miRNA研究策略及技术
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miRNA研究策略及技术
RNA干扰
RNA干扰（RNA interference，RNAi）是指一种由双 链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特 定基因的翻译或转录来抑制基因表达。
microRNAs (miRNAs)：mRNA翻译被抑制 short interfering RNAs (siRNAs) ：引起mRNA切割
载体选择有三种：慢病毒，腺病毒，质粒
抑制miRNA
miRNA 抑制剂克隆导入细胞后表达的miRNA抑制剂 (miArrest)特异地结合它们的靶miRNA，形成稳定的 复合物，阻止了miRNA对靶标mRNA的降解或者翻 译抑制，上调miRNA靶标基因的表达
化学合成的miRNA抑制剂是序列特定的、单链寡核 苷酸分子，适合瞬时转染
PicTar：基于microRNA或microRNA靶标联合作用等特征 开发的搜寻动物的microRNA靶基因的软件，假阳性率 也较低。网址：http://pictar.mdc-berlin.de/
实例：
miRNA靶基因的鉴定
利用荧光定量PCR及Western blot方法分别检测转染 或敲除miRNA后细胞中mRNA水平及蛋白水平的变 化, 从而确定miRNA与靶基因的对应关系。
miRNA靶基因的寻找
miRNA的靶基因的寻找主要通过利用生物信息学方 法和生物学实验方法。
生物信息学方法主要是利用某种算法对靶基因样本 进行评分及筛选。为了得到更为可靠的靶基因预测， 通常综合多个预测方法，取其共同预测的基因作为 研究重点。
常用miRNA靶标数据库
miRbase：microRNA基因注释数据库。目前只提供了 microRNA的靶标的预测软件的链接（如：PicTar）。 网 址：http://mirbase.org/index.shtml
干扰机制
miRNA简介
microRNAs（miRNAs）是一种小的内源性非编码 RNA分子，大约由21－25个核苷酸组成。
通常靶向一个或者多个mRNA，通过翻译水平的抑 制调节基因的表达。
动物的靶序列在3’非编码区（3’UTR） 植物的靶序列在编码区或5’UTR
miRNA生成
miRNA途径开始于一个miRNA基因的pri-miRNA （primary miRNA）转录本；这个70－100nt的发卡 RNAs（pri-miRNA）在核内被核糖核酸酶Drosha加 工处理而最终成为pre-miRNA（precursor miRNA）
例如：
2.在特殊情况下，例如当miRNA分子中GC含量偏高 时，可在miRNA序列3’端减少3~4个碱基，从而降低 引物的Tm值；相反，如果miRNA分子中GC含量偏 低时，可在miRNA序列5’端添加几个GC碱基，从而 提高引物的Tm值。例如：
*1 OLIGO: Primer Analysis Software。 *2 Primer3: （http://www-genome.wi.mit.edu/ftp/distribution/software/）
pre-miRNA被核输出蛋白exportin 5转运入胞质，接 着被第二个核糖核酸酶Dicer消化为21－25nt的 miRNA；这个阶段的miRNA可以结合RISC（RNAInduced Silencing Complex）并与靶标mRNA互补
图例
miRNA研究流程
筛选miRNA
寻找miRNA 靶位点
miRNA芯片
利用miRNA芯片，可以高通量分析miRNA表达的时空 特异性、不同样本(例如癌组织和癌旁组织)中miRNA 的差异表达，寻找在生物学功能上起作用的miRNA
实例：
miRNA表达检测
目前检测miRNA的技术主要有以下几种：
Northern杂交 原位杂交 微点阵（microarray） 实时定量PCR
Baidu Nhomakorabea
miRNA靶位点的鉴定
荧光素酶报告基因法
miRNA靶位 点验证
miRNA的筛选
深度测序
抽提分离小分子(例如18-30nt)RNA，通过RT-PCR扩增 之后，利用solexa深度测序，并进行生物信息学分析， 获得miRNA表达谱。深度测序结合生物信息学分析手 段，可以对海量数据进行分析，分别统计出已知的 miRNA(miRNA-known)、新的miRNA(miRNA-new)以及 可能的新miRNA(miRNA-cadidate new)，并对新发现的 miRNA进行靶基因分析，功能预测等。
Northern杂交
实例：
原位杂交
实例：
实时定量RT PCR
Loop反转录法
每次RT只能检测一个miRNA 特异性高 多个样本中检测同一miRNA
polyA加尾法
一次RT可检测所有miRNA 通用性高 适合miRNA高通量检测
引物设计
1.通常情况下，Forward Primer序列与待测miRNA序 列基本一致，只要将原有的U替换成T即可。
功能缺失研究：抑制miRNA表达
miRNA inhibitor miRNA抑制剂表达克隆
过表达miRNA
将miRNA mimics转染到细胞中，能实现miRNA瞬时 过表达
构建miRNA表达载体可进行长期研究
过表达载体中有插入成熟miRNA、pre-miRNA及primiRNA序列三种形式
*3 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
实例：
miRNA功能研究
用特定试剂改变内源miRNAs的水平，观察靶mRNA 及编码蛋白的表达，进行信号通路研究
功能获得研究：把miRNA导入细胞
miRNA mimics：化学方法合成的miRNA模拟物 miRNA 表达克隆
Tarbase：一个收集已被实验验证的microRNA靶标数据 库。网址：http://microrna.gr/tarbase/
targetScan: 基于靶mRNA序列的进化保守等特征搜寻动 物的microRNA靶基因。是预测microRNA靶标假阳性率 较低的软件。网址：http://www.targetscan.org/
