安全选择标记和无选择标记转基因技术研究进展(定稿)

三、MFTPS获得途径
3.1.6 Tissue Specific Expression（组织特异性） 利用一个能在时间或空间上起控制作用的组织特 异性表达的启动子（如G10-90、AoPRLl、AFP启动子 等）调控选择标记基因在转化位点的表达，即使选择 标记基因只在早期筛选时表达，而在转基因植株生长 过程中不表达，也可能在成熟植株中获得不表达选择 标记基因的转化体。 在食用植物上有重要的应用价值，例如定向删除 果实、菜叶等食用器官中的标记基因，以降低对人体 健康的影响。
（2）影响转化细胞再生 （3）影响多重转化
二、安全筛选标记技术
2.1 基因正向选择（Positive Selection）的安全标记基因 （1）与激素生物合成有关的基因 异戊烯基转移酶基因ipt和吲哚-3-乙酰胺水解酶基因IaaH。 （2）与糖类代谢有关的基因 与糖类代谢有关的基因主要包括甘露糖磷酸异构酶基因pmi，木糖异构酶 基因xylA和核糖醇操纵子rtl。 （3）与氨基酸代谢有关的基因 主要有D-氨基酸氧化酶(DAAO)和天冬氨酸激酶(AK)等。 细菌的ak基因对赖氨酸和苏氨酸并不敏感。
三、MFTPS 获得途径
无标记转基因植物 （Marker-free Transgenic Plants，MFTPS）
First approach：
Second approach：
excise or segregate
a marker gene from a target gene
overexpression of
Luo等开发的基于该系统的“基因删除(GM-Gene-Deletor)”技术 （2007），以高效的外源基因删除效率成功应用于烟草、玉米(Zea mays)和油菜(Brassica，napus)等经济植物。
三、 MFTPS获得途径
3.1.4 Transposes Mediated Reorientation（转座子系统）
在这个过程中，为了提高 对转化细胞的筛选效率，我们 不可避免地引入了 Marker Gene ，如图中的抗生素基因。
引言
（一）转基因技术的发展及意义
改良遗传性状
（二）转基因技术的现状
标记基因转化后仍留在植物体，植物及环境 安全性能否能到保障？ 为此，科学家们提出了无标记转基因作物 （Marker-Free Transgenic Plants，MFTPs）的概念。
R/RS是从酵母中获得另外一种位点特异性重组系统。重组酶基因切除 与之相邻位于重组位点RS之间的DNA片段。将选择标记基因位于RS 之间，而目的基因位于RS区域外。 sugit等报道了两步法转化烟草，MAT载体中R重组酶由来源于玉米的 化学诱导启动子谷肤甘肤-s-转移酶(GST-n-27)启动，转基因植株培养 添加外源除草剂的解毒剂SafenerR29148即可激活，R重组酶的将筛选 标记iPt切除，从而高效获得无筛选标记的转基因植物(图3)。经过二次 筛选，获得大量的单拷贝、无筛选标记且表型正常的植株。
3.1.2 Homologous Recombination（同源重组）应用实例
成功地应用于动物和微生物，植物上尚处于探索阶段。
三、 MFTPS获得途径
3.1.3 Site-specific Recombination System（位点特异性重组）
该方法利用重组酶催化2个短的特定DNA序列间的重组，将 位于这两个短DNA序列中间的选择标记基因筛除，获得无选择 标记转基因植物。已发现的位点特异性重组系统包括Cre/loxp 、FLP/FRT、R/RS和Gin/gix、attp等5种。 Cre/loxP系统是目前位点特异性重组系统中研究较多的一种， 其原理是将标记基因构建于2个同向重复的lox位点(34 bp)之间，将 目的基因构建于lox位点之外。在获得转基因植株后,再诱导植株体 内Cre基因的表达，将位于lox位点之间的选择标记基因切除。 （王贺伟等，2013）
三、MFTPS获得途径
3.1.1 Co-transformation（共转化）
农 杆 菌 介 导
三、MFTPS获得途径
3.1.1 Co-transformation（共转化）
无标记基因
ห้องสมุดไป่ตู้
三、 MFTPS获得途径
3.1.1 Co-transformation
无标记基因
三、 MFTPS获得途径
3.1.1 Co-transformation（共转化）应用实例
标记移除技术： co-transformation(共转化) homologous recombination（同源重组) site-specific recombination system(位点特异性重组系统) transposes mediated reorientation(转座子介导的再定位系统) multi-auto-transformation vector(MAT载体系统) tissue specific expression(组织特异性表达）
二、安全筛选标记技术
2.2 基于负向选择的安全标记基因
利用来源于植物的基因（如菠菜BADH基因）作为选择标记基因
，该基因所编码的甜菜碱脱氢酶将有毒的甜菜碱醛转化为无毒的 甜菜碱。
2.3 基于可视化选择的安全标记基因
维多利亚水母中分离出的绿色荧光蛋白(GFP)
二、安全筛选标记技术
2.4 该技术的优缺点：
1、如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有 效切除两个LoxP位点间的序列； 2、如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导 致两个LoxP位点间的序列倒位； 3、如果两个LoxP位点分别位于两条不同的DNA链或染色体上，Cre酶能 介导两条DNA链的交换或染色体易位。
三、 MFTPS获得途径
3.1.2 Homologous Recombination（同源重组）
用选择标记进行筛选并获得转基因植株后，再重新导入一段序 列，使标记基因置于2个DNA同源序列之间，通过染色体内重组将含有 选择标记的DNA片段去除，获得MFTPS。
