常用限制性内切酶的识别序列和同裂酶

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名词解释

名词解释同裂酶:识别相同序列的限制性内切酶称为～。

它们的切割位点可能不同同尾酶（Isocaudarner）:不同的限制性内切酶切割DNA产生的末端是相同的，切是对称的，即相同的粘性末端星星活性：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称为～（star activity)。

klenow片段：大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，经枯草杆菌蛋白酶处理后，分割成两个片段，其中大片段称为～。

具有5′-3′聚合酶和3′-5′外切酶活性核酸外切酶：核酸外切酶（exonucleases）是一类从多核苷酸链的一头开始按顺序降解核苷酸的酶。

质粒的不亲和性：也称不相容性，是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定共存的现象。

α-互补：LacZ′基因编码的α-肽链是β-半乳糖苷酶的氨基末端的短片段，它同失去了正常氨基末端的β-半乳糖苷酶突变体互补时，便会产生有功能活性的β-半乳糖苷酶分子。

于是便可以应用X-gal和IPTG显色技术检测转化子。

重组子为白斑，非重组子为蓝斑。

穿梭质粒载体（shuttle plasmid vector）:是一类有人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，因而可在两种不同的寄主细胞中存活的质粒载体穿梭质粒载体（shuttle plasmid vector）:是一类有人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，因而可在两种不同的寄主细胞中存活的质粒载体基因文库：来自于某种生物的不同DNA序列的集合基因组文库：用于构建文库的DNA来源于基因组DNAcDNA文库：用于构建文库的DNA是mRNA群体的拷贝（cDNA）基因治疗：A.对有基因缺陷的细胞进行修复，从而使其恢复正常，达到治疗疾病的目的B.把健康的外源基因导入到有基因缺陷的细胞中，达到治疗疾病的目的C.运用人工诱变的方法，使有基因缺陷的细胞发生基因突变恢复正常D.运用基因工程技术，把有缺陷的基因切除，达到治疗疾病的目的低拷贝数的质粒：每个寄主细胞中仅有1-3份拷贝，这类质粒为严谨型复制控制的质粒（stringent plasmid）高拷贝数的质粒：每个寄主细胞中可高达10-60份拷贝，这类质粒为松弛型复制控制的质粒（relaxed plasmid）回文结构：DNA局部双螺旋以某一对称轴旋转180度后，与另一侧的互补片段的顺序完全的DNA结构粘性末端（cohesive end）识别位点为回文对称结构的序列经限制性内切酶切割后，产生的末端为粘性末端，形成的两个末端是相同的，也是互补的同序同切酶: 识别序列和切割位置都相同同序异切酶（Isoschizomer) 识别序列相同，但切割位点不同. 结合型质粒（conjugative plasmid），又叫自我转移质粒，除了具有自主复制所必需的遗传信息之外，还带有一套控制细菌配对和质粒结合转移的基因非结合型质粒（non-conjugative plasmid），又称非自我转移的质粒，具有自主复制的遗传信息，但失去了控制细胞配对和结合转移的基因，因此，不能从一个细胞自我转移到另一个细胞质粒的迁移（mobilization），由共存的结合型质粒引发的非结合型质粒的转移过程，叫做质粒的迁移作用。

常见限制性内切酶识别序列

常见限制性‎内切酶识别‎序列(酶切位点)（BamHI‎、EcoRI‎、HindI‎I I、NdeI、XhoI等‎）Time：2009-10-22 PM 15:38Autho‎r:bioer‎Hits: 7681 times‎在分子克隆‎实验中，限制性内切‎酶是必不可‎少的工具酶‎。

无论是构建‎克隆载体还‎是表达载体‎，要根据载体‎选择合适的‎内切酶（当然，使用T 载就‎不必考虑了‎）。

先将引物设‎计好，然后添加酶‎切识别序列‎到引物5' 端。

常用的内切‎酶比如Ba‎m HI、EcoRI‎、HindI‎I I、NdeI、XhoI等‎可能你都已‎经记住了它‎们的识别序‎列，不过为了保‎险起见，还是得查证‎一下。

下面是一些‎常用的II‎型内切酶的‎识别序列，仅供参考。

先介绍一下‎什么是II‎型内切酶吧‎。

The Type II restr‎i ctio‎n syste‎m s typic‎a lly conta‎i n indiv‎i dual‎restr‎i ctio‎n enzym‎e s and modif‎i cati‎o n enzym‎e s encod‎e d by separ‎a te genes‎. The Type II restr‎i ctio‎n enzym‎e s typic‎a lly recog‎n ize speci‎f ic DNA seque‎n ces and cleav‎e at const‎a nt posit‎i ons at or close‎to that seque‎n ce to produ‎c e 5-phosp‎h ates‎and 3-hydro‎x yls. Usual‎l y they requi‎r e Mg 2+ ions as a cofac‎t or, altho‎u gh some have more exoti‎c requi‎r emen‎t s. The methy‎l tran‎s fera‎s es usual‎l y recog‎n ize the same seque‎n ce altho‎u gh some are more promi‎s cuou‎s. Three‎types‎of DNA methy‎l tran‎s fera‎s es have been found‎as part of Type II R-M syste‎m s formi‎n g eithe‎r C5-methy‎l cyto‎s ine, N4-methy‎l cyto‎s ine or N6-methy‎l aden‎i ne.酶类型识别序列ApaIType II restr‎i ctio‎nenzym‎e5'GGGCC‎^C 3'BamHI‎Type II restr‎i ctio‎nenzym‎e5' G^GATCC‎3'BglII‎Type II restr‎i ctio‎nenzym‎e5' A^GATCT‎3'EcoRI‎Type II restr‎i ctio‎nenzym‎e5' G^AATTC‎3'HindI‎I IType II restr‎i ctio‎nenzym‎e5' A^AGCTT‎3'KpnIType II restr‎i ctio‎nenzym‎e5' GGTAC‎^C 3'NcoIType II restr‎i ctio‎nenzym‎e5' C^CATGG‎3' NdeIType II restr‎i ctio‎nenzym‎e5' CA^TATG 3'NheIType II restr‎i ctio‎nenzym‎e5' G^CTAGC‎3'NotIType II restr‎i ctio‎nenzym‎e5' GC^GGCCG‎C 3'SacIType II restr‎i ctio‎nenzym‎e5' GAGCT‎^C 3'SalIType II restr‎i ctio‎nenzym‎e5' G^TCGAC‎3' SphIType II restr‎i ctio‎nenzym‎e5' GCATG‎^C 3'XbaIType II restr‎i ctio‎nenzym‎e5' T^CTAGA‎3'XhoIType II restr‎i ctio‎nenzym‎e5' C^TCGAG‎3'要查找更多‎内切酶的识‎别序列，你还可以选‎择下面几种‎方法：1. 查你所使用‎的内切酶的‎公司的目录‎或者网站；2. 用软件如：Prime‎r Premi‎e r5.0或Bio‎e dit等‎，这些软件均‎提供了内切‎酶识别序列‎的信息；3. 推荐到NE‎B的REB‎A SE数据‎库去查（网址：http://rebas‎/rebas‎e/rebas‎e.html）当你设计好‎引物，添加上了内‎切酶识别序列‎，下一步或许‎是添加保护‎碱基了，可以参考：NEB公司‎网站提供的‎关于设计P‎C R引物保‎护碱基参考‎表下载（也可见图片‎）双酶切bu‎f fer的‎选择（MBI、罗氏、NEB、Prom e‎g a、Takar‎a）再给大家推‎荐一种新的‎不需要连接‎反应的分子‎克隆方法，优点包括：①设计引物不‎必考虑选择‎什么酶切位点；②不必考虑保‎护碱基的问‎题；③不必每次都‎选择合适的‎酶来酶切质‎粒制备载体‎；④而且不需要‎D NA连接‎酶；⑤假阳性几率‎低（因为没有连‎接反应这一‎步，载体自连的‎问题没有了‎）。

