产纤维素酶真菌混合发酵研究进展

$ $ 纤维素是自然界存在的最多的一类可再生资 源，国内外许多学者就如何利用农作物秸秆生产纤 维素酶进行了一系列的研究和探索。全世界农作物 秸秆年产量超过 "& 亿 1。我国也有数亿吨的年产 量，其中 0%2 3 0.2 作为燃料补充农村能源不足， !%2 以烧荒形式烧掉，只有很少一部分过腹还田或
［ !］ 直接还田 。目前，对于如何将秸秆合理利用的
［ %］ 了国内常用的大部分属的真菌 。此外，利用反
刍动物瘤胃真菌用于纤维素材料发酵研究国内也已
［ -］ 开展 。在所有产纤维素酶真菌中，木霉菌（ !"#$
%&’()"*+ ） 是 公 认 的 较 好 的 纤 维 素 酶 生 产 菌。另 外，青霉 属 （ ,)-#%#..#/* ） 、 曲 霉 属 （ 012)"3#../1 ） 和镰刀菌属（ 4/1+"#/*） 的一些类群降解纤维素的 能力也较强。能产生纤维素酶的细菌种类虽远不如 真菌多，但已有报道的食纤维菌属（ 567’2&+3+ ） 、 生孢食纤维菌属（ 82’"’%67’2&+3+ ） 、多囊纤维菌属 （ ,’.6+-3#/*%)../.’1/* ） 等属细菌均有较强分解纤
［ +, ］
物生长发育，也能加强其他根际微生物的生命活 动。而土壤中的有机质约一半是纤维素，纤维素分 解菌可以将这些物质分解成简单的物质，作为固氮 菌的碳源。 20 产纤维素酶真菌混合发酵工艺 2/ -0 物料处理 作物秸秆结构复杂，在发酵前必须进行粉粹， 以减少颗粒度、增加酶解反应的表面积，同时还要 预处理，使得纤维素、半纤维素、木质素分离，切 断它们的氢键，破坏晶体结构，降低聚合度，才能 使后续的酶解反应更顺利进行。常见的预处理方法 有蒸汽爆破法（ ’5(&6 (789:’;:< ） 、酸处理法、碱处
微生物对纤维素的降解，就是通过分泌到胞外的游 离纤维素酶，以水解酶机制和氧化酶机制降解纤维
［ 0］ 素 。
研究主要集中在如下 ’ 方面：直接将秸秆还田，以 增加土壤肥力；利用微生物发酵农作物秸秆，生产 纤维素酶和蛋白饲料；用秸秆材料生产酒精和甲烷 等工业产品。其中，我国在混菌发酵以提高纤维素 酶活力的菌株选育、发酵工艺方面做了大量工作， 但在国外少见报道。 !$ 纤维素的生物降解 !# !$ 纤维材料的降解方式 自然状态下，纤维素降解主要通过 ’ 种方式： 物理方式，包括粉碎、蒸煮、热喷等；化学方式， 包括酸性水解、碱性水解、氨化和氧化降解；还有 就是微生物降解。物理方法处理秸秆，只能略为提 高半纤维素的消化率，对纤维素和木质素的作用不 大，对秸秆的营养价值和消化率的提高无甚实效。 化学方法能破坏木质素与多糖之间的酯键结合，使
［ 65 ］ 究，但仍无重大突破。 H)*E*I&>&E 在研究纤维杆
菌（ 9-6646%&%’*(） 的纤维素发酵实验时，发现当 加入一种产碱杆菌（ 26#*6"3-’-( ） 时，因为该菌降 低了纤维二糖对纤维素酶的抑制作用，而使得蛋白 质产量有了明显增加。J(*’()>$E 用木霉和两种酵母
［ 61 ］ 菌也得到了类似的结果 。国内也已有人利用微
［ 10 ］
等都能产生纤维素酶，但昆虫产酶少，现在生产纤 维素酶主要用微生物发酵生产。目前，微生物生产 纤维素酶主要有固态发酵和液态发酵两种方法。纤 维素的降解需要 4 种酶系协同作用，因而采用单菌 产纤维素酶再用酶降解纤维素的工艺，在实践中被 证明有很大的局限性。比如，人们公认的较好的纤 维素酶生产菌绿色木霉（ 0$"#1%:-$&* B"$":- ） 及其 近缘菌株，普遍存在产生的 ! B 葡萄糖苷酶活性偏 低的缺陷。到目前为止，人们已经在提高纤维素酶 活性、高酶活菌株选育及发酵工艺方面作了大量研
中国土壤与肥料$ "&&. （0）
产纤维素酶真菌混合发酵研究进展
" 陈璘娜!， ，顾金刚" ，徐凤花! ，姜瑞波"
（ !# 东北农业大学资源与环境学院，黑龙江$ 哈尔滨$ !%&&’& ； "# 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 ( 中国农业微生物菌种保藏管理中心，北京$ !&&&)! ）
摘$ 要：总结了常见的分解纤维素真菌种类，并介绍了纤维素酶生产的方法。传统的利用单一菌种发酵纤维素 材料的方法存在降解率低，发酵时间长等缺陷。而利用微生态原理，使用多个菌种进行混合发酵的方法被证明 可以有效降解纤维素。重点介绍了固态混合发酵和液体混合发酵的工艺，并对产纤维素酶真菌混合发酵的前景 作了预测。 关键词：混合发酵；秸秆；纤维素酶；固态发酵；液态发酵 中图分类号：*+’+# %$ $ $ 文献标识码：,$ $ $ 文章编号：!-.’ / -"%. （ "&&. ） &0 / &&!- / &-
［ .］ 维素的能力 。能分解纤维素的放线菌有分枝杆
收稿日期："&&- / &" / !作者简介：陈璘娜（ !+)! / ） ，女，黑龙江哈尔滨人，东北农业 大学资源与环境学院，硕士研究生，专业方向为农业 微生 物。 顾金刚为通讯作者。
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中国土壤与肥料2 6559 （8） 菌属（ !"#$%&#’()*+, ） 、诺 卡 氏 菌 属（ -$#&).*& ） 、 小单孢菌 属（ !"#$%&%’%()%$* ） 、链 霉 菌 属（ +,$-).
