红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验
实验四血凝和血凝抑制试验
3. 0.85%生理盐水. 4. 被检血清,采自被检鸡的血清.
四、操作步骤 〔一血凝试验〔HA
1. 在血凝板第一排的1~12孔加入50μl生理盐水. 2. 在第1孔中加入50μl病毒抗原,反复吸取混匀后
〔Hemagglutination and Hemagglutination
Inhibition, HA and HI
动物病原学实验之六
一、实验目的
掌握血凝和血凝抑制试验的原理,以及使 用该试验测定血清抗体水平的操作步骤和结 果判定方法.
二、实验原理
〔一血凝试验〔HA
➢ 有些病毒能够促使某些动物〔如鸡、鹅、豚鼠、 绵羊和人的红细胞发生凝集,这就是红细胞凝集 现象,称做血凝试验.
以50%的红细胞发生凝集的病毒悬液的最高稀释度 作为血凝价的终点,即一个血凝单位.
〔二血凝抑制试验〔HI
1. 在血凝板的1~12孔加入50μl生理盐水,最后一孔加 100μl.
2. 第1孔加入待检血清50μl,混匀后吸50μl至第2孔,倍比 稀释直至第10孔,混匀后弃50μl.
3. 从1~11孔,每孔加稀释好的50μl 4个血凝单位的病毒悬 液.
放映结束 感谢各位的批评指导！
谢 谢！
让我们共同进步
➢ 象各种脑炎病毒、口蹄疫病毒等,凝集红 细胞的条件很严格,对红细胞的种类有很 严格的选择,同时还要掌握反应的pH和温 度等.
〔二血凝抑制试验〔HI
➢ 当病毒悬液中加入特异性抗体时,这种红 细胞凝集的现象就被抑制,称做红细胞凝 集抑制试验,也叫血凝抑制试验.
HI试验的原理图
红细胞凝集抑制试验影响因素的分析
鸡红细胞凝集抑制试验影响因素的分析红细胞凝集试验和红细胞凝集抑制试验是兽医界相关实验室最为常用的实验之一。
由于其具有便于操作、快捷、成本较低的特点，是畜禽疫病诊断及免疫状态监测特别是禽流感、新城疫等重大动物疫病免疫监测最为重要的方法之一。
影响血凝抑制试验的因素：1、对于试验器材及试验环境的要求实验时应选用数字式单道和多道移液器，平时要做到移液器的效验及保养工作，这对保证移液器的准确性非常重要。
每次使用完毕，要将移液器量程调至最大刻度，以保证移液器内弹簧的最好灵敏性。
实验时所用的抗原应选用国家指定单位生产的标准抗原，这对于保证实验结果的准确性和各单位所做的实验结果的可对照性非常重要。
实验时的室内温度不宜过高或过低，应配备有温度控制设备或恒温箱。
96孔v型微量血凝板如不具备较好的洗涤设施时，建议使用一次性96孔v型微量血凝板。
2、1%红细胞悬液的配置配置血凝抑制试验用的红细胞最好选用成年SPF公鸡，抗凝剂不要保存时间时间过长。
红细胞的浓度要尽量准确，一免不同实验室读出结果有较大差距。
如果红细胞配置浓度偏低，血凝价可能偏高，血凝抑制价可能偏低。
如果红细胞配置浓度偏高，血凝价可能偏低，血凝抑制价可能偏高。
红细胞离心洗涤结束后，要将洗头放入离心管的最底部来吸取红细胞进行稀释配制，如随意从红细胞液体上层吸取血细胞进行稀释配制，将会造成配置的血细胞浓度偏低，因洗涤红细胞后弃去的PBS液或生理盐水会有一些残留在红细胞上层。
3、标准抗原对试验结果的影响四单位标准抗原配置的准确与否是血凝抑制试验中非常重要的一环。
标准抗原血凝单位的高低对实验结果有很大影响，如果标准抗原血凝价偏高，测定的血清抗体效价将偏低，反之则待测定的血清的抗体效价偏高。
所以标准抗原配置及检测的准确性对实验结果将产生较大的影响。
使用过的标准抗原再次使用时，应重新进行检测。
未检测抗原血凝效价，即按前一次检测抗原的血凝单位进行配制标准抗原，这样的血凝抑制试验结果是不准确的。
红细胞凝集抑制试验
孔号
样品稀释倍 数 PBS
被检鸡样品
1234
5
6
7
2× 4× 8× 16× 32× 64× 64×
25 25 25 25 25 25
25
25 25 25 25 25 25
25
8
9
Hale Waihona Puke 256× 512×25
25
25
25
10
11
12
1024×
抗原对照 红细胞 对照
25
25
25
25
4HAU血凝素 25 25 25 25 25 25
25
25
25
25
25
振荡器上振荡10s混匀，室温放置20min
弃25
1%红细胞