限制性内切酶

限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（一般4-8bp），并在此处切割DNA双链的核酸内切酶。

主要存在于原核生物，是原核生物自我保护的一种机制。

它的作用包含两类,一种是对外的,限制作用,指一定类型的细菌可以通过限制性核酸内切酶的作用,破坏入侵的外源DNA,使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制。

另一种是对内的，修饰作用，指在特定位置发生甲基化，可免遭自身限制性酶的破坏。

限制性核酸内切酶的发现是在本世纪中期，Arber等人对λ噬菌体在大肠杆菌不同菌株上的平板培养效应的研究为基础，发现了原核生物体内存在着寄主控制的限制和修饰系统。

实验是：在K株或B株大肠杆菌上生长繁殖的噬菌体λ（K）或λ（B），再次感染原寄主菌体的成斑率为1，而感染新的寄主菌株的成斑率则分别为10-4和4*10-4所以说受到了限制。

在 20 世纪 60 年代，噬菌体学家阐明了宿主限制和修饰现象的生化机制。

该研究工作在 Me-selson 和 Yuan（1968）纯化得到了大肠杆菌 K12 的限制性内切酶时达到高峰。

因为这个内切酶可以把未修饰的 DNA 切割成大的分离片段，人们认为它一定识别一个靶序列。

从而提供了对 DNA 进行可控操作的前景。

但不幸的是，K12 内切酶不具备人们希望的性质。

虽然它确实是结合到一定的区域序列上，切割却在几千个碱基对以外“随机”发生的（Yuan 等，1980）。

经过大量努力后，终于在1970 年取得了突破，人们发现了在流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae）中存在一种酶，其作用更加简单（Kelly & Smith，1970；Smith & W ilcox，1970），即这个酶可以识别双链 DNA 分子中的一个特定靶序列，并在该序列之内切断多聚核苷酸链，从而产生长度和序列一定的分离片段。

突破性的进展始于 Hamilton Smith 的发现，他从嗜血流感细菌（Haemophilus influenzae）菌株 Rd中找到了一种限制性内切酶（Smith & Wilcox，1970），并阐明了它在噬菌体 T7 DNA 中切割的核苷酸序列（Kelly & Smith，1970）。

限制性内切酶

限制性内切酶限制性内切酶（又称限制酶）首先是在细菌体内发现的，但后来在部分古细菌中也发现了这种成分。

通常，限制性内切酶会切割双链DNA，每个限制性内切酶会识别特定的DNA序列，根据不同的内切酶类型，可在识别序列内或距识别序列不远的位置处切割DNA，识别序列长度通常为4-8bp，酶切之后会形成粘性末端和平末端。

上世纪50年代初期，许多研究团队观测到了噬菌体对于同一物种的不同细菌宿主菌株存在感染效率差异[1,2]，即：使用在一种细菌菌株（例如，大肠杆菌C）内繁殖的噬菌体λ感染同一种类的灵异菌株（例如大肠杆菌K），结果发现，相比于重新感染宿主菌株（大肠杆菌C），大肠杆菌K的感染率出现明显下降。

新的宿主（大肠杆菌K）似乎可以选择性抵御或“耐受”侵入的噬菌体。

研究人员还发现，这一现象并没有遗传性，因为经过一轮感染后，在新菌株中生长的噬菌体还可以以正常的感染率感染该菌株。

这种现象被称为“宿主控制变异”，有关其背后的机制也成为了频繁研究的领域[3]。

直到上世纪60年代，人们才发现宿主变异的机制，其与噬菌体DNA的酶切有关，进而发现并分理出了限制性内切酶。

上世纪60年代初Werner Arber观测发现，宿主范围内的决定性遗传物质都存在于噬菌体DNA中，而后续实验证明甲硫氨酸参与宿主的自我保护[4]。

这些发现最终催生了限制性修饰（R-M）体系的概念，通过该体系，来自于宿主的限制性内切酶和甲基化酶共同作用，切割外来病毒（非甲基化）DNA，同时保护宿主的DNA不受甲基化[5]。

随着DNA连接酶的发现以及位点特异性限制性内切酶的家族不断壮大，重组DNA 技术应运而生。

限制性内切酶的命名规则，考虑到内切酶来源的三种特性——属名、种名和菌株或血清型——组成了一个简短的名称，后面加上罗马数字，代表来自同一菌株的多个限制性内切酶[6]。

例如，以HindⅢ酶为代表：“H”代表Haemophilus“in”代表influenzae“d”代表血清型d“Ⅲ”用于区分来自于Haemophilusinfluenza血清型d的其它限制性内切酶限制性内切酶的分类，根据结构的复杂程度、识别序列、切割位点位置以及辅助因子要求，限制性内切酶分为四类：TypeⅠ：同时具有限制性和甲基化活性的多亚基蛋白需要ATP切割位点与识别位点间的间距不定TypeⅡ：特异性的识别序列切割位点位于识别序列内或邻近识别序列在切割位点生成5＇磷酸基和3＇羟基末端需要M2+TypeⅢ：由两个相反的识别序列组成切割位点与其中一个识别序列的间距恒定需要ATPTypeⅣ：仅切割甲基化的DNA切割位点大约距离识别位点30bp由于自身特殊的特点，TypeⅡ限制性内切酶已经成为分子克隆、法医学DNA分析等许多研究应用最常用的限制性内切酶。

