率降低。
这一结果说明miR-128在牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程中发挥了关键作用。
中药调控MicroRNA抗肿瘤作用的研究进展
中药调控MicroRNA抗肿瘤作用的研究进展摘要微小RNA（miRNA）是真核类生物中具有调控功能的一类非编码RNA，其长度约为22~24个核苷酸。
大量的研究证实，miRNA与恶性肿瘤密切相关，因此研究miRNA对肿瘤发生发展的分子调控机制，不仅有可能为肿瘤的的早期诊断、预后提供标志物，还有可能为临床治疗提供候选靶分子和新策略[1]。
中草药及其提取物的使用历史悠久，具有作用广泛、安全性高、毒副作用小及患者易于接受的特点，近年来采用中药调控miRNA的差异表达来抑制恶性肿瘤的发生发展已成为研究热点。
关键词：miRNA；中药；肿瘤近年来的研究发现，中药作用肿瘤细胞后可通过改变细胞内miRNA的表达水平，进一步通过miRNA在转录后水平负调控其下游靶基因的表达来发挥抗癌作用[5]。
因中药成分复杂，可同时具备多靶点调控作用，本文就中药调控miRNA发挥抗癌作用的研究作一综述。
1miRNA作用机制成熟miRNA进入RISC复合体后，可通过碱基互补配对原则与下游靶基因mRNA的3’UTR结合，抑制靶基因翻译或直接降解靶基因，从而实现转录后水平的负调节作用[6]。
2miRNA与恶性肿瘤目前的研究表明，miRNA广泛作用于肿瘤细胞的发生、发展、转移和侵袭各过程中，miRNA的异常表达既可作为原癌基因又可以是抑癌基因。
2.1 miRNA与细胞凋亡促进细胞凋亡在大多数肿瘤治疗中占有重要地位，细胞凋亡是指受基因调控的细胞程序性死亡，具体表现为活体内单个细胞或小团细胞的死亡，其死亡细胞的细胞膜和细胞器膜不破裂，不引起死亡细胞的自溶，也不引起急性炎症反应。
其调控受多种基因及蛋白共同参与作用。
miRNA可通过调节凋亡相关基因、蛋白的表达从而实现对肿瘤细胞凋亡的调控[7]。
2.2 miRNA与细胞增殖肿瘤细胞与普通细胞的显著区别就是其可表现异常增殖。
大量的研究表明，miRNA可以刺激细胞生长，活化增殖信号通路，促进细胞进入S期完成分裂增殖[8,9,10]。
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miRNA芯片
利用miRNA芯片，可以高通量分析miRNA表达的时空 特异性、不同样本(例如癌组织和癌旁组织)中miRNA 的差异表达，寻找在生物学功能上起作用的miRNA
实例：
miRNA表达检测
目前检测miRNA的技术主要有以下几种：
Northern杂交 原位杂交 微点阵（microarray） 实时定量PCR
干扰机制
miRNA简介
microRNAs（miRNAs）是一种小的内源性非编码 RNA分子，大约由21－25个核苷酸组成。
通常靶向一个或者多个mRNA，通过翻译水平的抑 制调节基因的表达。
动物的靶序列在3’非编码区（3’UTR） 植物的靶序列在编码区或5’UTR
miRNA生成
miRNA途径开始于一个miRNA基因的pri-miRNA （primary miRNA）转录本；这个70－100nt的发卡 RNAs（pri-miRNA）在核内被核糖核酸酶Drosha加 工处理而最终成为pre-miRNA（precursor miRNA）
miRNA靶基因的寻找
miRNA的靶基因的寻找主要通过利用生物信息学方 法和生物学实验方法。
生物信息学方法主要是利用某种算法对靶基因样本 进行评分及筛选。为了得到更为可靠的靶基因预测， 通常综合多个预测方法，取其共同预测的基因作为 研究重点。
常用miRNA靶标数据库
miRbase：microRNA基因注释数据库。目前只提供了 microRNA的靶标的预测软件的链接（如：PicTar）。 网 址：/index.shtml
功能缺失研究：抑制miRNA表达
miRNA inhibitor miRNA抑制剂表达克隆
过表达miRNA