生态原理提高纤维素酶活性的探索，张海、张苓花 和司美茹等人研究表明，利用木霉生产纤维素酶 时，添加曲霉和酵母菌可以提高纤维素酶活性，并
［ 66 B 68 ］ 有效抑制杂菌生长 。当单菌发酵生产纤维素
。酶解纤维素时，对无定
形区仅 DG 即可使之水解，对于结晶区需要有 DG 和 ?@A 的协同作用。因此，在纤维素溶解糖化过 程中 DG 与 ?@A 的比值会显著地影响纤维素溶解 活力，而且在纤维素糖化过程中 ?@ 组分的加入会 使这种协同作用大大加强。但是， ?@ 与 DG， ?@ 与 ?@A 的协同作用都很弱。 1: 82 纤维素酶的生产 虽然纤维素酶的来源非常广泛，昆虫、微生物
酶工艺遇到困难后，人们又转向研究如何以科学的 菌种组合进行混合发酵工艺。 62 产纤维素酶真菌混合发酵的微生态原理 6: 12 减弱酶的反馈抑制作用 纤维素酶在水解纤维素产葡萄糖过程中，葡萄 — 19 —
中国土壤与肥料0 +>>= （,） 糖和纤维二糖对纤维素酶有强烈的反馈抑制作用， 这就影响了纤维素的水解速度和程度。如将能分解 纤维素的菌与能利用葡萄糖和纤维二糖的菌混合发 酵，在发酵过程中，由于葡萄糖和纤维二糖被另一 种菌吸收利用，从而大大减弱了酶的反馈抑制。所 以，就纤维素分解而言，混合发酵比单一纯种培养 发酵更快、更彻底。司美茹等在研究假丝酵母对黑 曲霉和烟曲霉固态发酵中纤维素酶及淀粉酶活性的 影响，结果表明，接入少量假丝酵母，可大幅度提 、羧 高两种曲霉菌纤维素酶体系中滤纸酶（ !"# ） 甲基纤维素酶（ $%$&’( ） 、微晶纤维素酶（ #)* ） 及淀粉酶的活性
纤维素、半纤维素与木质素分离；将不溶的木质素 变成较易溶解的羟基木质素，引起秸秆结构变得疏 松，结晶纤维素变成无定型纤维素，进而使得秸秆 易于分解。但其缺点在于：纤维素含量太高；蛋白 质含量低，一般只有 %2 3 !&2 左右；矿物质含量
［ "， ’］ 。 不平衡，缺乏维生素 ,、4、5 等；能量值低等
菌名 学名 23*$"#4( 2()-$3"664( 8%6-,49*’:":* 91*-,%&"4& 9/*,14( =6*&&46"’* =4(*$"4& >*’%:-$&* >-%,$"#14& >%’/,$"4& @-’,"’4( !-&’%’"-66* !%’"66* !%$#1-66* !/$%,1-#"4& 中文名称 蘑菇属 曲霉属 牛肝菌属 假丝酵母属 毛壳属 黑蛋巢属 小火菇属 镰刀菌属 灵芝属 地霉属 腾梗孢霉属 韧伞属 黑乌霉属 念珠菌属 羊肚菌属 漆斑菌属
!# "$ 纤维素酶的来源 纤维素酶的来源较为广泛，昆虫、软体动物、 原生动物、细菌、真菌和放线菌都能产生纤维素 酶。当前，用来生产纤维素酶的微生物研究较多的 是真菌，包括大部分腐殖质腐生菌、担子菌门非褶 菌目的类群以及反刍动物瘤胃真菌。据统计，至少 有 ’! 属的真菌曾被国内学者用于纤维素材料发酵 研究（ 表 ! ） 。其中李日强等研究采用的菌种涵盖