基因工程中常用的三种工具酶

一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）1．定义：凡能识别和切割双链DNA分子内特定核苷酸序列的酶，也称为限制酶（restriction enzyme，RE）。

2．类型：来自原核生物，有三种类型。

Ⅰ型：兼具甲基化修饰和ATP参与的核酸内切酶活性，随机切割。

Ⅱ型：大多能特异识别4～6个核苷酸序列（回文结构），最大识别序列为8个核苷酸，如SfiI、NotI；但有近10种Ⅱ型限制酶的识别序列为非回文结构，如SfaNI、MnlI等，Ⅱ型限制酶均可作为基因工程的工具酶。

另有一些来源不同的限制酶的识别位点是相同的核苷酸序列，将这类酶特称为同工异源酶（isoschizomers）或同裂酶。

同工异源酶切割产生相同的末端；有一些同工异源酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有所差别，故可用来研究DNA 甲基化作用，如SmaI和XmaI；HpaII和MspI；MboI和Sau3AI是成对的同工异源酶；其中HpaII和MspI是一对同工异源酶，其识别位点是CCGG。

与同工异源酶对应的一类限制酶，它们虽然来源各异，识别序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端，称为同尾酶（isocaudamers）。

常用的限制酶BamHI、BclI、BglII、Sau3AI和XhoII就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC4个核苷酸组成的粘性末端。

显而易见，由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的，因此在基因克隆实验中很有用处。

但必须指出，由两种同尾酶消化产生的粘性末端，重组之后所形成的序列结构再不能被原来的任何一种同尾酶所识别。

Ⅲ型：功能基本同Ⅰ型，但为特定位点切割。

三种限制酶的区别如下表所示：Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型DNA底物dsDNA dsDNA dsDNA辅助因子Mg2+,A TP,SAM Mg2+ Mg2+,A TP识别序列特异特异特异切割位点非特定（于识别序列前后100~1000bp范围之内）特定（切割于识别序列之中或近处，固定位点）特定（切割点在识别序列后25~75bp处）与甲基化作用的关系内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用酶蛋白不具有甲基化作用内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用3．命名：第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株。

4.1.1 限制性内切酶

限制性内切酶LOGOE. coli KE. coli C EOP=1EOP=1EOP=1EOP=10-4E.coli K E.coli B E.coli CλC11110-410-410-410-411λK λB1963年以来，Arber及其同事发现，经同位素标记证明，噬菌体在新品系中的损害伴随着其DNA的降解，但宿主自身的DNA不被降解。

Arber的解释：通过噬菌体感染进入细菌细胞的DNA分子能被细菌识别而分解，细菌本身的DNA则由于已被自己所修饰而免于被分解。

1965 年，Arber预言有限制性内切酶的存在发现1968年Messelson首次从E.coli K中分离限制性内切酶 Eco K①需要ATP，S-腺苷甲硫氨酸（SAM）等②有特定的识别位点，但没有特定的切割位点③切割位点远离识别位点1000bp以上1970年美国约翰·霍布金斯大学 H.Smith 偶然发现流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）细胞提取液能迅速降解外源的噬菌体DNA ，但不能降解自身DNA ，这就是Hin dII酶。

Nathans等人立即查明了限制内切酶的有效性，并将其用来分析 DNA 的结构。

1978 H.Smith， W Arber和D Nathans由于限制性内切酶发现和应用的研究得到诺贝尔奖。

命名限制酶的命名最初由Smith和Nathans于1973年提出，1980年再由Roberts进行系统化和分类，人们今天使用的就是这个体系的一个简化版。

1、来源菌属名的首字母和其种名的头两个字母形成的三个字母缩写来表示。

2、用一个字母表示菌株或类型。

3、用罗马字母表示不同的限制与修饰体系。

如Eco RI（Escherichia coli ）种类根据限制酶识别切割特性，催化条件，及是否有修饰酶活性分三类(I, II ,III) 。

也有分四类，IIs类，即II 亚类。

type Ⅰ（数量少，约占1%）特点：（1）属复合酶类，兼具修饰和切割DNA两种特性。

限制酶的多种切割要领

限制酶的多种切割方法一、错位切割含目的基因的DNA片段和运载体──形成黏性末端 1. 单酶切（1）同一种限制酶分别切割含目的基因DNA片段与运载体。

这是最简单的一种方法，含目的基因的DNA片段与运载体在同种限制酶作用下形成相同的黏性末端，这两个黏性末端间能通过碱基间的配对而连接，进而形成重组DNA分子。

（2）用同裂酶去切割含目的基因DNA片段与运载体。

有一些来源不同的限制酶识别核苷酸顺序和切割位置都相同，这类酶称为同裂酶（同切酶或异源同工酶）。

同裂酶产生同样的切割，形成相同的黏性末端。

2009年江苏生物高考第34题就出现了同裂酶（BamHⅠ与BstⅠ），其中的差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。

（3）用同尾酶切割含目的基因DNA片段与运载体。

有一些来源不同、识别的核苷酸顺序和切割位置各不相同，但能产生相同的黏性末端，这类酶被称为同尾酶。

常用的限制酶BamHⅠ、BglⅡ、BclⅠ和Sau3A就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC四个核苷酸组成的黏性末端。

显而易见，由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其黏性末端之间的碱基互补作用而彼此连接起来。

【例1】（2005年天津理综）：限制性内切酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制性内切酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。

在质粒上有酶Ⅰ的一个切点，在目的基因的两侧各有1个酶Ⅱ的切点。

①请画出质粒被限制酶Ⅰ切割后所形成的黏性末端。

②请画出目的基因两侧被限制酶Ⅱ切割后所形成的黏性末端。

③在DNA连接酶的作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端能否连接？为什么？解析：这两种酶属于同尾酶，能产生相同的黏性末端，因此能够连接起来。