基 因 打 靶
三、 MFTPS获得途径
三、 MFTPS获得途径
3.1.5 Multi-auto-transformation (MAT)载体系统
该方法将选 择标记基因同位 点特异重组R/RS 体系或玉米的转 座元件进行整合 ，利用特异性重 组或转座将转化 细胞中的标记基 因剔除。
三、MFTPS获得途径
3.1.5 Multi-auto-transformation (MAT)载体系统应用
通过转座酶的转座作用实现基 因重组，转座子由自主成员和非自 主成员两部分组成，如玉米的 Ac/Ds系统，其自主成员Ac基因编 码转座酶用于自身和非自主成员Ds 基因的转座。非自主成员是由自主 成员缺失了某些序列后所形成的， 不具备合成转座酶的能力。非自主 成员两端有数百个核苷酸是必需的 ，中间可换成或插入较大的外源基 因，而插入外源基因的非自主成员 仍能同自主成员一起被转座酶转移 。把标记基因置于整个转座子的外 部，目的基因将设于非自主成员内 部，转化后植物可通过转座作用将 二者分离，最后分离出无标记的转 基因后代。
the isopentenyl transferase (ipt)
gene
三、MFTPS 获得途径
3.1 Excise a marker gene(标记基因移除)
技术流程：
利用通常的选择标记筛选出初级转基因植株，然后利用转基因植株 后代遗传重组使选择标记与目的基因分离，或利用位点特异性酶将标记 基因切除而培育无选择标记的转基因植株。
目录
标记基因的潜在危害
安全筛选标记技术 MFTPS获得途径
一、标记基因的潜在危害
（1）安全性：
antibiotic resistance（抗生素抗性标记基因） ：
cross talk （水平转移）、 gene escape（基因逃逸） herbicide resistance（除草剂抗性标记基因）： ecological risk
ipt 基因 优点：高水平有利于转化植物的再生，提高转化率。 缺点：ipt的低水平表达会导致植物表型的反常变化，如植物出现 茎不伸长，侧根难以形成等一系列不正常的发育现象； GFP基因 优点：能够对转化细胞进行可视化观察，方法灵活，范围广泛，检 测快捷，使用方便。 缺点：野生型GFP发光较弱，荧光反应也不是酶反应，且不能通过 添加某些物质来加强信号,更不易对荧光进行定量检测。另外，GFP基因 在植物细胞内的表达频率并不高，甚至在某些植物细胞中并不表达。
三、MFTPS获得途径
3.1.6 Tissue Specific Expression（组织特异性）
应用实例
A、肿瘤特异性调控元件调控基因表达 许多肿瘤都有其自身特异性的标志物，即肿瘤相关抗原。将治疗 基因置于这类抗原的顺式调控元件（如启动子、增强子）的调控之下 ，可以使目的基因在相应的肿瘤细胞中获得高表达，正常细胞由于缺乏 与该顺式调控元件相应的转录激活因子等原因而不表达该基因。 B、组织特异性调控元件调控基因表达 这类调控元件与肿瘤特异性调控元件并没有严格的界限，外源基 因在组织特异性启动子调控下，可使基因治疗局限于发生癌变的组织 和器官中，而不至于给其它组织带来损害。 例如：Selvakumaran等 从鼠卵巢中分离得到462bp的卵巢特异性启 动子，并用于卵巢癌的基因治疗。
三、 MFTPS获得途径
3.1.3 Site-specific Recombination System（Cre/loxP）
三、 MFTPS获得途径
3.1.3 Site-specific Recombination System（Cre/loxP）
Cre重组酶介导两个LoxP位点间的重组是一个动态、可逆 的过程，可以分成三种情况：
安全选择标记和无选择标记 转基因技术研究进展
The Advances in Research of the Transgenic Plants with Safe or No Selection Markers
小组成员：窦富强、鄢苗、张哲、张作林 指导老师：张椿雨 教授
LOGO
引言
转基因植物的形成过程（以Bt抗虫棉为例）：
三、MFTPS获得途径
3.1.3 Site-specific Recombination System（Cre/loxP）
三、MFTPS获得途径
3.1.3 Site-specific Recombination System 应用实例：
Andrew等以pART27为骨架构建了一个ART54-PCre-1去标记系统， 其中pART54载体TDNA中含一个uidA报告基因，一个nptII选择标记基 因和一个指示删除反映的负标记基因codA，PCre载体是一个含有Cre基 因和hpt基因的双元载体。
三、MFTPS获得途径
3.2 Marker-free Mransformation(无标记转化）的转化技术
左键儒等发现在拟南芥中可利用化学调控(chemical-inducible),DNA位 点切除(site-specific DNA excision system)调控 Cre/loxP 载体DNA 重组 系统。重组酶的表达受雌激素载体融合XVE反式激活因子严格控制。 被感应到的ß -雌二醇，可标记编码序列，Cre和两个loxP端夹住的XVE 从拟南芥的基因组移除。
三、 MFTPS获得途径
3.1.4 Transposes Mediated Reorientation 应用实例：
金维正等（2003）， 利用了Ac/Ds转座系统获得了无选择标记基因 的转基因水稻；（目的基因转座） Ebinuma等（1997）和CotsafIis等（2002），就是采用标记基因转 座，得到了高转化频率且仅含有目的基因的转基因烟草和水稻。（标 记基因转座）
目前对烟草、拟南芥、水稻、玉米、油菜、大豆、小麦等都已成功。
不适于马铃薯、甘蔗等无性繁殖植物，不适于多年生植物。
三、 MFTPS获得途径
3.1.2 Homologous Recombination（同源重组）
同源重组发生在DNA的同源序列之间，只要两条DNA序列相 同或相近，重组就可以在此序列中的任何一点发生。