将miRNA mimics转染到细胞中，能实现miRNA瞬时 过表达
构建miRNA表达载体可进行长期研究
过表达载体中有插入成熟miRNA、pre-miRNA及primiRNA序列三种形式
miRNA靶位 点验证
miRNA的筛选
深度测序
抽提分离小分子(例如18-30nt)RNA，通过RT-PCR扩增 之后，利用solexa深度测序，并进行生物信息学分析， 获得miRNA表达谱。深度测序结合生物信息学分析手 段，可以对海量数据进行分析，分别统计出已知的 miRNA(miRNA-known)、新的miRNA(miRNA-new)以及 可能的新miRNA(miRNA-cadidate new)，并对新发现的 miRNA进行靶基因分析，功能预测等。
Tarbase：一个收集已被实验验证的microRNA靶标数据 库。网址：http://microrna.gr/tarbase/
targetScan: 基于靶mRNA序列的进化保守等特征搜寻动 物的microRNA靶基因。是预测microRNA靶标假阳性率 较低的软件。网址：/
例如：
2.在特殊情况下，例如当miRNA分子中GC含量偏高 时，可在miRNA序列3’端减少3~4个碱基，从而降低 引物的Tm值；相反，如果miRNA分子中GC含量偏 低时，可在miRNA序列5’端添加几个GC碱基，从而 提高引物的Tm值。例如：
*1 OLIGO: Primer Analysis Software。 *2 Primer3: （/ftp/distribution/software/）
*3 /BLAST/
实例：
miRNA功能研究
用特定试剂改变内源miRNAs的水平，观察靶mRNA 及编码蛋白的表达，进行信号通路研究
功能获得研究：把miRNA导入细胞
miRNA mimics：化学方法合成的miRNA模拟物 miRNA 表达克隆
载体选择有三种：慢病毒，腺病毒，质粒
抑制miRNA
miRNA 抑制剂克隆导入细胞后表达的miRNA抑制剂 (miArrest)特异地结合它们的靶miRNA，形成稳定的 复合物，阻止了miRNA对靶标mRNA的降解或者翻 译抑制，上调miRNA靶标基因的表达
化学合成的miRNA抑制剂是序列特定的、单链寡核 苷酸分子，适合瞬时转染
PicTar：基于microRNA或microRNA靶标联合作用等特征 开发的搜寻动物的microRNA靶基因的软件，假阳性率 也较低。网址：http://pictar.mdc-berlin.de/
实例：
miRNA靶基因的鉴定
利用荧光定量PCR及Western blot方法分别检测转染 或敲除miRNA后细胞中mRNA水平及蛋白水平的变 化, 从而确定miRNA与靶基因的对应关系。
miRNA研究策略及技术
RNA干扰
RNA干扰（RNA interference，RNAi）是指一种由双 链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特 定基因的翻译或转录来抑制基因表达。
microRNAs (miRNAs)：mRNA翻译被抑制 short interfering RNAs (siRNAs) ：引起mRNA切割
Northern杂交
实例：
原位杂交
实例：
实时定量RT PCR
Loop反转录法
每次RT只能检测一个miRNA 特异性高 多个样本中检测同一miRNA
polyA加尾法
一次RT可检测所有miRNA 通用性高 适合miRNA高通量检测
引物设计
1.通常情况下，Forward Primer序列与待测miRNA序 列基本一致，只要将原有的U替换成T即可。
miRNA靶位点的鉴定
荧光素酶报告基因法
pre-miRNA被核输出蛋白exportin 5转运入胞质，接 着被第二个核糖核酸酶Dicer消化为21－25nt的 miRNA；这个阶段的miRNA可以结合RISC（RNAInduced Silencing Complex）并与靶标mRNA互补
图例
miRNA研究流程
筛选miRNA
寻找miRNA 靶位点