第八章酶工程
酶工程课件 5 第八章_酶定向进化
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8.2.2 基因体外随机突变方法--易错PCR技术
易错PCR应用实例
Chen.K和Arnold采用易错PCR对枯草杆菌蛋白酶进行了 体外进化研究。他们通过降低反应体系中dATP的浓度,对 编码该酶从第49位氨基酸到C端的DNA片段进行易错 PCR,经筛选得到的几个突变株在高浓度的二甲基甲酰胺 (DMF)中酶活性明显提高,其中突变体PC3在60%的DMF 中,酶活力是野生型的256倍。将PC3再进行两个循环的定 向进化,得到的突变体酶活力比PC3还要高3倍。
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生物的自然进化
➢进化过程：
突变→自然选择→遗传后代
➢进化结果：
基因多样性： 为完成同一功能所表现出的 多个 基因或同一个基因(同源性)
代谢途径的多样性： 同样产物，多条途径 代谢产物的多样性： 同一底物，不同产物
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如何利用相对简单快速的方法对天然 酶的改造或构建新的非天然酶？
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天然酶的局限性
酶催化的精确性和有效性常常不能很好地满足 酶学研究和工业化应用的要求 稳定性差 活性低使催化效率很低 缺乏有商业价值的催化功能
天然酶的局限性源于酶的自然进化过程。
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现代生物工程对酶的要求
1、能具备长期稳定性和活性 2、能适用于水及非水相环境 3、能接受不同的底物甚至是自然界不存在的合成底物 4、进一步增强酶对多种底物的分解能力
用于突变后的分子群，起着选择某一方向的进化而排 除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为 控制下进行的
《酶工程基本原理》课件
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降低杂质含量：通过优化分离纯化 技术，降低杂质含量，提高酶的纯 度
提高酶的稳定性：通过优化分离纯 化技术，提高酶的稳定性，延长酶 的保存时间
酶的生产与制备技 术
酶的生产方式
微生物发酵法：通过微生 物发酵产生酶
植物提取法：从植物中提 取酶
动物提取法：从动物中提 取酶
化学合成法：通过化学合 成产生酶
基因工程法：通过基因工 程产生酶
酶固定化技术：将酶固定 在载体上，提高酶的稳定 性和活性
酶的固定化技术
固定化酶的定义：将酶固定在载体上，使其保持活性并可重复使用的技 术 固定化酶的优点：提高酶的稳定性、可重复使用、降低成本
固定化酶的种类：吸附法、交联法、共价结合法等
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温度：酶的活性随温 度升高而增加，但超 过一定温度会失活
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pH值：酶的活性随 pH值变化而变化， 通常存在最适pH值
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离子强度：高离子强 度可能影响酶的活性， 导致酶失活
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酶浓度：酶的活性随 酶浓度增加而增加， 但超过一定浓度后不 再增加
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底物浓度：底物浓度 对酶的活性有影响， 通常存在最适底物浓 度
生物能源：用于生物燃料、 生物发电等领域
生物材料：用于生物材料合 成、生物材料改性等领域
酶的分类与性质
酶的分类
按照酶的来源分类： 动物酶、植物酶、 微生物酶
按照酶的催化反应 类型分类：氧化还 原酶、水解酶、转 移酶、裂解酶、异 构酶、连接酶
按照酶的活性中心 分类：金属酶、非 金属酶
按照酶的催化反应 机制分类：单酶、 多酶、复合酶
酶在食品加工中 的应用：酶在食 品加工中主要用 于提高食品品质 和营养价值，如 酶在食品发酵、 食品加工、食品 保鲜等方面的应 用。
酶工程
第一章绪论酶工程：酶的生产、改性和应用的技术过程。
酶的生产(enzyme production):通过各种方法获得人们所需的酶的技术过程，主要包括微生物发酵产酶、动植物培养产酶和酶的提取与分离纯化等。
酶的改性(enzyme improving ):通过各种方法改进酶的催化特性的技术过程，主要包括酶分子修饰、酶固定化、酶非水相催化和酶定向进化等。