25 25 25 25 25 25
25
25
25
25
25
25
振荡10s混匀，室温作用 15min
结果观察
----
-
-
+
++
+++
++ ++
++ ++
-
注：-表示不凝集；++表示部分凝集；++++表示完全凝集。
血凝抑制效价：能使红细胞凝集全部被抑制的样品最高稀释倍数。
如果配制的4HAU准确，则1:4稀释度为凝集终点；
如果高于1:4，则说明血凝素浓度过高（抗体效价 低于正常值），
如果低于1:4，则说明血凝素浓度过低（抗体效价 高于正常值）。
根据检验结果进行调整，使工作液为4HAU。
四单位验证
禽流感HI实验方法
红细胞凝集实验（HA）与红细胞凝集抑制实验（HI）一：实验设备及仪器1.离心机一台（30000转）2.冰箱一台（存放抗原）3.振荡器一台（震荡96孔V型板）4.抗原：禽流感（AI）抗原，从厂家购买5.多孔移液器即排枪一把（量程为5到50微升，做稀释血清用）6.一次性枪头（高压灭菌后使用）7.1%到0.5%体积的鸡红细胞悬液（健康成年鸡的红细胞，但须严格洗五次）8.柠檬酸三钠（配置3.8%抗凝剂使用，制作红细胞悬液采鸡血时加入血液，防止血液凝固）9.吸管一毫升跟十毫升量程10.吸耳球：跟吸管配套使用11.蒸馏水：即无菌双蒸水，清洗96孔V型板12.10毫升离心管，离心红细胞用13.生理盐水：做血清稀释液用，及配置4单位抗原二：实验前准备1.抗原：根据指定免疫类型从生物公司购买稳定的浓缩抗原2.抗凝剂的配制：用分析天平称取3.8克柠檬酸三钠，溶解于100毫升生理盐水中，待溶解完全后即可使用。
3.1%红细胞悬液制作：去菜市场找杀鸡的，去找他们用试管接新鲜鸡血，试管中提前加入抗凝剂，加入的抗凝剂与你所接血液的比例大概为1:2，并迅速混匀，在离心机中以3000转离心五分钟，用吸管吸取上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加生理盐水，慢慢混合均匀，不要弄碎了红细胞，再在离心机中3000转离心五分钟，弃去上清，再加生理盐水混匀，如此往复四到五次。
最后一次离心后，去掉上清，管低即为红细胞泥，用吸管吸取0.1毫升红细胞泥，然后加入9.9毫升的生理盐水就是1%的红细胞悬液，现用现配不要长时间存放。
4.被检血清：乡镇送来的血液，离心取上清即为被检验血清，注意做标记，一管一标记，别弄混了。
5.血清稀释液：为灭菌生理盐水，即高压过的生理盐水三：实验步骤第一步：血凝（HA）实验，目的是测定抗原效价，即为了制作后面的四单位抗原1.首先用微量移液器向96孔V型板的每一孔加生理盐水25微升2.用微量移液器吸取待测抗原（就是你买的抗原）的25微升于第一孔中并且挤压六次混合，后吸出25微升至第二孔，依次倍比稀释到第11孔，11孔中弃去25微升。
血凝及血凝抑制实验
1、在稀释移取混匀的操作过程中动作要慢，以免损坏红细胞（表现为分离是上清液为淡红色，正常情况第一次分离后上清液为淡黄色，之后直至清亮为清洗干净）。 2、在吸取过程中一定要将中间的白细胞层吸取干净。
血凝(HA)与血凝抑制(HI)试验
一、实验目的 二、实验内容 三、实验原理 四、实验材料 五、实验方法与结果判定 六、注意事项 七、红细胞制备
一、实验目的
1、掌握血凝和血凝抑制试验的基本原理、操 作方法和结果判定方法 2、了解新城疫有关背景知识
二、实验内容
1、血凝试验(HA)检测新城疫抗原的效价 2、血凝抑制试验(HI)检测新城疫抗体（疫苗注射后的抗体检测）
三、实验原理
1、血凝试验（HA）原理：某些病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种动物地红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝（HA）,也称直接血凝反应。
病毒颗粒
红细胞
2、血凝抑制试验（HI）原理：当病毒的悬液中加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制（HI）反应，也称血凝抑制反应。
结果判定标准
1、＋＋＋＋：红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，即100％凝集； 2、＋＋＋：红细胞均匀铺于孔底，当边缘不整齐而稍向孔底集中，即75％凝集； 3、 ＋＋ ：红细胞形成一个环状，四周有凝集块，即50％凝集； 4、 ＋ ：红细胞于孔底形成圆团，边缘不够光滑，四周稍有凝集块，即25％凝集； 5、－ ：红细胞于孔底形成圆团，边缘光滑整齐，即无凝集；
