生物工程专业《发酵工程与设备》知识点总结

第1章绪论
1、什么是发酵：（工业微生物学家对发酵的定义）通过微生物的生长繁殖和代谢活动，产生和积累人们所需产品（微生物菌体或其代谢产物）的生物反应过程，包括无氧过程和有氧过程，同时涉及分解代谢和合成代谢。

2、发酵工程：指利用微生物的生长繁殖和代谢活动来大量生产人们所需产品过程的理论和技术体系，是生物工程与生物技术学科的重要组成部分，主要包括菌种选育和保藏，菌种的扩大培养，微生物代谢产物的发酵生产和分离纯化等。

3、上游生物技术：基因工程和细胞工程主要是从源头上改良生物遗传特性以获得具有优良生物加工和生物转化能力的生物新品种（或品系），通常称为上游生物技术。

4、发酵工程可使生物的优良遗传性状通过微生物大量繁殖得到高效表达，生产所需的产物，包括菌体和代谢产物（如酶制剂、有机酸、氨基酸，抗生素等等）；生化工程则作为实验室所取得的生物技术成果进行产业化的技术支撑，主要内容涉及生物反应及分离纯化过程的放大技术及其设备。

因此，发酵工程和生化工程通常合称为中下游生物技术，是现代生物技术试验成果产业化的关键技术，发酵工程更具有连接生物技术上、下游得纽带作用，成为生物技术中的关键环节，其学科地位显而易见。

5、初级代谢产物：一般将微生物与外界吸收各种营养物质，通过分解代谢和合成代谢，生成维持生命活动的物质和能量的过程，称为初级代谢，这一过程的产物为初级代谢产物。

如：糖类物质，氨基酸，脂肪酸，核苷酸等。

6、次级代谢产物：一般认为，次级代谢是指微生物在一定的生长时期，以初级代谢产物为前体，合成一些对微生物的生命活动无明确功能的物质的过程。

这一过程的产物，即为次级代谢产物。

如：抗生素、毒素，激素和色素等。

7、发酵的本质
发酵的本质就是由微生物的生命活动所产生的酶的生物催化作用所致。

8、发酵工程发展史的六个阶段：
（1）自然发酵阶段：
特点：家庭式或者作坊式的手工生产；这一阶段的多数产品（如酒精、醋、酸乳、啤酒等）属于厌氧发酵，且非纯种培养；凭经验传授技术，产品质量不稳定。

（2）纯培养发酵阶段（“一战” 处于这一时期）
特点：生产过程简单，生产规模不大，对发酵设备要求不高，发酵产品的结构比原料简单，属于初级代谢产物。

产品有：甘油，酒精，丙酮，丁醇等厌氧发酵产品和柠檬酸、淀粉酶等好氧发酵产品。

（3）深层通气发酵阶段（“二战” 处于这一时期）
特点：发酵产品的生产不再是单一的分解代谢产物，而是合成代谢产物，如抗生素、有机酸、激素等产品；真正无杂菌发酵的机械搅拌液体深层发酵罐诞生。

产品：抗生素类产品，各种有机酸，酶制剂，维生素、激素等。

（4）代谢控制发酵
特点：发酵罐体积可达500-2000m3；发酵产品从初级代谢产物到次级代谢产物，发展了气升式发酵罐（可降低能耗，提高供氧）
（5）全面发展阶段
特点：原料的来源更广泛，可以利用化工原料（碳氢化合物）生产单细胞蛋白；发酵生产向大型化、多样化、自动化和连续化方向发展。

（6）基因工程阶段
特点：各种新品种，新产品出现。

9、发酵工业的特点P5（了解）
10、简述液体发酵生产的一般工艺流程（P8）重点掌握
第2章发酵工业菌种
1、细菌、放线菌、酵母菌、霉菌的主要繁殖方式、主要分布区域、常用的菌种分别有哪些？常用于哪些产品的生产。