酶的应用(enzyme application):通过酶的催化作用获得人们所需的物质或者除去不良物质的技术过程，主要包括酶反应器的选择与设计以及酶在各个领域的应用等。
酶工程的主要内容包括微生物细胞发酵产酶，酶的提取与分离纯化，酶分子修饰，酶、细胞和原生质体固定化，酶的非水相催化，酶反应器和酶的应用等。
酶工程的主要任务是经过预先设计，通过人工操作，获得人们所需的酶；并通过各种方法使酶充分发挥其催化功能。
酶是一类具有催化功能的生物大分子，亦称生物催化剂。
酶的分类：1、氧化还原酶（oxidoreductase）2、转移酶（transferase）3、水解酶（hydrolase）4、裂解酶（或裂合酶lyase）5、异构酶（isomerase）6、合成酶（synthease）或连接酶（ligase）酶的催化特性：高效性、高度专一性、反应条件温和且活力可调节影响酶催化反应速率的因素：底物浓度的影响，酶浓度的影响，pH、温度的影响，抑制剂的影响，激活剂的影响米氏方程式：[S]：底物浓度V：不同[S]时的反应速度V max：最大反应速度(maximum velocity)Ｋm：米氏常数(Michaelis constant)米氏常数Km的意义：☐重要特征物理常数，与酶浓度无关。
不同的酶具有不同K m值☐物理意义：Km等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。
☐Km值只是在固定的底物，一定的温度和pH条件下，一定的缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的Km值。
☐K m值近似等于[ES]的解离常数，可表示酶与底物之间的亲和力：K m值大表示亲和程度小，酶的催化活性低; K m值小表示亲和程度大,酶的催化活性高☐从k m可判断酶的专一性和天然底物。
酶工程
（二）酶的活力测定
1.酶活力与酶的活力单位 酶活力 (Enzyme activity)：在最适条件下(25C,最 适底物浓度和最适pH），酶催化一定化学反应的 能力，以酶促反应速率表示。
一般采用高底物浓度测定反应初速度，以定量酶浓度
酶活力单位表示方法：
酶活国际单位（IU)：在25˚C最适条件下（最适pH，最适底 物浓度），每分钟转化1µmol 底物为产物的酶量。1 IU = 1 µmol/min. Katal （简称Kat ）：在25˚C最适条件下，每秒钟转化 1mol 底物为产物的酶量。1Kat = 1mol/s. IU与Kat的换算：1Kat＝6×107IU
HOOCCH=CHCOOH H2O HOOCCH2CHCOOH OH
(5)异构酶 Isomerase • 异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即底物 分子内基团或原子的重排过程。 例如，6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应。
(6)连接酶 Ligase or Synthetase
• 连接酶，又称为合成酶，能够催化C-C、C-O、 C-N 以及C-S 键的形成反应。这类反应必须与 ATP分解反应相互偶联。 A + B + ATP + H-O-H ===A B + ADP +Pi
3
纯化
抽提液中除含有所需酶外，还含有其它大分子和小
分子物质。
常用分离纯化的方法： ①盐析法 ②有机溶剂沉淀
法③等电点沉淀法 ④吸附分离法等。
• 根据大小和形状： 离心；凝胶柱过滤；透析与超滤。 • 根据溶解度不同： 盐析（硫酸氨法）；有机溶剂沉淀；等电点沉淀； 大分子聚合物共沉淀。 • 根据电荷性质： 离子交换层析；等电聚焦；聚焦层析。 • 根据专一性结合： 亲和层析；免疫吸附层析；染料配体亲和层析；共 价层析。 • 根据稳定性差异： 热变性；酸碱变性。 • 分配系数：双水相萃取。
酶工程5 第八章_酶定向进化
Stemmer将DNA改组方法引用到酶分子定向进化中，
他用β内酰胺酶作为模型分子，对其正向突变库进行DNA改组，以逐 渐增加头孢氨00倍的突变体。
酶工程5 第八章_酶定向进化
主要内容
第一节 酶定向进化介绍 第二节 酶基因体外随机突变 第三节 酶突变基因的定向选择 第四节 酶分子定向进化的应用
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第一节 酶定向进化介绍
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获得具有新功能和特性的酶的途径 (1) 从大量未知的生物种系中寻找
(2) 改造现有已知的酶。
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定向进化研究的历史
1 萌芽阶段
首先在分子水平上进行改造单一分子的是Sol Spiegelman。在20世纪60年代,利用RNA噬菌体 Q进行的试验, 证明达尔文的自然选择也可在非细 胞体进行.