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
红细胞凝集试验(HA)与红细胞凝集抑制试验(HI)
红细胞凝集试验(HA)与红细胞凝集抑制试验(HI)
红细胞凝集试验(HA)和红细胞凝集抑制试验(HI)是两种常见的检验手段，用于检测血液中是否存在抗体，从而诊断某些疾病或病原体感染。
红细胞凝集试验(HA)
红细胞凝集试验(HA)是一种检测抗体与抗原反应的常规方法。
在这个测试中，医生或实验室技术人员将被测血浆放入红细胞凝集剂中，然后与已知抗原混合，比如病毒、细菌或其他病原体。
如果血浆中含有与已知抗原相应的抗体，那么红细胞就会和抗原结合在一起形成凝集。
如果血浆中没有抗体，红细胞就会分散在凝集剂中。
HA 可以检测出许多病原体的抗体，包括流感病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒和风疹病毒等。
红细胞凝集抑制试验(HI)
红细胞凝集抑制试验(HI)也是一种检测抗体和抗原反应的常规方法。
在这个测试中，被测血液中的抗体与已知抗原结合，形成抗原-抗体复合物。
然后，在复合物中加入未和抗原混合的红细胞，如果血浆中含有抗体，它们会与复合物结合，使得红细胞不会凝集。
如果血液中没有相应的抗体，红细胞就会在复合物中凝集。
与HA相比，HI适用于检测一些病原体，比如肝炎病毒和流感病毒等，但不是所有病原体都适合使用HI进行检测。
红细胞凝集试验（HA）和红细胞凝集抑制试验（HI）是检测抗体和抗原反应的两种常见方法。
这两种技术可用于诊断许多疾病和病原体感染，但需要在临床实验室或医疗机构进行，由专业人员执行。
尽管这些测试非常有用和重要，但仍需要与其他诊断工具和检查方法相结合，以确保诊断的准确性和病人的治疗。
[最新]ha、hi试验方法
![[最新]ha、hi试验方法](https://img.taocdn.com/s3/m/b24e2eb6b1717fd5360cba1aa8114431b90d8e99.png)
红细胞凝集试验及红细胞凝集抑制试验1．红细胞凝集试验 采用50孔板或试管法按表1，若采用96孔微量板法按表2进行，用生理盐水将待检抗原按术式稀释成不同倍数，加入1%鸡红细胞悬液。
将50孔板或试管前后左右摇匀；将96孔微量板在振荡器上摇匀，置于20～30℃，20～40分钟后（微量板法时间短, 15～30分钟）判定结果，使50%红细胞凝集的最高稀释度，作为判定终点。
表1 50孔板或试管法测定凝集价 单位：ml孔或管号对照1 2 3 4 5 6 7 8…… 血凝素稀释倍数 10 20 40 80 160 320 640 1280…… 0.5生理盐水0.9 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5……} } } } } } } } 弃0.5待检抗原 0.1 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 1%鸡红细胞悬液0.50.50.50.50.50.50.50.50.5表2 96孔微量板法测定凝集价 单位：μl孔号对照1 2 3 4 5 6 7 8...... 稀释倍数 2 4 8 16 32 64 128 256 (25)生理盐水25 25 25 25 25 25 25 25…… } } } } } } } } 弃25 待检抗原 25 25 25 25 25 25 25 25 1%鸡红细胞悬液2525252525252525252．红细胞凝集抑制试验 2.1血凝素凝集价测定 50孔板或试管法按表3，若采用96孔微量板法按表4进行。