③由于两者产生的黏性末端相同（都是GATC），黏性末端之间能发生碱基互补配对而连接。

（4）单酶切的优点与缺点。

单酶切优点就是操作简单。

它的缺点主要有两个：①酶切后的质粒与目的基因在DNA连接酶作用下易自身环化：用单酶切切割后的目的基因和质粒的两侧各有一个黏性末端，而且是相同的末端，因此这两个末端会发生碱基互补配对而使目的基因和质粒分别发生首尾相连，都形成环状DNA分子，其中质粒又恢复成没有切割前的样子。

基因工程名词解释

名词解释【基因工程】：在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（细菌质粒、病毒或噬菌体DNA），转入微生物，植物或动物细胞内进行无性繁殖，并表达出基因产物。

【限制性核酸内切酶】:是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4-8bp）,并由此处切割DNA双链结构的核酸内切酶。

【识别序列】：限制性核酸内切酶在双链DNA上能够识别的特殊核苷酸序列被称为识别序列。

【酶切位点】：DNA在限制性核酸内切酶的作用下，使多聚核苷酸链上磷酸二酯键点开的位置被称为切割位点。

【粘性末端】：是指含有几个核苷酸单链的末端，可通过这种末端的碱基互补，使不同的 DNA片段发生退火。

【平末端】：限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时产生的平齐的末端。

【同裂酶】：一些来源不同的但能识别位点的序列相同的限制性内切酶。

【同尾酶】：一些来源不同且识别序列不同，但能产生相同粘性末端的限制性内切酶。

【DNA的甲基化程度】:DNA被甲基化酶甲基化，识别序列中的核苷酸一旦被甲基化，就会影响内切酶的切割效率。

【位点偏爱】：对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象【内切酶的star活性】：某种限制性核酸内切酶在特定条件下，可在不是原来的识别序列处切割DNA，这种现象称为star活性。

【末端转移酶】：一种能将脱氧核苷酸三磷酸（dNTP）加到某DNA片段上3’-OH基上的酶。

【DNA连接酶】：借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA双链,DNA片段紧靠在一起的3’-OH末端与5’-PO4末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接【DNA聚合酶】：以DNA为复制模板，使DNA由5'端点开始复制到3'端的酶。

【反转录酶】：与DNA聚合酶作用方式相似：5’→3’聚合，模版是mRNA,合成DNA【碱性磷酸酶】：能够催化核酸分子脱掉5’磷酸基团，从而使DNA（或RNA)片段的5’-P 末端转换成5’-OH末端。

常用限制性内切酶的识别序列和同裂酶

酶同裂酶识别序列酶同裂酶识别序列酶同裂酶识别序列ACC I-GT (A/C)(G/T)AC BsuR I Hae III GG CC Msp I4Hpa II C CGGACC III BspE II T CCGGA Cfo I Hha I GCG C Hap IIBspm II HinP1 I G CGC Mst II Bsu36 I CC TNAGGMro I Cfr9 I Xma I C CCGGG Nar I-GG CGCCAha II Acy I G(A/G) CG(T/C)C Sma I CCC GGG Ehe I GGC GCC Hsp92 I Cfr13 I Asu I G GNCC Kas I G GCGCCAha III Dra I TTT AAA Sau96 I Bbe I GGCGC CAlu I-AG CT Cfr42 I Sac II CCGC GG Nco I Bsp19 I C CATGGAlw26 I2BsmA I GTCTC(1/5)Cla I Ban III AT CGAT Nde I-CA TATGAlw44 I ApaL I G TGCAC Bsp106 I Nde II Mbo I GATC SnoI BspD I Sau3A IApa I-GGGCC C Bsu15 I Nhe I-G CTAGCAsp I Tth111 I GACN NNGTC Csp I Rsr II CG G(A/T)CCG Sph IAsp718 I Acc65 I G GTACC Cvn I Bsu36 I CC TNAGG Not I-GC GGCCGC Kpn I GGTAC C Dde I- C TNAG Nst I Ava III ATGCA TAsn I Vsp I AT TAAT Dpn I3-GmeA TC EcoT22 IAsu I Sau96 I G GNCC Dra I Aha III TTT AAA Mph1103 I Cfr13 I Ecl136 II EcolCR I GAG CTC Nsp III Ava I C (T/C)CG(A/G)G Asu II Csp45 I TT CGAA Sal I GAGCT C PaeR7 I Xba I T CTAGAAva I Eco88 I C(T/C)CG(A/G)G Eco24 I Ban II G(AG)GC(TC) C Pal I Hae III GG CC Nsp III Eco32 I EcoR V GAT ATC Pst I-CTGCA GAva II Sin I G G(A/T)CC Eco64 I Ban I G G(TC)(AG)CC Pvu I Xor II CGAT CG Eco47 I Eco88 I Ava I C (TC)CG(AG)G Pvu II-CAG CTG Axy I Bsu36 I CC TNAGG Eco91 I BstE II G GTNACC Rsa I-GT ACBal I Msc I TGG CCA Eco147 I Stu I AGG CCT Rsr II Csp I CG G(A/T)CCG MluN I Eco255 I Sca I AGT ACT Sac I Sst I GAGCT C BamH I-G GATCC EcolCR I Ecl136 II GAG CTC Ecl136 II GAG CTC Ban I BshN I G G(T/C)(A/G)CC Sac I EcolCR I GAG CTC Eco64 I Sst I GAGCT C Sac II Sst II CCGC GGHgaC I EcoR I-G AATTC Ksp IBan III Cla I AT CGAT EcoR II BstO I CC (A/T)GG Cfr42 IBbe I-GGCGC C EcoR V Eco32 I GAT ATC Sal I-G TCGAC Nar I GG CGCC EcoT14 I Sty I C C(A/T)(A/T)GG Sau I Bsu36 I C CTNAGG Bbu I Pae I GCATA C EcoT22 I Nsi I ATGCA T Sau3A I Mbo I GATC Sph I Eco47 I Ava II G G(A/T)CC Nde II Bcl I-T GATCA Sin I Sau96 I Asu I G GNCC Bcn I Nci I CC (C/G)GG Eco81 I Bsu36 I CC TNAGG Cfr13 IBst98 I C TTAAGG Fok I-GGATG(9/13)Sca I Eco255 I AGT ACTBgl I-GCCNNNN NGGC Hae II Bsp143 II(A/G)GCGC (T/C)Sfi I-GGCCNNNNN NGGCC BseN I BsrS I ACTGGN Hae III BsuR I GG CC Sin I Ava II G G(A/T)CC Bsr I Pal I Eco47 IBgl II- A GATCT Hap II Hpa II C CGG Sma I-CCC GGG BshN I Ban I G G(T/C)(A/G)CC Msp I Xma I C CCGGGBsp19 I Nco I C CATGG HgaC I Ban I G G(T/C)(A/G)CC Cfr9 IBsp68 I Nru I TCG CGA Hha I Cfo I GCG C Spe I- A CTAGTBsp106 I Cla I AT CGAT HinP1 I G CGC Sph I Bbu I GCATG CBsp143 I Mbo I GATC Hinc II Hind II GT(T/C) (A/G)AC Pae IBsp143 II Hae II(A/G)GCGC (T/C)Hind III- A AGCTT Ssp I-AAT ATT BspD I Cla I AT CGAT Hinf I-G ANTC Sst I Sac I GAGCT C BspE I Acc III T CGGA HinP1 I-G CGC EcolCR I GAG CTC BspM II Acc III T CCGGA Hha I Cfo I GCG C Sst II Sca II CCGC GGBst71 I2Bbv I GCAGC(8/12)Hpa I-GTT AAC Sty I EcoT14 I C C(A/T)(A/T)GG Bst98 I Afl II C TTAAG Hpa II Msp I C CGG Taq I TthHB8 I T CGA Bfr I Hap II Tru9 I Mse I T TAABstB I Csp45 I TT CGAA Kpn I-G GTACC Tru II Tth111 I GACN NNGTC BstE II BstP I G GTNACC Asp718 I GGTAC C Tth111 I Asp I GACN NNNGTC Eco91 I Acc65 I Tru IIBstN I BstO I CC (A/T)GG Ksp I Sac II CCGC GG TtHB8 I Taq I T CGABst0 I Apy I CC (A/T)GG Xba I-T CTAGABstN I Mbo I Sau3A I GATC Xho I PaeR7 I C TCGAGEcoR II Nde II Xho II BstY I(A/G) GATC(T/C) Mva I Bsp143 I Mfl IBstX I-CCANNNNN NTGG Mbo II-GAAGA(8/7)Xma I Cfr I C CCGGG BstY I Xho II(A/G) GATC(T/C)Mfl I Xho II(A/G) GATC(T/C)Sma I CCC GGGBsu15 I Cla I AT GAT Mlu I- A CGCGT Xma III Eco52 I C GGCCGBsu36 I Axy I CC TNAGG MluN I Bal I TGG CCA BstZ ISau I Mro I Acc III T CCGGA Eag IMstII Msc I Bal I TGG CCA EclX ICvn IAoc IEco81 I。