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2 奠基阶段
1981年，Hall B G等报道了他们定向改变了大肠杆 菌K12中的第二半乳糖苷酶的底物专一性，开发出对 几种糖苷键有水解能力的酶。
天然酶的作用
生物体系之所以能够相对独立地存在于自然界中， 并维持其独立性和生命的延续性，都是因为生物体内 的一系列酶在发挥着作用。
酶保证了生物体内组成生命活动的大量生化反应得 以按照预定的方向有序、精确而顺利地进行，几乎所 有生物的生理现象都与酶的作用紧密相关，可以这样 说，没有酶的存在，就没有生物体的一切生命活动。
HallB G等利用lacz缺陷型的菌株为宿主菌，分别在含有某种碳源的培养 基上培养．从酶的自发突变库中筛选出分别可以水解半乳糖、乳果糖、乳 糖酸的突变酶，而野生型的酶不能水解这些底物。
第八章酶工程
按现代观点，酶工程主要包括以下内容 ① 酶的大量生产和分离纯化及它们在细胞外的应用 ② 新颖酶的发现、研究和应用 ③ 酶的固定化技术和固定化酶反应器 ④ 基因工程技术应用于酶制剂的生产与遗传修饰酶的研究 ⑤ 酶分子改造与化学修饰以及酶结构与功能之间关系的研究 ⑥ 有机介质中酶的反应 ⑦ 酶的抑制剂、激活剂的开发及应用研究 ⑧ 抗体酶、核酸酶的研究 ⑨ 模拟酶、合成酶以及酶分子的人工设计、合成的研究
第八章-酶工程
2023/12/28
第八章酶工程
酶工程
一． 概述 二． 酶的命名和分类 三． 酶的化学本质、来源和生产 四． 酶催化反应机理及反应动力学 五． 酶的固定化和固定化酶反应器 六． 酶工程的应用 七． 酶工程的研究进展
第八章酶工程
一 酶和酶工程的概述
（一）、 酶的概念 （二）、 对酶的认识和研究历程 （三）、 酶工程的概念
通过适应、诱导、诱变以及基因工程等方法 培育出新的高产酶的菌株。
第八章酶工程
微生物细胞产生的酶分类 结构酶：在细胞的生长过程中出于其自身需要而表达， 诱导酶：加入相应的诱导剂后才会表达，诱导剂一般是
该酶所催化反应的底物或产物。 一般而言，野生型微生物需要经过遗传改造后，才能变
为高产酶的菌株。其方法包括 ① 物理诱变育种 ② 化学诱变育种 ③ 基因工程构建
第八章酶工程
3）发酵条件控制 营养条件 环境条件，注意溶氧浓度、温度、pH值 特别注意剪气力对蛋白质的影响，因为在高剪
切力下，蛋白质容易失活。 注意发酵的泡沫，因为蛋白质是表面活性剂，
大量的蛋白质积累在发酵液中使得在鼓泡条 件下很容易形成泡沫，影响发酵正常操作。 因此应该考虑除泡装置，并添加消泡剂。
第八章酶工程
酶的化学本质和作用特点
位于活性中心以外，维持酶活性中心应有的空间构象所必需。
活性中心外的必需基团
01
02
03
04
05
底 物
活性中心以外的必需基团
结合基团
催化基团
活性中心
靠近效应
定向效应 锁钥学说 诱导嵌合学说 张力作用 酸碱催化作用 共价催化作用
1
2
酶作用的辅助因素
底物与酶结合诱导酶的分子构象变化，变化的酶分子又使底物分子的敏感键产生“张力”甚至“形变” ，从而促使酶－底物中间产物进入过渡态。
酶 活 性
0.5
1.0
2.0
1.5
0 10 20 30 40 50 60
温度 ºC
温度对淀粉酶活性的影响
pH对酶促反应的影响
1.最适pH
2.pH稳定性
表现出酶最大活力的pH值
在一定的pH范围内酶是稳定的
pH对酶作用的影响机制： 1.环境过酸、过碱使酶变性失活； 2.影响酶活性基团的解离； 3.影响底物的解离。
S
P
（1）
（2）
由于酶催化的反应（2）的能垒比没有酶催化的反应（1）要低，反应（2）所需的活化能亦比（1）低，所以反应速度加快。
反应总能量改变
非催化反应活化能
酶促反应 活化能
一般催化剂催 化反应的活化能
能 量
反 应 过 程
底物
产物
酶促反应活化能的改变
“张力”和“形变” ：
临近定向效应：
在酶促反应中，底物分子结合到酶的活性中心，一方面底物在酶活性中心的有效浓度大大增加，有利于提高反应速度； 另一方面，由于活性中心的立体结构和相关基团的诱导和定向作用，使底物分子中参与反应的基团相互接近，并被严格定向定位，使酶促反应具有高效率和专一性特点。酶作用的辅助因素3
酶工程总结PPT课件
酶的分子改造技术
酶的分子改造技术是通过化学或生物 方法对酶的分子结构进行修饰和改造， 从而改变酶的催化性质和功能的技术。
酶的分子改造技术包括化学修饰、定 向进化、点突变等关键技术，这些技 术的应用能够优化酶的催化性能和稳 定性，提高酶的生产效率和降低成本。
THANKS
生物能源开发
酶工程技术可用于生物能源开发，如生物柴油、生物 酒精等。
06
酶工程的前景与挑战
酶工程的发展前景
酶工程在工业生产中的应用前景广阔，特别是在生物制药、生物燃料、环保等领域。
随着酶工程技术的不断进步，酶的产量、活性和稳定性将得到进一步提高，为工业 生产提供更高效、环保的解决方案。