1: 42 纤维素酶的种类 纤维素酶是多组分酶体系，是具有纤维素降解 能力酶的总称，根据它们作用于纤维素和降解的中 间产物可以分为 4 类：1: 纤维二糖水解酶（ #(;;$< %*$=".)$;&>(>，?@A）（ 1 ，8 B ! B C B 葡聚糖纤维 ，作 用 于 无 定 形 纤 维 二糖水解酶， D? 4: 6: 1: 01 ） 素的非还原末端，依次切下纤维二糖。6: 内切纤 维素酶（ (E.$F;+#&E&>(>，DG ）（ 1 ，8 B ! B C B 葡 聚糖 B 8 B 葡聚糖水解酶， D? 4: 6: 1: 8 ） ，作用于 纤维素分子非定形区，无规水解 ! B 1 ，8 糖苷键， 形成葡萄糖、纤维二糖和不同大小的纤维糊精，为 纤维二糖水解酶提供更多的可供水解的末端。4: ! B 葡萄糖苷酶（ ! B F;+#$>*.&>(>，! B G） （! B C B 葡萄糖苷葡萄糖 水 解 酶， D? 4: 6: 1: 61 ） ，又 称 纤 维二糖酶（ #(;;$%*&>(，?@ ） ，裂解纤维二糖和从小 的纤维素糊精的非还原末端水解葡萄糖残基，它的 水解速率随底物大小的降低而增加，以底物为纤维 二糖时水解速率最快
,%&/#-( ） 、 高 温 单 孢 菌 属 （ 01-$&%&%’%()%$* ）
［ /， 0］ 等 。
表 12 常见分解纤维素的真菌种类
特性 好氧 好氧 好氧 好氧 好氧 好氧 好氧 好氧 好氧 好氧 好氧 好氧 好氧 好氧 好氧 好氧 文献 ［3］ ［3］ ［ 15 ］ ［3］ ［3］ ［ 11 ］ ［ 16 ］ ［ 14 ］ ［ 15 ］ ［3］ ［3］ ［3］ ［3］ ［ 18 ］ ［ 15 ］ ［3］ 菌名 学名 5-4$%()%$* 7-’"#"66"4& 71*’-$%#1*-,76-4$%,4( 7%6/)%$4( ;1"<%)4( +#1"<%)1/664& +,$%)1*$"* +,*#1/?%,$/( 0%$46* 0$*&-,-( 0$*&-,-( 0$"#1%:-$&* A%6B*$"-66* 5-%#*66"&*(,"C 中文名称 脉孢菌属 青霉属 展齿革菌属 侧耳属 多孔菌属 根霉属 裂褶菌属 球盖菇属 葡萄穗霉属 串孢菌属 云芝属 栓菌属 木霉属 草菇属 D 特性 好氧 好氧 好氧 好氧 好氧 好氧 好氧 好氧 好氧 好氧 好氧 好氧 好氧 好氧 好氧 文献 ［ 14 ］ ［3］ ［ 13 ］ ［3］ ［ 15 ］ ［3］ ［ 15 ］ ［ 16 ］ ［3］ ［3］ ［ 15 ］ ［ 17 ］ ［3］ ［ 19 ］ ［ 1/ ］
［ += ］ 理法、有机溶剂处理法、生物法和湿氧化法等 。
Biblioteka Baidu。其原因是酵母菌利用了水解
形成的纤维二糖等小分子还原糖，解除了纤维二糖 对纤维素酶和淀粉酶合成的阻遏，从而提高了发酵 产物的酶活性。而且经检测，体系中的细胞外可溶 性蛋白峰值含量较无酵母菌接入时提高幅度高达 ,-. ，说明混合培养纤维素酶及淀粉酶活性的提高 是酶蛋白合成与分泌量增加的结果。 +/ +0 酶系互补 在真菌发酵生产纤维素酶研究过程中发现，虽 然木霉是公认的最好的纤维素酶生产菌，但仍存在 两方面不足，一是木霉的毒性嫌疑大，二是木霉普 遍存在产生的 ! 1 葡萄糖苷酶活性偏低。许多曲霉 属菌 株 如 黑 曲 霉 （ !"#$%&’(()" *’&$% ） 、海 枣 曲 霉 （ !/ #+,$*’-’"） 等都能产生高活力的 ! 1 葡萄糖苷 酶。而且，曲霉是公认的产纤维素酶活较强的安全 菌株。张海等对木霉和曲霉混合培养，不仅使 ! 1 葡萄糖苷酶活力比单纯培养木霉提高 2/ + 倍，而且 内切纤维素酶和纤维二糖水解酶活性也同时增长 +,. 和 3.