常见限制性内切酶识别序列

常见限制性内切酶识别序列(酶切位点)（BamHI、EcoRI、HindIII、NdeI、XhoI等）Time：2009-10-22 PM 15:38Author:bioer Hits: 7681 times在分子克隆实验中，限制性内切酶是必不可少的工具酶。

无论是构建克隆载体还是表达载体，要根据载体选择合适的内切酶（当然，使用T 载就不必考虑了）。

先将引物设计好，然后添加酶切识别序列到引物5' 端。

常用的内切酶比如BamHI、EcoRI、HindIII、NdeI、XhoI等可能你都已经记住了它们的识别序列，不过为了保险起见，还是得查证一下。

下面是一些常用的II型内切酶的识别序列，仅供参考。

先介绍一下什么是II型内切酶吧。

The Type II restriction systems typically contain individual restriction enzymes and modification enzymes encoded by separate genes. The Type II restriction enzymes typically recognize specific DNA sequences and cleave at constant positions at or close to that sequence to produce 5-phosphates and 3-hydroxyls. Usually they require Mg 2+ ions as a cofactor, although some have more exotic requirements. The methyltransferases usually recognize the same sequence although some are more promiscuous. Three types of DNA methyltransferases have been found as part of Type II R-M systems forming either C5-methylcytosine, N4-methylcytosine or N6-methyladenine.酶类型识别序列ApaIType II restrictionenzyme5'GGGCC^C 3'BamHIType II restrictionenzyme5' G^GATCC 3'BglIIType II restrictionenzyme5' A^GATCT 3'EcoRIType II restrictionenzyme5' G^AATTC 3'HindIIIType II restrictionenzyme5' A^AGCTT 3'KpnIType II restrictionenzyme5' GGTAC^C 3'NcoIType II restrictionenzyme5' C^CATGG 3'NdeIType II restrictionenzyme5' CA^TATG 3'NheIType II restrictionenzyme5' G^CTAGC 3'NotIType II restrictionenzyme5' GC^GGCCGC 3'SacIType II restrictionenzyme5' GAGCT^C 3'SalIType II restrictionenzyme5' G^TCGAC 3'SphIType II restrictionenzyme5' GCATG^C 3'XbaIType II restrictionenzyme5' T^CTAGA 3'XhoIType II restrictionenzyme5' C^TCGAG 3'要查找更多内切酶的识别序列，你还可以选择下面几种方法：1. 查你所使用的内切酶的公司的目录或者网站；2. 用软件如：Primer Premier5.0或Bioedit等，这些软件均提供了内切酶识别序列的信息；3. 推荐到NEB的REBASE数据库去查（网址：/rebase/rebase.html）当你设计好引物，添加上了内切酶识别序列，下一步或许是添加保护碱基了，可以参考：NEB公司网站提供的关于设计PCR引物保护碱基参考表下载（也可见图片）双酶切buffer的选择（MBI、罗氏、NEB、Promega、Takara）再给大家推荐一种新的不需要连接反应的分子克隆方法，优点包括：①设计引物不必考虑选择什么酶切位点；②不必考虑保护碱基的问题；③不必每次都选择合适的酶来酶切质粒制备载体；④而且不需要DNA连接酶；⑤假阳性几率低（因为没有连接反应这一步，载体自连的问题没有了）。