酶工程在医疗领域的应用前景也十分看好，例如用于药物设计和开发、疾病诊断和 治疗等。
环保领域的应用
有毒有害物质降解
01
酶工程技术可用于降解有毒有害物质，如重金属、有机污染物
等。
废水处理
02
酶工程技术可以用于废水处理，通过酶促反应将废水中的有机
物转化为无害物质。
生物修复
03
酶工程技术可用于生物修复，通过酶促反应降解污染物，恢复
生态环境。
食品工业领域的应用
食品添加剂生产
酶工程技术在食品添加剂生产中发挥着重要作用，如生产甜味剂、 防腐剂等。
专一性
一种酶通常只能催化一种或一类化学反应，具有明显的专一性。
不稳定性
大多数酶是蛋白质，容易受温度、pH、重金属离子等环境因素的影响，表现出不稳定性。
酶的活性调节
1 2
共价修饰
酶工程
②降低阻遏物浓度：设法从培养基中除去其终产物，以消除反馈阻遏；向培养基中加入代谢途径的某个抑制因子，切断代谢途径通路，可限制细胞内末端产物的积累，便可达到缓解其反馈阻遏的目的；
③促进分泌；
④添加产酶促进剂。
2、酶反应器的类型：
①搅拌罐型：分批反应器和连续流搅拌罐反应器；②固定床型；③流化床型；④膜式反应器；⑤鼓泡塔型；⑥连续搅拌罐式超滤型；⑦循环床型；⑧其他酶反应器。喷射式反应器
3、酶反应器的选择：（底物或产物的理化性质）
①酶催化反应产物的相对分子质量较大时，由于产物难于透过超滤膜的膜孔，不能达到反应与分离同时进行的目的，所以一般不用膜反应器；
⑵遗传控制：①改良菌种：使诱导型变为组成型；使阻遏型变成去阻遏型；②基因工程育种。
5、用于产酶细胞需具备哪些条件：
①酶的产量高；②容易培养和管理；③产酶性能稳定；④利于酶产品的分离纯化；⑤安全可靠。
第四章 酶的分离和纯化
1、细胞破碎方法：
①机械法：机械捣碎法、研磨破碎法、匀浆破碎法、改进高压法（X-press法）、超声波破碎法；
①网格型包埋法：
②微囊型包埋法：
③脂质体包埋法：
4、酶的各种固定化方法的比较：
固定化方法 载体结合法 交联法 包埋法
物理吸附法 离子结合法 共价结合法
制备难易 易 易 难 较难 较难
结合程度 弱 中等 强 强 强
酶活回收率 高，但酶易流失 高 低 中等 高
对底物专一性 不变 不变 可变 可变 不变
⑵交联法：利用双功能或多功能试剂在酶分子间，酶分子与惰性蛋白间或酶分子与载体间进行交联反应，以共价键制备固定化酶的方法。优点：操作简便；缺点：交联反应的过程往往比较激烈，许多酶易在固定化过程中失效，酶回收率不高。
《酶工程绪论》课件
酶工程的研究内容
酶的性质和功能研究酶的催化机制研究 酶的工程化改造研究 酶的工业应用研究
酶工程的应用领域
生物医药：用于药物合成、基因工程、 生物制药等领域
食品工业：用于食品加工、食品添加剂、 食品保鲜等领域
生物能源：用于生物燃料、生物发电等 领域
环境保护：用于污水处理、废物处理、 环境监测等领域
环境保护：固定化酶在 环境保护领域也有应用， 如酶催化污水处理、酶 催化土壤修复等。
生物传感器：固定化酶 在生物传感器领域也有 应用，如酶催化生物传 感器、酶催化生物检测 等。
酶反应器和酶传 感器
酶反应器的类型和特点
固定床反应 器：结构简 单，操作方 便，但传质 效果较差
流化床反应 器：传质效 果好，但设 备复杂，操 作难度大
酶反应器和酶传感器的设计和优化
酶反应器设计：考虑酶的活性、稳 定性、反应条件等因素
优化方法：通过实验和数据分析， 优化酶反应器和酶传感器的性能
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酶传感器设计：选择合适的酶、传 感器材料和信号处理方法
应用领域：生物制药、环境监测、 食品加工等领域
酶工程的未来发 展与挑战
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按照酶的催化机制分 类：共价催化酶、非 共价催化酶
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按照酶的底物特异性 分类：单底物酶、双 底物酶、多底物酶
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按照酶的催化反应类 型分类：氧化还原酶、 转移酶、水解酶、裂 解酶等
酶的性质
酶是一种生物 催化剂，能够 加速生物化学
反应的速度
酶具有高度的 特异性，只能 催化特定的化
学反应
食品工业领 域：酶在食 品加工、食 品保鲜、食 品添加剂等 方面的应用
酶工程最终版
绪论1.何谓酶工程, 试述其重要内容和任务。
酶的生产、改性与应用的技术过程称为酶工程。
酶工程的重要内容涉及: 微生物细胞发酵产酶, 动植物细胞培养产酶, 酶的提取与分离纯化, 酶分子修饰, 酶、细胞、原生质体固定化, 酶非水相催化, 酶定向进化, 酶反映器和酶的应用等。