（见—作业中自己总结的那个表格）
具体来说，一般设计适宜于工业大规模发酵的培养基应遵循以下原则：（1）营养成分充足：必须提供合成M细胞和发酵产物的基本成分；（2）基质转化率高：有利于减少培养基原料的单耗，即提高单位营养物质的转化率；（3）产物浓度高：有利于提高产物浓度，以提高单位容积发酵罐的生产能力；（4）产物合成快：有利于提高产物的合成速率，缩短发酵周期；（5）副产物少：尽量减少副产物的生成，便于产物的分离和纯化；（6）原料来源和成本：原料物美价廉，质量稳定、取材容易。

（7）利于发酵进程：所用原料尽可能减少对发酵过程中通气搅拌的影响，利于提高氧的利用率，降低能耗；（8）利于产品的分离纯化，并尽量减少“三废”物质的生成。

3、培养基的成分、来源及其功能：
（1）碳源：其功能一是提供M菌体生长繁殖所需的能源以及合成菌体所需的碳骨架；二是提供菌体合成目的产物的原料。

常用碳源有：糖类（如葡萄糖，甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜、玉米淀粉、小麦淀粉、甘薯淀粉等）、油和脂肪（如豆油、菜籽油、猪油、鱼油、棉籽油等）、有机酸（如乳酸、柠檬酸、乙酸等）、烃和醇类（如正烷烃、乙醇等）等。

（2）氮源：主要用于构成菌体细胞物质和合成含氮代谢物。

常见氮源：有机氮源（如黄豆饼粉、棉籽饼粉、玉米浆<玉米淀粉生产中的副产物>、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、废菌丝体、尿素等）和无机氮源（如铵盐、硝酸盐和氨水等）。

生理酸性物质：经过微生物生理代谢作用后，能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质，如硫酸铵；生理碱性物质：：经过微生物生理代谢作用后，能形成碱性物质的无机氮源叫生理碱性物质，如硝酸钠等。

（3）无机盐及微量元素：低浓度时对微生物生长和产物合成有促进作用，高浓度时常变现出明显的抑制作用。

如磷（核酸和蛋白质的必要成分，也是ATP组成成分）、镁（是己糖磷酸化酶、柠檬酸脱氢酶、羧化酶等重要酶的激活剂，又能影响基质氧化和蛋白质合成）、硫（在细胞蛋白质中，是半胱氨酸和甲硫氨酸等含硫氨基酸的组成成分；是辅酶A、硫锌酸、谷胱甘肽等辅酶的活性基）、钾（与细胞渗透压和透性有关、某些酶的激活剂）、钠（维持细胞渗透压等）、钙（主要控制细胞的透性，CaCO3用于pH 调节）、铁（是细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化氢酶的成分）、氯（某些嗜盐菌的营养物、金霉素、灰黄霉素等含氯代谢物的营养源）、锰、锌、钴（锰、锌、钴主要作为酶的辅基和激活剂）等。

（4）水：1作为代谢物质参与代谢；2是代谢反应的内部介质；3因比热容较高、热的良好导体，故水是热的吸收体，有利于散热、调节细胞和生化反应的环境温度等等，由此可见，水的功能是多方面的，水为微生物生长繁殖和合成目的产物提供了必须的生理环境。

发酵生产中，水源质量非常重要，考察水源质量的参数主要有：pH、溶解氧、可溶性固体、污染程度、矿物质组成和含量。

如：在抗生素发酵工业中，水质的好坏是决定一个优良生产菌种在异地能否发挥其生产能力的重要因素；在啤酒酿造工业中，水质是获得优质啤酒的关键因素之一。

（5）生长调节物质：主要有生长因子（生长因子是指凡是微生物生命活动不可缺少，而微生物自身又不能合成的微量有机物质，例如必须氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素、生物素<又称维生素H、辅酶R，是水溶性维生素，它是合成维生素C的必要物质，是脂肪和蛋白质正常代谢不可或缺的物质>）、前体（前体是指加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成的过程中结合到产物分子中去，其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因其加入而有较大提高的一类化合物；例如在青霉素生产中，加入前体物质苯乙酸可增加青霉素G的产量，而用苯氧乙酸作为前体可增加青霉素V的产量）和产物合成促进剂（是指那些细胞生长非必须的，但是加入后却能显著提高发酵产量的一些物质）。