RNA干扰
RNA干扰（RNA interference，RNAi）是指一种由双 链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特 定基因的翻译或转录来抑制基因表达。
microRNAs (miRNAs)：mRNA翻译被抑制 short interfering RNAs (siRNAs) ：引起mRNA切割
载体选择有三种：慢病毒，腺病毒，质粒
抑制miRNA
miRNA 抑制剂克隆导入细胞后表达的miRNA抑制剂 (miArrest)特异地结合它们的靶miRNA，形成稳定的 复合物，阻止了miRNA对靶标mRNA的降解或者翻 译抑制，上调miRNA靶标基因的表达
化学合成的miRNA抑制剂是序列特定的、单链寡核 苷酸分子，适合瞬时转染
PicTar：基于microRNA或microRNA靶标联合作用等特征 开发的搜寻动物的microRNA靶基因的软件，假阳性率 也较低。网址：http://pictar.mdc-berlin.de/
实例：
miRNA靶基因的鉴定
利用荧光定量PCR及Western blot方法分别检测转染 或敲除miRNA后细胞中mRNA水平及蛋白水平的变 化, 从而确定miRNA与靶基因的对应关系。
miRNA靶基因的寻找
miRNA的靶基因的寻找主要通过利用生物信息学方 法和生物学实验方法。
生物信息学方法主要是利用某种算法对靶基因样本 进行评分及筛选。为了得到更为可靠的靶基因预测， 通常综合多个预测方法，取其共同预测的基因作为 研究重点。
常用miRNA靶标数据库
miRbase：microRNA基因注释数据库。目前只提供了 microRNA的靶标的预测软件的链接（如：PicTar）。 网 址：http://mirbase.org/index.shtml
干扰机制
miRNA简介
microRNAs（miRNAs）是一种小的内源性非编码 RNA分子，大约由21－25个核苷酸组成。
通常靶向一个或者多个mRNA，通过翻译水平的抑 制调节基因的表达。
动物的靶序列在3’非编码区（3’UTR） 植物的靶序列在编码区或5’UTR
miRNA生成
miRNA途径开始于一个miRNA基因的pri-miRNA （primary miRNA）转录本；这个70－100nt的发卡 RNAs（pri-miRNA）在核内被核糖核酸酶Drosha加 工处理而最终成为pre-miRNA（precursor miRNA）
例如：
2.在特殊情况下，例如当miRNA分子中GC含量偏高 时，可在miRNA序列3’端减少3~4个碱基，从而降低 引物的Tm值；相反，如果miRNA分子中GC含量偏 低时，可在miRNA序列5’端添加几个GC碱基，从而 提高引物的Tm值。例如：
*1 OLIGO: Primer Analysis Software。 *2 Primer3: （http://www-genome.wi.mit.edu/ftp/distribution/software/）
pre-miRNA被核输出蛋白exportin 5转运入胞质，接 着被第二个核糖核酸酶Dicer消化为21－25nt的 miRNA；这个阶段的miRNA可以结合RISC（RNAInduced Silencing Complex）并与靶标mRNA互补
图例
miRNA研究流程
筛选miRNA
寻找miRNA 靶位点
miRNA芯片
利用miRNA芯片，可以高通量分析miRNA表达的时空 特异性、不同样本(例如癌组织和癌旁组织)中miRNA 的差异表达，寻找在生物学功能上起作用的miRNA
实例：
miRNA表达检测
目前检测miRNA的技术主要有以下几种：
Northern杂交 原位杂交 微点阵（microarray） 实时定量PCR
Baidu Nhomakorabea
miRNA靶位点的鉴定
荧光素酶报告基因法
miRNA靶位 点验证
miRNA的筛选
深度测序
抽提分离小分子(例如18-30nt)RNA，通过RT-PCR扩增 之后，利用solexa深度测序，并进行生物信息学分析， 获得miRNA表达谱。深度测序结合生物信息学分析手 段，可以对海量数据进行分析，分别统计出已知的 miRNA(miRNA-known)、新的miRNA(miRNA-new)以及 可能的新miRNA(miRNA-cadidate new)，并对新发现的 miRNA进行靶基因分析，功能预测等。
Northern杂交
实例：
原位杂交
实例：
实时定量RT PCR
Loop反转录法
每次RT只能检测一个miRNA 特异性高 多个样本中检测同一miRNA
polyA加尾法
一次RT可检测所有miRNA 通用性高 适合miRNA高通量检测
引物设计
1.通常情况下，Forward Primer序列与待测miRNA序 列基本一致，只要将原有的U替换成T即可。
功能缺失研究：抑制miRNA表达
miRNA inhibitor miRNA抑制剂表达克隆
过表达miRNA
将miRNA mimics转染到细胞中，能实现miRNA瞬时 过表达
构建miRNA表达载体可进行长期研究
过表达载体中有插入成熟miRNA、pre-miRNA及primiRNA序列三种形式
*3 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
实例：
miRNA功能研究
用特定试剂改变内源miRNAs的水平，观察靶mRNA 及编码蛋白的表达，进行信号通路研究
功能获得研究：把miRNA导入细胞
miRNA mimics：化学方法合成的miRNA模拟物 miRNA 表达克隆
Tarbase：一个收集已被实验验证的microRNA靶标数据 库。网址：http://microrna.gr/tarbase/
targetScan: 基于靶mRNA序列的进化保守等特征搜寻动 物的microRNA靶基因。是预测microRNA靶标假阳性率 较低的软件。网址：http://www.targetscan.org/