酶工程的重要任务是通过预先设计, 通过人工操作获得人们所需的酶, 并通过各种方法使酶的催化特性得以改善, 充足发挥其催化功能。
2.酶有哪些显著的催化特性？酶是生物催化剂, 与非酶催化剂相比, 具有专一性强、催化效率高和作用条件温和等显著特点。
3.简述影响酶催化作用的重要因素。
酶的催化作用受到底物浓度、酶浓度、温度、pH、激活剂浓度、克制剂浓度等诸多因素的影响。
5.简述酶活力单位的概念和酶活力的测定方法。
酶活力单位: 在特定条件下（温度可采用25℃, pH等条件均采用最适条件）, 每1min催化1μmol的底物转化为产物的酶量定义为1个酶活力单位, 这个单位称为国际单位（IU）。
在特定条件下, 每秒催化1mol底物转化为产物的酶量定义为1卡特（kat）酶活力的测定方法：振荡测定法, 酶柱测定法, 连续测定法, 固定化酶的比活力测定, 酶结合效率与酶活力回收率的测定, 相对酶活力的测定。
或者测定方法：化学测定法、光学测定法、气体测定法其它.酶的发展历史: 4000数年前的夏禹时代——酿酒技术。
3000数年前的周朝——制造饴糖、食酱等食品。
1833年——佩恩和帕索兹从麦芽的水抽提物中得到淀粉酶。
19世纪中叶——巴斯德对酵母的乙醇发酵进行研究。
192023——米彻利斯和曼吞根据中间产物学说, 推导出米氏方程。
1926年——萨姆纳得到脲酶结晶, 并证明它具有蛋白质的性质。
1960年——雅各和莫诺德提出操纵子学说。
1982年——切克发现核酸类酶。
1983年——阿尔特曼发现核糖核酸酶P的RNA部分M1RNA具有核糖核酸酶P的催化活性。
酶的专一性分为绝对专一性和相对专一性。
酶工程
一、绪论1、生物催化：利用酶或有机体（细胞或细胞器）等）作为催化剂实现化学转化（通常是加快）的过程。
2、生物催化与发酵：1、发酵：用活细胞，将原材料转化成更复杂的目标产物。
2、前体发酵：发酵过程中添加前体物质，并有活细胞将其转化为目标产物。
3、生物转化：用酶或静息细胞经过一系列步骤，将前体转化成目标产物。
4、生物（酶）催化：提取酶或部分纯化的酶，将底物转化成目标产物。
3、酶工程：应用目的出发研究酶，在一定的生物反应装置中利用酶的催化性质，将相应原料转化成有用的物质。
是酶学和工程学相互渗透结合形成的一门新的技术科学，是酶学、微生物学的基本原理与化学工程有机结合而产生的边缘科学。
4、酶工程研究内容：（一）酶的生产（二）化学酶工程（三）生物酶工程（四）酶反应器（五）酶反应介质（六）酶的应用5、酶反应器：活塞流反应器全混流反应器流化床反应器固定床反应器膜反应器二、酶学概述6、酶的分类：（一）按酶催化反应的类型分类1、氧化还原酶2、转移酶3、水解酶4、裂合酶5、异构酶6、连接酶（合成酶）1．氧化还原酶: 催化氧化-还原反应，转移氢或加氧。
主要包括脱氢酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)、过氧化氢酶、氧合酶、细胞色素氧化酶。
例如，乳酸(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢反应2、转移酶: 转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。
参与生物物质的代谢.(例如，谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。
) 3、水解酶:水解酶催化底物的加水分解反应（或逆反应）。
主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。
例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反应。
4、裂解酶：裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆反应。
5、异构酶：此类酶为生物代谢需要对某些物质进行分子异构化，分别进行外消旋、差向异构、顺反异构等，分为差相异构酶、消旋酶、顺反异构酶等。
6、连接酶（合成酶）：能够催化C-C、C-O、C-N 以及C-S 键的形成反应。
第八章 现代酶工程技术
Flash1
(四） L-苹果酸生产
L—苹果酸是一种重要的有机酸， 在医药和食品工业中有广泛用途。L— 苹果酸生产途径有（1）用葡萄糖直接 发酵：（2）用延胡索酸为原料酶法合 成；目前国内L—苹果酸工业化生产主 要是用延胡索酸为原料的酶法合成。普 遍使用的包埋载体是卡拉胶（K— carrageenan）。
•
三、 固定化酶技术 （一）固定化技术概述 （二）酶和菌体固定化技术 （三）固定化细胞的反应器
☆
（一）固定化技术概述