基因工程常用工具酶及应用

DNA 连接酶
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DNA连接酶
连接的部位：磷酸二酯键（梯子的扶手），不是氢键（梯子的踏板）。
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三.RNA酶
主要功能降解RNA 由于RNA酶分布广泛，如唾液、皮肤分泌物中都含此酶，在涉及RNA 的实验中谨防RNA酶污染。
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四.核酸酶SI
• 降解单链 DNA 或 RNA，形成5’-P的单核苷酸或寡核苷酸片段
5'粘末端
PstI
3' sticky end
3'粘末端
HpaI
blunt end
平末端
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四.识别位点与切割方式
• 限制性内切酶识别序列一般为6个核苷酸，如
EcoRI，HindIII，BamHI，居多数。也有少数限制性内切酶，识别序列为4个、5个、或更多的核苷酸如8个及8个以上，当识别序列核苷酸数为单数时，则以中间的核苷酸作为对称轴。如GTNAC（N 代表四种核苷酸）。
某些碱基被甲基化所保护。这种细菌
内部的限制与修饰作用分别由核酸内
切酶和甲基化酶完成，构成了类似免
疫的防御系统。
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解释何谓内切酶
-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o红色为外切酶的作用位点，蓝色为内切酶的作用位点
7
限制性核酸内切酶的分类
目前已发现的限制性核酸内切酶600余种，可分为三大类。 Ⅱ类限制性核酸内切酶广泛用于基因工程；
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• 一般说来，在DNA分子中，识别序列短的出现概率大，识别序列长的出现概率小。有N个核苷酸的识别序列出现概率为1/4n。如识别4个核苷酸Sau 3A，则间隔256 （4×4×4×4）个核苷酸就有一次机会出现识别位点。如识别8个核苷酸的Not I，则需间隔65536个核苷酸才有一次机会出现识别位点。

限制性内切酶

限制性内切酶1，发现限制性内切酶能保护细菌不受噬菌体的感染，行使微生物免疫功能，缺乏限制性内切酶的大肠杆菌极易被噬菌体感染，但是如果拥有限制性内切酶，被感染的几率就会降低。

限制性内切酶在原核生物中普遍存在，所有自由生存的细菌和古细菌几乎都能编码限制性内切酶。

2，限制-修饰（R-M）系统大多数限制性内切酶常常伴随有一两种修饰酶（DNA甲基化酶），从而保护细胞自身的DNA不被限制性内切酶破坏。

修饰酶识别的位点与相应的限制性内切酶相同，但它们的作用是甲基化每条链中的一个碱基，而不是切开DNA链。

甲基化所形成的甲基基团能够伸入到限制性内切酶识别位点的双螺旋的大沟中，阻碍限制性内切酶发挥作用，即组成R-M系统。

在R-M系统中，有些限制性内切酶和修饰酶是两种不同的蛋白，独立行使自己的功能，有些本身就是一种大的限制-修饰复合酶，由不同的亚基或同一亚基的不同结构域分别执行自己的功能。

3，分类最常用的II型限制性内切酶，能够在识别序列内部或附近特异性的切开DNA链，产生特性的片段和凝胶电泳条带，是唯一一类能用于DNA分析和克隆的限制性内切酶。

限制性内切酶切割后产生一个3-羟基和5-磷酸基，只有当镁离子存在时才具有活性，而相应的修饰酶则需要S-腺苷甲硫氨酸的存在。

备注：NEBuffer: Tris-HCl , MgCl, DTT（二硫苏糖醇，强还原剂）星号活性：在非理想条件下，内切酶切割与识别位点相似但不完全相同的序列，称为星号活性。

使用高保真内切酶，即经过基因工程改造降低了星号活性。

同裂酶：识别序列相同的限制性内切酶即为同裂酶，第一个被发现的内切酶称为原酶，后来发现的识别序列相同的内切酶称为原酶的内裂酶。

4，甲基化（1）原核生物甲基化在原核生物中，DNA甲基化酶作为限制修饰系统的一个组成部分广泛存在，作用是保护宿主菌不被相应的限制性内切酶切割。

Dam甲基化酶：G m ATCDcm甲基化酶：C m CAGG和C m CTGG例如，从dam+ E.coli 中分离的质粒DNA则不能被识别序列为GA TC的限制性内切酶所切割，但是被Dam甲基化阻断的限制性位点可以通过克隆方法去甲基化，及将DNA转入至dam-的菌种中进行增殖。

限制性内切酶的同裂酶

XagI, ER1301/2 Bsp143I, ER0871 BseGI, ER0871/2 Bsh1236I, ER0921/2 Bsp143II, ER0791/2 Bsh1285I, ER0891 MvaI, ER0551/2 XceI, ER1471/2 MvaI, ER0551/2
BoxI, ER1431 Eco91I, ER0391/2 BfmI, ER1161/2 Eco105I, ER0401/2
BseDI BseGI BseJI BseLI BspT107I BspTI BspTNI BspXI BsrBI BsrDI BsrFI BsrGI BsrI BsrSI BssAI BssECI BssHI BssHII BssNAI BssT1I Bst1107I Bst2UI Bst4CI Bst6I Bst98I BstACI BstAUI BstBI BstEII
AlwI AlwNI BdaI BfaI
BfiI BfmI BfrI BfuAI BfuCI BfuI BglI BglII BlnI BlpI Bm e1390I Bm e1580I Bm e18I Bm rI
Bm yI BoxI BpiI BplI Bpu10I Bpu1102I Bpu14I BpuAI Bsa29I BsaBI BsaHI BsaI BsaJI BsaMI
Bsp1407I，ER0931/2/4 Bsp143I，ER0781/2 Bsp143II，ER0797/1 Bpu1102I, ER0091/2 NcoI, ER0571/2 Bsp68I，ER0117/1 PvuI, ER0621/2 Bsu15I, ER0141/2 BspLI，ER1151/2
BstENI BstENII BstF5I BstFNI BstH2I BstMCI BstNI BstNSI BstOI BstPAI BstPI BstSFI BstSNI

实验九 DNA的酶切

实验九 DNA的酶切一、原理1．三类限制酶限制酶特异地结合于其识别的特殊DNA序列之内或附近的特异位点上，并在此切割双链DNA。

限制酶可分为3类。

I类和Ⅲ类限制酶在同一蛋白质分子中兼有修饰(甲基化)作用及依赖于ATP的限制性酶切活性。

Ⅲ类限制酶在识别序列上切割DNA，然后从底物上解离。

而I类限制酶结合在识别序列上，但却随机地切割回转到被结合酶处DNA。

在基因工程中I类和Ⅲ类限制酶都不常用。

常用的是I类限制酶。

2．Ⅱ类限制酶Ⅱ类限制酶又可分为二种酶，一种是限制性内切酶，它切割裂一特异性的核苷酸序列；另一种为独立的甲基化酶，它使识别序列甲基化。

基因工程中常指的限制酶或限制性内切酶就是第一种I类限制酶。

3．限制性内切酶(1)识别序列一般为回文对称型，如EcoR I识别序列为：5’…GAATTC…3’3’…CTTAAG…5’对称轴两则等距离的碱基两条互补链识别序列完全一样。