表3 50孔板或试管法测定凝集价 单位：ml孔或管号对照1 234567 8……血凝素稀释倍数5 10 20 40 80 160 320 640……0.25生理盐水0.4 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25……}} } } } } } } 弃0.25血凝素 0.1 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.251%鸡红细胞悬液 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.250.25 0.25 生理盐水0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.250.25 0.25表4 96孔微量板法测定凝集价 单位：μl孔号对照1 2 3 4 5 6 7 8…… 稀释倍数 2 4 8 16 32 64 128 256……25生理盐水25 25 25 25 25 25 25 25……血凝素 25 25 25 25 25 25 25 25 1%鸡红细胞悬液 25 25 25 25 25 25 25 25 25 生理盐水252525252525 2525252.2.1 4单位抗原工作液配制 选用上述2.1项抗原进行。
兽医凝集试验
红细胞凝集试验（HA）与红细胞凝集抑制试验（HI）河南省乘风动物保健技术研究所一、实验用设备：●1、离心机1台（3000转离心红细胞）2、冰箱1台（存放抗原）3、振荡器1台（振荡96孔V型板）4、抗原新城疫（ND）、减蛋（EDS）、流感（AI）抗原，从正规厂家进。
5、96孔V型板稀释血清清洗后可重复使用6、移液器1把（5-50微升稀释血清）7、吸头和移液器配套使用8、积液槽配制4个单位抗原及盛放生理盐水加样用9、一次性采血管采血用10、2毫升注射器采血用●11、红细胞非免疫鸡心脏采血或免疫鸡也可，但需离心5次后使用。
12、柠檬酸三钠配制3.8％抗凝剂用13、重铬酸钾配制清洁液用14、硫酸配制清洁液用15、吸管1毫升、10毫升16、吸耳球和吸管配套使用17、针头9*13（采雏鸡）、9*25（采大鸡）18、蒸馏水当地买。
清洗96孔V型板、吸头用19、10毫升离心管离心红细胞用（塑料制）20、生理盐水做血清稀释液用、配制4单位抗原二、实验前的准备：●抗原：从指定厂家购买稳定浓缩抗原。
●1％红细胞悬液：由鸡心脏或翅静脉采血，放入加有抗凝剂的离心管内（按抗凝剂：全血＝1：2的比例），迅速混匀。
在离心机中以3000转/分离心5分钟，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加生理盐水，慢慢混合均匀，再在离心机中3000转/分离心5分钟，弃去上清液，再加生理盐水混匀，如此反复离心4～5次，最后一次离心后的红细胞，弃去上清液，即为红细胞泥。
放入4℃冰箱中可保存2—3天。
使用时用1ml吸管吸取0.1ml红细胞泥，然后加入9.9ml的生理盐水，此即1%红细胞悬液。
现用现配。
●抗凝剂的配制：用天平称量3.8克柠檬酸三钠，溶入100ml生理盐水中，待溶解完全后即可使用。
●被检血清：每只鸡心脏或翼下采血0.5-1ml,静置或离心，待血清析出后备用。
●吸管清洁液的配制：使用1%的稀硫酸溶液。
水10公斤，硫酸100毫升，将硫酸慢慢倒入水中，不断搅拌，操作时必须戴手套，口罩。
血凝和血凝抑制试验
血凝和血凝抑制试验一些病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种或某几种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝(Hemagglutination，HA)。
正粘病毒和副粘病毒是最主要的红细胞凝集性病毒；其他病毒包括披膜病毒、细小病毒、某些肠道病毒和腺病毒等也有凝集红细胞的作用，但常要求比较严格的反应条件，例如一定的pH范围等。
各种病毒的血凝素性质不尽相同。
某些病毒可在很广的pH条件下呈现血凝作用，某些病毒则只在很窄的pH范围内才能凝集红细胞。
某些病毒的血凝作用具有温度依赖性，也就是只在一定温度范围内才出现血凝现象；但另一些病毒却可在4℃、室温和37℃呈现同样的血凝作用。
病毒凝集的红细胞种类，也随病毒种类而不同，例如某些病毒主要对人和禽的红细胞呈现凝集作用，另一些病毒则可凝集豚鼠或大鼠等的红细胞。
当病毒的悬液中先加入特异性抗体，且这种抗体的量足以封闭病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触，这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制(HemagglutinationInhibition，HI)，也称为血凝抑制反应。