• 概说：酶已广泛应用工业及家庭日常生活 中。如 • 1、淀粉酶都采用酸解法，现在很多都用 酶解法。家庭所用甜酒药就是根霉。我们 知道还有 • 2、蛋白酶（如酱油、豆腐乳等）； • 3、果胶酶（如酒类澄清、白莲脱皮）； • 4、脂肪酶（如皮毛脱脂）等。
2．酶促效率明显提高 和固定化酶不同，菌体细胞在固定 化过程中通常不损伤细胞本身，细 胞内的酶系统也最大限度地保持着 天然状态，因此它具有较高的酶促 效率。
3．热稳定性增强 如恶臭假单孢菌经包埋后 最适反应温度较游离细胞提高 20℃，而且热稳定性也增强。
4．易产生副反应
微生物菌体细胞内含有庞大而复杂的酶系 统，其中一些酶在生产时是我们不需要的， 某些酶甚至是有害的，它们可催化生产影 响产品质量的物质。如包埋黄色短杆菌 （产延胡索酸酶）生产L—苹果酸时，便有 副产物琥珀酸产生，它是影响产品出口的 主要因素。生产上一般采用胆汁酸处理固 定化细胞，可显著降低琥珀酸的含量。
（四）菌体包埋 （1）卡拉胶熔化 生理盐水500Kg，卡拉胶20Kg， 加入1.5m3的搪瓷罐中，开搅拌， 夹套加热，升温到100℃，保温 10min，卡拉胶彻底熔化。降温到 50℃，夹套保温备用。
（四）菌体包埋 （2）混合 湿菌体114Kg，加100Kg生理盐水 放另一搪瓷罐中混匀，保温45℃， 然后压入卡拉胶罐中，恒温45℃， 搅拌10min。
酶工程
酶分子修饰定义通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的催化特性的过程称为酶分子的修饰。
为什么酶经过长时间的进化，长期在生物内存在和引起催化作用，对生物体内环境较为适应，而人们对酶应用时，其环境条件并非与生物体内环境条件一致，导致酶的稳定性差，催化效率不够，应用受到限制。
作用：通过酶分子修饰，可以使酶分子的结构发生某些合理的改变，就可以提高酶的催化效率，增强酶的稳定性，降低或消除酶的抗原性，改变酶的底物专一性等，同时研究和了解了酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响。
方法：主链修饰、侧链修饰、金属离子置换、物理方法、化学方法金属离子置换作用：提高催化效率稳定性，改变动力学特性，阐明金属离子的作用物理修饰：高温高压高盐低压失重极端ph用盐酸胍使胰蛋白酶原有构象破坏。
透析除去变性剂，使酶重新构建新的空间构象。
50摄氏度下构建的酶比天然酶稳定性提高五倍。
酶的固定化为什么：酶的稳定性差。
一次性使用，催化产物分离纯化较为困难定义固定在不溶性载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶.缺点：酶活有损失，不适用于大分子底物酶。
方法吸附固定化载体100-20um有点操作简便条件温和不会引起酶或细胞的变性失活，载体廉价易得可以反复使用缺点物理吸附力，结合力较弱，结合不牢固易脱落。
包埋技术凝胶包埋是应用最广泛的方法。
结合固定化技术共价键或离子键结合一起的技术交联固定化技术双功能试剂使酶分子发生交联，结成网状的固定化酶半透膜包埋热处理固定化使酶固定在菌体内。
葡萄糖异构酶生产规模最大的固定化酶采用热处理法固定在菌体上青霉素酰化酶：多种方法延胡索酸酶:聚丙烯酰胺凝胶包埋角叉菜胶包埋天冬酰胺-β-脱羧酶凝胶包埋固定酶非水相催化酶在非水介质中催化作用，通过反应介质的改变，使酶的表面结构和活性中心发生某些改变，从而改进酶的催化特性非水介质：有机溶剂解质超临界流体气相介质离子液介质特点热稳定性提高催化活性有所降低水解酶可以在非水介质中催化水解反应的可逆反应非极性底物或产物的溶解度增加底物的特异性和选择性有所改变有机介质应用最广泛有机介质反应体系微水介质微量的水主要是酶分子的结合水，他对维持酶分子的空间构象和催化活性很重要的作用。
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3）发酵条件控制 营养条件 环境条件，注意溶氧浓度、温度、pH值 特别注意剪气力对蛋白质的影响，因为在高剪
切力下，蛋白质容易失活。 注意发酵的泡沫，因为蛋白质是表面活性剂，
大量的蛋白质积累在发酵液中使得在鼓泡条 件下很容易形成泡沫，影响发酵正常操作。 因此应该考虑除泡装置，并添加消泡剂。
第八章酶工程
如 EC1.1.1.27 为乳酸：NAD+氧化还原酶 EC1.1.1.37 为苹果酸：NAD +氧化还原酶 EC1.1.1.1 为乙醇：NAD +氧化还原酶
第八章酶工程
（三）、国际系统命名法
要求确切表明底物的化学本质及酶的催化性质。 原则如下：
1 酶的系统命名有两部分构成：底物名称（底 物1：底物2） ＋反应名称
第八章酶工程
3. 酶的作用专一性。通常把酶作用的物质称为该酶的底物 （substrate)。一种酶只作用于一种或一类底物。
① 反应专一性（键专一性）：这些酶的专一性较低，能够催 化具有相同化学键或基团的底物进行某种类型的反应。如 酯酶
