实验 血红蛋白及其衍生物的吸收光谱及

仪器和试剂
1．仪器：试管；吸量管； 量筒；722型分 光光度计；CO发生器。 2．试剂： （1）浓H2SO4；
（2）甲酸； （3）蒸馏水； （4）血红蛋白溶液。
（5）NaOH；
实验操作
预热仪器 选定Байду номын сангаас长
分光光度计的使用
调节“0”点 调节T=100％ 测定
关机
1．样品的制备：
朗伯比尔定律： A=εlc
A：物质的吸光度
ε：摩尔吸光系数 l：液层的厚度 c：溶液的浓度
比色皿的使用
• 手持毛玻璃面，不可触碰光滑面
• 使用前要再用少量（大约1-2ml）待测溶液 润洗1次 • 使用时比色皿光滑面对准光路 • 使用后及时清洗（用海绵刷沾取肥皂液清 洗比色皿，并用自来水冲洗干净，随后用 蒸馏水润洗1-2次）
用草酸钾抗凝，取静脉血，边取边轻轻摇动， 即制得全血。
（1）氧合血红蛋白（HbO2）液：
加蒸馏水20ml， 取全血0.1ml（3滴）盛于 小烧杯中，混匀，此即HbO2液，呈鲜红色。 （2）碳氧血红蛋白（HbCO) 液： 取上述HbO2液约5ml于试管中，通CO气体 （浓硫酸与甲酸在CO发生器中反应发生）约10 秒钟，HbO2即变成樱桃红色的HbCO溶液。
目的要求
掌握722型分光光度计的使用 了解血红蛋白及其衍生物的吸收光谱的测定 掌握血红蛋白标准曲线的绘制
实验原理
分光光度计的使用 溶液中的物质在光的照射激发下，产 生了对光吸收的效应，物质对光的吸收是 具有选择性的，各种不同的物质都具有其 各自的吸收光谱，因此当某单色光通过溶 液时，其能量就会被吸收而减弱，光能量 减弱的程度和物质的浓度有一定的比例关 系，也即符合于比色原理---朗伯-比耳定律
3.吸收光谱曲线的绘制
以吸光度为纵坐标，波长为横坐标描 点，并将各点连接成曲线，即为血红蛋白 及其衍生物的吸收光谱，但由于使用仪器 不同，绘制出的血红蛋白及其衍生物的吸 收光谱必有一些差异，对722型分光光度计 来说，峰值误差在±3nm~5nm波长内是允 许的。
注意事项
分光光度计应放在干燥处，使用温度为5~35℃。远 离强电场、磁场
内有3个特征的吸收峰，其峰值分别在415、 541和576nm处，当氧合血红蛋白转为碳氧 血红蛋白（HbCO），此时光谱发生改变， 在波长419、540和569nm处出现三个特征 的吸收峰，其中在500~600nm范围内2个 特征的吸收峰如下图。
项目 HbO2 HbCO
吸收峰数 2 2
吸收光谱（nm） 541 577 540 569
为了防止光电管疲劳。不测定时必须将比色皿 暗箱盖打开，使光路切断，以延长光电管使用寿命
每次做完实验时，应立即洗净比色皿 当仪器停止工作时，切断电源，电源开关同时 切断。并且用套子盖住仪器，做好使用登记
思考题
• 1、什么叫吸收光谱？测定血红蛋白及其衍 生物的吸收光谱有何意义？ • 2、Hb属于哪类蛋白质，它的吸收光谱的特 征反映它的什么结构成分？
2．吸光度测定：
（1）将如上制备的2种血红蛋白液分别 盛于比色杯内，在722型分光光度计上以蒸 馏水为空白调节吸光度零点和100%（每一 次读数均应用空白管调节零点和100%）。
（2） 先从波长500~600nm分别测定 HbO2，碳氧血红蛋白的吸光度（在相应峰 值的10nm范围内每隔2nm记录一次吸光度 读数，其余均每隔10nm记录一次吸光度读 数）。
血红蛋白及其衍生物的吸收光谱测定
血红蛋白(Hb)与O2结合生成氧合血红蛋白 (HbO2)，与CO结合生成碳氧血红蛋白(HbCO)。 因其血红蛋白分子结构不同，当光线分别透
过各种Hb溶液时，所吸收的光波也各异，可显
出特有的吸收光谱。这些吸收光谱可作为它们定
性和定量分析的基础。
如HbO2在可见光波长400~600nm范围