4、微生物培养基类型主要有：斜面培养基、种子培养基和发酵培养基。

为了缩短发酵阶段的延滞期，种子培养基成分应该与发酵培养基的主要成分相近或一致，使微生物菌种在种子培养过程中已经合成有关的诱导酶系，接入发酵罐发酵时就能较快适应发酵培养条件，缩短发酵周期。

5、发酵工业培养基的设计原理：要确定一个适合的工业规模生产的发酵培养基，首先，必须做好调查研究工作，了解菌种的来源，生长规律，生理生化特性和一般营养要求；其次，对生产菌种的培养条件，生物合成的代谢途径，代谢产物的化学性质、分子结构，提取分离方法和产品质量要求等要需要有所了解，以便在选择培养基时做到心中有数。

最好先以一种较好的化学合成培养基为基础，先做一些摇瓶试验，然后进一步做小型发酵罐培养试验，摸索菌种对各种主要营养物质，如碳源、氮源的利用情况和产生代谢产物的能力。

注意培养过程中pH
变化，观察适合于菌种生长繁殖和适合于代谢产物形成的两种不同的pH，不断调整培养基成分的配比来适应上述情况和要求。

当有了初步试验结果之后，先确定培养基配比，再确定各种重要的金属和非金属离子对发酵的影响（即微生物对各种无机元素的要求），试验其最适范围和最佳用量。

在合成培养基的基础上得出一定结果后，再做复合培养基试验，最后通过试验确定各种发酵条件和培养基的关系。

有些发酵产物如抗生素等，除了配制培养基以外，发酵过程中还要进行中间补料，一方面对碳源和氮源的代谢予以适当的控制，另一方面间歇添加各种养料和前体物质，促进发酵目的产物的积累。

6、发酵工业培养基的优化方法：一般来说，选择培养基成分、设计培养基配方会依据培养基设计原理，但最终培养基配方的确定还是通过试验来确定。

一般要经过以下几个步骤：
（1）查资料，根据以前的经验以及在培养基成分确定时必须考虑的一些问题（比如），初步确定；（2）通过单因子优化试验，确定最为适宜的各个培养基组分及其最适浓度
（3）最后，通过多因子试验，进一步优化培养基的各种成分及其最适浓度。

第4章发酵工业的无菌技术
一、发酵工业中允许的染菌概率是10-3，即灭菌1000批次的发酵中，只允许有1次染菌。

二、常用的无菌技术和方法：
（一）干热灭菌法：一般是160～170℃下保温1～2h，多用于实验器具和耐高温材料的灭菌；（二）湿热灭菌法：灭菌机理是使微生物细胞中蛋白质、酶和核酸分子内部的化学键，特别是氢键收到破坏，引起不可逆的变性，造成微生物的死亡。

常用的高压蒸汽灭菌是实验室、发酵工业中最常用的湿热灭菌方法，其灭菌条件是：121℃下维持30min；常用于培养基、玻璃仪器、无菌水、缓冲液等的灭菌。

（三）射线灭菌法：最常用的是紫外线灭菌，其杀菌作用主要是紫外线导致DNA胸腺嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体和胞嘧啶水合物，抑制DNA正常复制。