② 底物专一性：只能催化特定底物发生特定的反应。如脲酶 只能催化尿素，而且只能是水解反应
第八章酶工程
按现代观点，酶工程主要包括以下内容 ① 酶的大量生产和分离纯化及它们在细胞外的应用 ② 新颖酶的发现、研究和应用 ③ 酶的固定化技术和固定化酶反应器 ④ 基因工程技术应用于酶制剂的生产与遗传修饰酶的研究 ⑤ 酶分子改造与化学修饰以及酶结构与功能之间关系的研究 ⑥ 有机介质中酶的反应 ⑦ 酶的抑制剂、激活剂的开发及应用研究 ⑧ 抗体酶、核酸酶的研究 ⑨ 模拟酶、合成酶以及酶分子的人工设计、合成的研究
第八章酶工程
二 酶的命名和分类
（一）、习惯命名法 （二）、国际系统分类法 （三）、国际系统命名法 （四）、同工酶 （五）、酶的活力和活力单位
第八章酶工程
（一）、习惯命名
惯用名 常依据酶所作用的底物和反应类型命名。 原则： （1）根据作用底物：如淀粉酶、蔗糖酶、蛋白酶等。 （2）根据反应性质：如水解酶、脱氢酶、转氨酶等。 （3）二者结合：如乳酸脱氢酶、谷丙转氨酶等。 （4）再加上酶的来源、特性：如木瓜蛋白酶、胃蛋白
生有毒物质和其他生理活性物质 ⑤ 不产或尽量少产蛋白酶
第八章酶工程
一些常用微生物及它们所产生的酶
第八章酶工程
2. 酶的生产
影响酶生产的主要因素 1）培养基设计：设计好供微生物生长、繁殖、代谢和合成代谢产物
的营养物质和原料。其中诱导酶的生产，需要加入诱导剂 2）发酵方式的选择： ① 固体发酵：又称为表面培养或曲式培养，以麸皮、米糠等为基本
v 同工酶的命名，在系统或习惯命名中，都是一 样的。
第八章酶工程
（五）、酶的活力和活力单位
酶的活力：指酶催化特定底物转化成产物的速率。 酶的活力常常是制订酶制剂价格的最重要的参考指标 影响酶的活力因素，包括环境条件、底物性质、酶本
身因素等因素 酶活力单位：指单位时间、单位质量酶蛋白所催化的
底物反催化剂
第八章酶工程
三、酶化学本质、来源和生产
（一）酶的化学本质 （二）酶的来源和生产
第八章酶工程
（一）酶的化学本质
除了核酸酶之外，酶都是具有催化功能的蛋白 质。
1 蛋白质的性质
第八章酶工程
2、酶的化学组成
1 按组成成分 （1）单纯酶：其活性仅仅取决于蛋白质结构，如脲酶、蛋白酶、
淀粉酶、脂肪酶及核糖核酸酶。 （2）结合酶：只有结合非蛋白组分后（辅助因子）后才表现出活
原料，加入适量的无机盐和水作为培养基进行产酶微生物菌种培 养的一种培养技术。 ② 特点：设备简单、便于推广，特别适合于霉菌， ③ 缺点: 发酵条件不易控制，物料利用不完全，劳动强度大，容 易染菌等。 ② 液体深层发酵：又称浸没式培养，利用液体培养基，在发酵罐内 进行的一种搅拌式通气培养方式，发酵过程需要一定的设备和技 术条件，动力消耗也较大，但是原料的利用率和酶的产量都较高。 ③ 目前，工业上主要采用液体深层发酵技术生产酶，但是在酒曲培 养、食品工业及一些用于饲料添加剂的酶生产中，仍在应用固态 发酵技术。
第八章酶工程
（三）、 酶工程的概念
v 酶工程：工业上有目的地设计一定的反应器 和反应条件，利用酶的催化功能，在常温常 压下催化化学反应，生产人类需要的产品或 服务于其它目的的一门应用技术。广义地讲 还包括酶的生产、分离和纯化。
国际酶工程学会（1971年）定义：是研究和开 发酶的生产、酶的分离纯化、酶的固定化、 酶及固定化酶的反应器、酶与固定化酶的应 用等的工程科学。
随着产物初始浓度的下降呈指数式上升。 ② 细胞破碎液或发酵液存在大量与目标酶蛋白
性质类似、分子量接近。 ③ 酶对环境条件敏感，环境中的蛋白酶容易作
用于目标酶，使其失活。
第八章酶工程
3）在实现目的的情况，可直接用整个细胞作为 生物催化剂
① 细胞内目标酶的活性很高，可以满足工业过 程对酶活的要求
② 胞内酶的催化作用必须依赖于辅酶，可以利 用细胞内的辅酶再生系统
第八章酶工程
3. 酶的分离和提纯
1）酶的用途及对酶纯度的要求： 科学研究——需要最高的纯度，必要时需要结晶 医用——需要很高的纯度，避免不良反应 食品工业——在安全性的基础上，纯度可低一些 工业用——在达到一定酶活性的基础上，对纯度
要求不高
第八章酶工程
2）酶的分离提纯在酶生产中投入成本很大 ① 蛋白酶的浓度很低，而分离提纯的费用往往
第八章酶工程
（一）、 酶的概念
酶是生物催化剂，主要是蛋白质，也有核 酸，能在比较温和的条件下高效率的起催化 作用，使生物体内的各种物质处于不断的新 陈代谢中。
生物体内→新陈代谢→各种化学反应→条 件温和（37℃，近中性），速度快，有条不 紊。
第八章酶工程
（二）、 对酶的认识和研究历程
v 人们对酶的认识起源于生产实践，人类几千年前，都开始制 作发酵及食品。
1. 反应条件温和：常温、常压、接近中性的pH值
2. 催化效率高。以分子比表示，酶催化比非催化的反 应速度高108－1020倍，比其他催化反应高107－ 1013。
3.