血凝的原理因病毒而有所不同，如痘病毒对鸡红细胞发生凝集作用并非是病毒的本身，而是痘病毒的产物类脂蛋白的作用。
而流感病毒的血凝作用是病毒囊膜上的血凝素与红细胞表面的受体糖蛋白相互吸附而发生的。
病毒的血凝现象大致可以分为可逆转型、不可逆转性、凝集条件严格型三类。
血凝和血凝抑制试验有常量法和微量法两种，目前国内外广泛使用的都是微量法，各要素用量均为25ul，微量法省时、省料、高效。
以下简要介绍本次试验的主要内容，详细内容参见各国标。
各实验室所采用的HA和HI试验程序不同，下面的例子是应用V型微量板进行的试验，两种方法反应总体积都为75ul，本试验所用试剂为如下：1.生理盐水：用蒸馏水或去离子水配制成0.85％NaCl溶液，高压灭菌备用。
2.红细胞悬液：采鸡血液，加于倍量的红细胞保存液-阿氏液中，置4℃普通冰箱保存，可用一个月。
红细胞凝集试验(HA)与红细胞凝集抑制试验
红细胞凝集试验（HA）与红细胞凝集抑制试验（HI）2007-12-07 11:42用疫苗按一定免疫程序进行免疫接种是控制鸡病流行的主要途径之一，这种观点已被广大养殖户接受并引起足够重视。
但鸡群免疫抗体的产生及维持时间受到鸡群免疫应答能力、所用疫苗种类、免疫方法、免疫次数、疫病流行状况等方面的影响，良好的免疫接种不等于鸡群能够产生良好的保护力。
因而通过对鸡群进行抗体监测，及时检查鸡群的免疫状态、疫苗使用效果，为制定合理的免疫程序提供依据就显得非常重要。
通过对广大养殖户的大量调查发现，由于缺乏有效的监测手段，养殖户普遍存在盲目免疫的现象。
因此，建立合理的抗体监测制度，开展免疫抗体监测工作，已经成为我们当前养鸡生产中急需开展的一项重要工作。
下面将抗体监测所需设备及监测过程向大家做一说明。
一、实验用设备：1、离心机 1台*（3000转离心红细胞）2、冰箱 1台*（存放抗原）3、振荡器 1台*（振荡96孔V型板）4、抗原新城疫（ND）、减蛋（EDS）、流感（AI）抗原，从正规厂家进。
5、96孔V型板稀释血清清洗后可重复使用6、八道移液器 1把（5-50微升稀释血清）7、吸头和八道移液器配套使用，清洗后重复使用）8、积液槽配制4个单位抗原及盛放生理盐水加样用9、一次性采血管采血用10、2毫升注射器采血用11、红细胞非免疫鸡心脏采血或免疫鸡也可，但需离心5次后使用。
12、柠檬酸三钠配制3.8％抗凝剂用13、重铬酸钾配制清洁液用14、硫酸配制清洁液用15、吸管 1毫升、10毫升16、吸耳球和吸管配套使用17、针头 9*13（采雏鸡）、9*25（采大鸡）18、蒸馏水当地买。
清洗96孔V型板、吸头用19、10毫升离心管离心红细胞用（塑料制）20、生理盐水做血清稀释液用、配制4单位抗原二、实验前的准备：1.抗原：从指定厂家购买稳定浓缩抗原。
2.抗凝剂的配制：用天平称量3.8克柠檬酸三钠，溶入100ml生理盐水中，待溶解完全后即可使用。
红细胞凝集试验(HA)
用户名: 密码: 登录注册畜牧兽医知识的天堂主页博客相册|个人档案|好友查看文章红细胞凝集试验（HA）与红细胞凝集抑制试验（HI）2007-12-07 11:42用疫苗按一定免疫程序进行免疫接种是控制鸡病流行的主要途径之一，这种观点已被广大养殖户接受并引起足够重视。
但鸡群免疫抗体的产生及维持时间受到鸡群免疫应答能力、所用疫苗种类、免疫方法、免疫次数、疫病流行状况等方面的影响，良好的免疫接种不等于鸡群能够产生良好的保护力。
因而通过对鸡群进行抗体监测，及时检查鸡群的免疫状态、疫苗使用效果，为制定合理的免疫程序提供依据就显得非常重要。
通过对广大养殖户的大量调查发现，由于缺乏有效的监测手段，养殖户普遍存在盲目免疫的现象。
因此，建立合理的抗体监测制度，开展免疫抗体监测工作，已经成为我们当前养鸡生产中急需开展的一项重要工作。
下面将抗体监测所需设备及监测过程向大家做一说明。
一、实验用设备：1、离心机1台*（3000转离心红细胞）2、冰箱1台*（存放抗原）3、振荡器1台*（振荡96孔V型板）4、抗原新城疫（ND）、减蛋（EDS）、流感（AI）抗原，从正规厂家进。