此外，空气中的氧气在紫外线作用下产生臭氧O3有一定杀菌作用。

适用于物体表面、超净台以及培养室等环境灭菌。

（四）化学药剂灭菌法：常用的有：甲醛、漂白粉（或次氯酸钠）、高锰酸钾、环氧乙烷、双氧水、季铵盐（如新洁尔灭）等，一般用于发酵工厂环境的消毒。

（五）过滤除菌法：工业中主要是制备无菌空气，供好氧微生物的液体深层发酵使用。

（六）火焰灭菌法：适用于金属小用具，如接种针、接种环、镊子等耐高温灼烧器具的灭菌。

湿热灭菌的对数残留定律：在一定温度下，微生物受热致死遵循分子反应速率理论，微生物受热死亡的速率-dN/dt与任一瞬间残留的活菌数N成正比。

数学表达式为
-dN/dt=kN
其中：k为比死亡速率常数，单位：s-1，其大小于微生物的种类和灭菌温度有关。

复习要求：1、积分后，得到公式（4-2）、（4-3）见课本P66，会用公式进行简单计算；
2、看懂图4-5 大肠杆菌在不同温度下的残留曲线——存活率N t/N0与灭菌时间t的关系图：由图4-5能够判断出四条曲线对应得灭菌温度和k值的大小顺序。

（七）影响培养基灭菌的主要因素有：所污染杂菌的种类和数量、灭菌温度、灭菌时间、培养基成分和物理状态、培养基pH等。

三、分批灭菌：又称实罐灭菌，是将配制好的培养基放入到发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起进行灭菌的操作过程。

是中、小型发酵罐常用的一种灭菌方法。

四、连续灭菌；将配制好的培养基向发酵罐等培养装置输送的同时进行加热、保温和冷却等灭菌操作过程。

连续灭菌的流程有：喷淋冷却连续灭菌流程、喷射加热连续灭菌流程、薄板式换热器连续灭菌流程；喷淋冷却连续灭菌流程(P71)：主要由配料罐（或调浆罐）、连消塔、维持罐和冷却罐（或喷淋冷却器）组成；此工艺的主要缺点是：不能保证培养液先进先出，容易出现培养液过热和灭菌不彻底的现象。

为了解决这个缺点，可采用喷射加热连续灭菌流程；薄板式换热器连续灭菌流程的一大特点是：能量利用比较合理、是较为节能的流程。

五、空气除菌：常用方法有辐射杀菌、加热杀菌、静电除菌、过滤除菌。

其中过滤除菌是发酵工业中最常用、最经济的空气除菌方法。

复习要求：1、空气过滤除菌的一般流程（两级冷却析水—加热过滤除菌流程，也是一种经典的空气除菌流程）和相应的设备（课本P72，结合图4-11）；2、常用的过滤介质有棉花、活性炭、玻璃纤维、
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残留定律P65；连续灭菌；比生长速率（某一时刻，菌体生长速率与培养基中菌体浓度之比，即单位质量菌体的瞬时增量）；最适温度P124；菌种退化P39；呼吸强度P101；空气绝对湿度；空气的相对湿度；生长因子P47；接种龄P80；生物转化；次级代谢产物；非生长相关型；搅拌热P122；二阶段发酵；底物的比消耗速率P89；
思考题：1.发酵生产中，如果在菌种扩大培养期、发酵前期、发酵中期和发酵后期四个阶段中染杂菌，结合不同时期，提出具体处理措施。

2.在谷氨酸棒状杆菌发酵生产谷氨酸的过程中，为了防止噬菌体污染，请提出具体预防措施。

3.简述空气过滤除菌的工艺流程及每个环节所使用的处理设备。

4.优良发酵工业种子应该具备的条件5、简述发酵过程控制中，pH的调控方法（P126）；6、发酵过程中产生的大量泡沫会引起“逃液”，其危害有哪些？8、通用式发酵罐中搅拌的目的和作用是什么P145？7、发酵罐设计的基本原则？在设计中重点考虑的因素？发酵罐设计主要解决的问题是什么？8、影响溶解氧的因素有哪些？提高溶解氧的方法有哪些（P128-129自己总结一下）？。