举例1：H2O2→H2O＋O2 （ⅰ）Fe2+催化 H2O2E催化105mol/sE的催化能力高1010倍
10-5mol/s
（ⅱ）
举例2：已知催化反应最快的是碳酸酐酶。 水CO碱2＋H2HC2OO3比→非H酶2C催O3化快107每倍个。E分子每秒可催化6×105个CO2分子与
第八章酶工程
优良菌种的条件 ① 繁殖快、产酶量高、酶的性质符合使用要求，而且最
好能产生分泌到胞外的酶，产生的酶容易分离纯化 ② 菌种不易变异退化，产酶性能稳定，不易受噬菌体的
感染侵袭 ③ 易于培养，能够利用廉价的原料进行酶的生产，并且
发酵周期短。 ④ 菌种不是致病菌，在系统发育上与病原体无关，不产
酶、酸性磷酸酯酶、碱性磷酸酯酶等。
第八章酶工程
（二）、国际系统分类法
根据反应性质分为六大类 1、氧化还原酶类：催化氧化还原反应，涉及H
和电子的转移。如脱氢酶类。
2、转移酶类：催化分子间功能基团的转移。如 转氨酶类。
第八章酶工程
3．水解酶类：催化水解反应。如蛋白酶、淀粉 酶、脂肪酶、蔗糖酶等。
4．裂合酶类：催化非水解地除去底物分子中的 基团及其逆反应的酶。如醛缩酶脱氨酶 脱羧 酶
③ 所需要的生物转化过程需要细胞内几种酶的 共同参与
第八章酶工程
4）酶的分离提纯的步骤 在此过程中，保持酶的活性是最为关键的。因此，全部操作必
须在低温下进行，一般在0～5℃间，还要防止重金属失活、 防止－SH被氧化，不能过度搅拌等
第八章酶工程
细胞破碎的方法： 动物细胞比较容易破碎，通过一般的研磨器、
第八章酶工程
5．异构酶类：催化同分异构体的相互转变。
6、合成酶：与ATP 分解相偶联，并由二种物 质合成一种物质。如天冬酰胺合成酶 丙酮酸 羧化酶
第八章酶工程
在每一大类酶中，又根据底物中被作用的基 团或键的特点分为若干亚类，然后再把属于 某一亚类、亚亚类的酶按顺序排好，这样把 已知的酶分门别类地排成一个表，叫做酶表。 v 类 亚类 亚亚类 序号
第八章-酶工程
2020/12/12
第八章酶工程
酶工程
一． 概述 二． 酶的命名和分类 三． 酶的化学本质、来源和生产 四． 酶催化反应机理及反应动力学 五． 酶的固定化和固定化酶反应器 六． 酶工程的应用 七． 酶工程的研究进展
第八章酶工程
一 酶和酶工程的概述
（一）、 酶的概念 （二）、 对酶的认识和研究历程 （三）、 酶工程的概念
通过适应、诱导、诱变以及基因工程等方法 培育出新的高产酶的菌株。
第八章酶工程
微生物细胞产生的酶分类 结构酶：在细胞的生长过程中出于其自身需要而表达， 诱导酶：加入相应的诱导剂后才会表达，诱导剂一般是
该酶所催化反应的底物或产物。 一般而言，野生型微生物需要经过遗传改造后，才能变
为高产酶的菌株。其方法包括 ① 物理诱变育种 ② 化学诱变育种 ③ 基因工程构建
③ 等电沉淀法：调节到PI使之絮聚、沉降。 ④ 层析法：亲和层析，离子交换层析，凝胶过滤
曾析，吸附层析等
v 酶的保存：低温、干燥、避光、避氧。
第八章酶工程
四、酶催化反应机理及反应动力学
（一）酶催化反应的特点 （二）酶催化反应的机理 （三）酶催化反应的速率理论 （四）酶促反应动力学
第八章酶工程
（一）酶催化反应的特点
v 1833 年，Pagon Persoz 从麦芽中得到一种能水解淀粉的物 质——淀粉酶。
v 1878 年，Kühne 将这类生物催化剂统称为“酶”（Enzyme） v 1887年，Buechner兄弟发现不含酵母细胞的酵母提取液也
能使糖生成酒精，证实了发酵与细胞活力无关，并表明了酶 能以溶解的、有活性的状态从破碎的细胞中分离出来。 v 1926 年，Sumner 从刀豆中提取脲酶，得到结晶，证明是蛋 白质。后来，先后获得胃蛋白酶，胰蛋白酶的结晶 v 1969 年人工合成牛胰核糖核酸酶。 v 1983 年，发现核酸的催化功能——1989 获诺贝尔奖