(2)识别序列长度大多数为4～6个核苷酸。

(3)切割方式两种A．错位切割大多数限制性内切酶不在识别序列的对称轴上切割DNA链，而在偏离对称轴数个核甘酸处切割。

错位切割所产生的DNA末端，两条链不平齐，一条链凸出，一条链凹进，这种末端称为粘性末端(Cohesive Ends)。

带有相同粘性末端的DNA分子很容易在末端互补配对，连接成新的重组分子。

B.沿对称轴切割，一些酶在对称轴处切割，产生平齐末端(Blunt Ends)。

(4)同裂酶(同切口限制性内切酶)一般说来，不同的限制性内切酶识别不同的序列。

然而有一些从不同来源分离的酶能在相同靶序列切割。

这些酶称为同裂酶(Ischizomers)。

有—些识别四核苷酸序列的酶识别序列在另一种六核苷酸识别序列之内，如MboI和Sau3A I，识别序列在BamHl之内。

两种酶切割反应要求最严的成分是底物DNA，酶要产物直接受DNA底物纯度的影响。

提取过程中的酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl均能干扰反心，有些甚至改变识别序列两种酶切割后得到相同末端．所以这两种酶产生的片段可以连接。

基因操作原理

基因操作原理基因操作原理题库名词解释1.同裂酶isoschizomer：识别相同序列的不同的限制性内切酶。

2.星性活性star activity：在极端⾮标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星性活性。

3.质粒不相容性：2个质粒在同⼀宿主中不能共存的现象称质粒不相容性，它是指在第⼆个质粒导⼊后，在不涉及DNA限制系统时出现的现象。

4.饱和诱变saturation mutagenesis：对基因的某⼀⼩区域内碱基进⾏多种形式的置换（在关键位置引⼊不同的氨基酸探寻何种替换可以获得最⼤活性）5.定点诱变：利⽤⼈⼯合成的寡聚苷酸，在离体的条件下，制造基因中任何部位的位点特异性突变的技术。

6.突变抑制基因：某⼀突变基因的表型效应由于第⼆个突变基因的出现⽽恢复正常时，称后⼀基因为前者的抑制基因。

7.融合表达载体：表达载体的多克隆位点上有⼀段融合表达标签（Tag）,表达产物为融合蛋⽩（有分N 端或者C端表达），⽅便后继的纯化步骤或检测。

8.克隆载体：为―携带‖感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的⽆性繁殖或表达有意义的蛋⽩质所采⽤的⼀些DNA分⼦。

9.穿梭载体shuttle vector：含有不同宿主的不同的复制起始点，能在不同的宿主中进⾏复制增殖，⼀种克隆载体, 可在2种或多种宿主中克隆,常⽤于重组DNA在E.coli中克隆再转到另⼀种⽣物(eg.yeast)中表达。

10.置换载体(replacement vectors)：少数载体分⼦如噬菌体基因组的中间⽚段与噬菌体的感染能⼒和DNA 复制功能⽆关，因此这个⽚段可以⽤限制酶加以切除，代之以外源DNA⽚段。

11．亲和层析（affinity chromatography）利⽤共价连接有特异配体的层析介质，分离蛋⽩质混合物中能特异结合配体的⽬的蛋⽩或其它分⼦的层析技术。

12．基因⽂库(Gene library)：即某种⽣物类型全部gene的以重组体形式存在的集合。

常用的限制性内切酶

切口：平端切口、粘端切口
HindⅡ
GTCGAC CAGCTG
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGTG
平端切口
G+
CCTAG
GATCC G
粘端切口
识别序列一般为4、6、8个碱基对（base pair,bp)
限制性酶切位点出现的概率：
①识别4bp的酶每1/44bp 即1/256bp
GCCTAG+
GATCC G
同尾酶:
有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)。
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
Bg lⅡ
AGATCT TCTAGA
G CCTAG
+
GATCC G
最古老的生物转化，就是利用细菌将乙醇转化成乙酸的醋酸发酵。
生物转化还可用于把异丙醇转化成甘油进而二羟基丙酮；葡萄糖转化成葡萄糖酸，进而转化成２一酮基葡萄糖酸或５一酮基葡萄糖酸，以及将山梨醇转变成L一山梨糖等。此外，微生物转化发酵还包括甾类转化和抗生素的生物转化等等。
其产物具有立体构型单一，转化条件温和，后处理简便，公害少。
生物合成技术：基因工程、细胞工程基础上应用发酵法和酶法合成技术合成生化活性物质。
涉及的反应有50多种：如水解、脱氢、氧化、羟基化、环氧化、还原、氢化、酯化、异构化、氮杂基团氧化还原、硫醚开裂等等。
2、生物半合成技术：
指一个药物其部分结构由天然资源得到，然后用化学合成法制得最终产品或应用微生物转化法将化学合成的中间产物，通过某些生物合成步骤来解决药物合成中难于进行的化学反应，从而获得最终有效化合物。

3、基因克隆的酶学基础-01

基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）以及小牛血清（BSA）等。
7、完全酶切和部分酶切
3.2 DNA连接酶与DNA 分子的体外连接 3.2.1 DNA连接酶：大肠杆菌DNA连接酶和T4DNA连接酶
动物细胞和噬菌体
缺口（nick)
裂口（gap)
大肠杆菌及其它细菌
3.2.2 粘性末端的连接
用碱性磷酸酶的脱磷酸作用阻止线
S1 核酸酶在分子生物学研究中的主要用途是给RNA定位。
3.6.2 Bal 31 核酸酶与限制位点的确定具有单链特异的核酸内切酶活性和双链特异的核酸外切酶活性。
应用Bal 31 核酸酶诱发 DNA分子的缺失突变
（a）质粒DNA分子，A区段是准备诱发缺失突变的序列
（b）用Bal 31核酸酶不同时间长度分别消化线性DNA分子 S1 核酸酶与RNA分子定位反应条件：低水平Zn2+、最适pH值：4.0~4.3、NaCI浓度：
100mmol/L
S1 核酸酶的主要功能： ① 催化RNA和单链DNA分子降解成5′单核苷酸； ② 作用于双链核酸分子的单链区，并从此处切断核酸分子（单链区可小到一个碱基对）。
T4 多核苷酸激酶的交换活性
3.4.2 碱性磷酸酶（BAP、CIP)与 DNA脱磷酸作用
3.5 DNA 外切酶
核酸外切酶（exonucleases）：是一类从多核苷酸链的一头开始按序催化降解核苷酸的酶。按作用特性的差异可分为单链核酸外切酶（如exo I、 exo VII等）和双链核酸外切酶（如exo III、λ exo等）。
（c）将带有另一种限制性内切酶识别序列的衔接物连接到这些缺失分子上并将它们环化起来
（d）新形成的环状质粒分子具有新的限制性内切酶（Hind III）的切点，其A区段有缺失

限制酶的多种切割方法以及在高中生物试题中的体现

限制酶的多种切割方法以及在高中生物试题中的体现周荷静（相城区陆慕高级中学 215131）摘要：本文总结了限制酶的多种割切方法，并分析其优缺点，并结合相关生物试题，对其更加深入理解。

关键字：限制酶单酶切双酶切高考题限制酶是基因工程中的工具酶之一，为了让目的基因能连接到运载体上，需要用限制酶分别切割含目的基因的DNA片段和运载体，切割方法有多种，现就其切割方法进行总结，分析其优缺点。

近几年高考生物试题中几乎年年涉及到限制酶的切割方法，这应该引起教师的注意。

1 单酶切1.1 同一种限制酶分别切割目的基因与运载体这是最简单的一种方法，用同一种酶切割后能产生相同的粘性末端，末端之间能发生碱基互补配对而形成重组DNA分子。

1.2 用同裂酶分别切割目的基因与运载体同裂酶：有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序和切割位置都相同，这些有相同切点的酶称为同裂酶（同切酶或异源同工酶）。

同裂酶差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。

例如HpaⅡ和MspⅠ的识别顺序都是5’……G|CG G……3’和3’……G GC|G……5’，如果其中有5’-甲基胞嘧啶，则只有HpaⅡ能够切割。

例1 （2009年江苏生物高考题）苏云金杆菌(Bt)能产生具有杀虫能力的毒素蛋白。

下图是转Bt毒素蛋白基因植物的培育过程示意图amp r为抗氨苄青霉素基因)，据图回答下列问题。

(2) 图中②表示HindIII与Bam I酶切、DNA连接酶连接的过程，此过程可获得_______种重组质粒；如果换用Bst I与BamH I酶切，目的基因与质粒连接后可获得_______种重组质粒。

解析题中考查的是相同的粘性末端才能发生碱基互补配对而连接这一知识点。

用HindIII与Bam I酶切，则质粒产生两个粘性末端，分别是H和B，也就是说能与质粒连接的DNA分子的粘性末端也只能是H和B，用HindIII与Bam I酶切含目的基因的DNA片段，可得到4种DNA片段，他们的粘性末端分别是B、B和H、H和B、B，因此有中间的两个DNA片段可以与质粒连接，形成2种重组质粒。

基因工程

一、名词解释1、同裂酶(isoschizomer):不同来源的限制性核酸内切酶识别与切割相同的核苷酸靶序列，称为同裂酶。

Hpa Ⅱ和Msp I(C CGG)。

2、同尾酶(isocaudarner):不同来源的限制性核酸内切酶识别与切割的核苷酸靶序列也各不相同，但都产生相同的粘性末端，这类酶称为同尾酶。

BamH I(G GATCC)和Bgl Ⅱ(A GATCT)。

3、星号活性(star activity):在极端非标准反应条件下，限制性核酸内切酶能切割与特异识别序列相似的序列，降低酶切反应的特异性，这种改变的特殊性称为限制性核酸内切酶的星号活性。

4、载体(vector)：携带外源基因进入受体细胞并在细胞内繁殖的DNA分子5、不亲和性：是指在没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。

6、多克隆位点( MCS)：载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制性核酸内切酶的酶切位点的DNA片段。

7、电泳(EP):带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极方向移动，这种现象称电泳。

8、探针(probe)：经放射性或非放射性等物质标记的已知或特定的核酸片段。

9、PCR：是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。

10、平台效应：PCR循环的后期，合成的产物到达0.3－1 pmol的水平，由于产物的堆积，使原来以指数增加的速率变成平坦曲线，扩增产物不再随循环次数而明显上升。

11、蛋白质变性：是指蛋白质在某些物理和化学因素作用下其特定的空间构象被改变，从而导致其理化性质的改变和生物活性的丧失，这种现象称为蛋白质变性。

12、解链温度(Tm)：DNA双链解离一半时的温度Tm值= 4×(G+C)＋2×(A+T)。

限制性内切酶和引物

引物设计软件
• Primer Premier 5.0
• Oligo • primer 3 • The Primer Generator • NetPrimer
Primer Premier 5.0使用介绍sequence Load
Preimer Premier 启动界面

子的简并性，引物3’端最后一个碱基最好
不与密码子第三个碱基配对。
引物5’端
• 引物5’端可以有与模板DNA不配对碱基，在5’端引入一段非模板依赖性序列。
– 5’端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切位点5’端加上适当数量的保护碱基）。 – 5’端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点的点突变以作研究。 – 5’端标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛等）。
7、同尾酶
许多不同的限制酶切割 DNA 产生的末端是相同的，且是对称的，即它们可产生相同的粘性突出末端。这些酶统称为同尾酶。这些酶切割 DNA 得到的产物可进行粘端连接。以下几种酶产生的末端是相同的。通过表 4-3 很容易判断哪些酶可产生相同的 DNA 末端。
· EcoRⅠ G↓AATCC MfeⅠ C↓AATTC ApoⅠ R↓AATTY · SpeⅠ A↓CTAGT NheⅠ G↓CTAGC XbaⅠ T↓CTAGA · BamHⅠ G↓GATCC Sau3AⅠ ↓GATC StyⅠ C↓CWWGG · ClaⅠ AT↓CGAT AccⅠ GT↓MKAC （pUC19）
四、III类限制修饰酶
（1）亚基R，MS亚基组成。MS亚基具有识别和甲基化修饰双重作用. （2）修饰与限制取决于两亚基之间的竟争。
（3）切割位点无特异性，只与识别位点的距离有关 MboII 识别 5’-AAGA- 3’ 切割位点 5’-GAAGANNNNNNNN/N-3’ 3’-CTTCTNNNNNNN/NN-5’