5、96孔V型板稀释血清清洗后可重复使用6、八道移液器1把（5-50微升稀释血清）7、吸头和八道移液器配套使用，清洗后重复使用）8、积液槽配制4个单位抗原及盛放生理盐水加样用9、一次性采血管采血用10、2毫升注射器采血用11、红细胞非免疫鸡心脏采血或免疫鸡也可，但需离心5次后使用。
12、柠檬酸三钠配制3.8％抗凝剂用13、重铬酸钾配制清洁液用14、硫酸配制清洁液用15、吸管1毫升、10毫升16、吸耳球和吸管配套使用17、针头9*13（采雏鸡）、9*25（采大鸡）18、蒸馏水当地买。
清洗96孔V型板、吸头用19、10毫升离心管离心红细胞用（塑料制）20、生理盐水做血清稀释液用、配制4单位抗原二、实验前的准备：1.抗原：从指定厂家购买稳定浓缩抗原。
2.抗凝剂的配制：用天平称量3.8克柠檬酸三钠，溶入100ml生理盐水中，待溶解完全后即可使用。
鸡新城疫病毒的红细胞凝集试验和凝集抑制试验操作方法
鸡新城疫病毒的红细胞凝集试验和凝集抑制试验操作方法摘要：NDV是引起新城疫的病原体，新城疫又叫亚洲鸡瘟。
本病具有高度的传染性，发病急，致死率高。
对养禽业发展构成了严重威胁，是世界养禽业最重要的疾病之一。
为有效地控制新城疫病毒，对21日龄的1000雏鸡注射鸡新城疫灭活苗进行免疫，并对其抗体效价进行监测。
红细胞凝集试验和凝集抑制试验是监测鸡新城疫免疫状态的一种简便，快捷，经济的血清学方法。
次试验可作为监测鸡群免疫效果，疫苗使用效果和制定合理免疫程序的依据。
关键词：鸡新城疫抗体效价监测试验为掌握病毒的红细胞凝集试验和凝集抑制试验的操作方法，对21日龄的1000只雏鸡注射了鸡新城疫灭活苗后9天，进行随机抽样检查。
作HI抗体滴度的测定，操作方法如：1.原理:NDV一个很重要的生物学特性就是能吸附于鸡，火鸡，鸭，鹅及某些哺乳动物（人，豚鼠）的红细胞表面，并引起红细胞凝集，而这种血凝现象能被NDV的抗体的抑制。
2.器材：2---5mL注射器、离心管、离心机、试管架、生理盐水、鸡新城疫疫苗弱毒Ⅳ系、1％鸡红细胞悬液。
3.操作步骤：①红细胞悬液的制作（0.7—1﹪）浓度低反应时间越长。
阿氏液：血液=1：1 肝素：血液=1：10取2mL阿氏液加2mL成年鸡血液于离心管中摇匀，放入离心机1500rPm,5min.吸取上清液及上层白细胞后加适量生理盐水混匀离心，重复三次，用生理盐水配成1﹪浓度。
②HA孔号(uL) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12生理盐水50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50}↘}↘}↘}↘}↘}↘}↘}↘}↘}↘}↘50鸡新城疫病毒50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50红细胞50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50振荡器上振荡1—2min. 18℃--22℃作用15min后观察结果。
结果# # # # # # # + ————结果表示病毒液的HA效价为27 ，HI时病毒Ag液50uL内须含4个凝集单位，测病毒Ag液作32倍稀释。
HA-HI试验
8、判定结果
（1）血清抗体效价的判断：
能够使4单位病毒凝集鸡红细 胞的作用完全被抑制的血清最 高稀释倍数，称为该血清的抗 体效价，以2的指数表示。
孔号： 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11ห้องสมุดไป่ตู้
12
上图，血清抗体效价依次为28、 27、28、29、28、27、27、26
2、判定标准：
（1）一般认为鸡的免疫临界水平 为25（成鸡）或26（雏鸡）。 （2）鸡血清的凝集抑制价，全部 高于26可适当推迟新城疫免疫时间， 全部低于24以下，应马上进行新城 疫疫苗接种。
血清稀释倍数
孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
血清 稀释 倍数
21
22
23
24
25
26
27
28
29
210
211 对 照
3、加4单位抗原
1~12孔各加25微
升。 4、置于振荡器上，振荡1分钟，室 温静置 20分钟。 5、加1%的鸡红细胞悬液 用微量 移液器向1~12孔各加1%红细胞悬 液25微升。 6、置于振荡器上，振荡1分钟。室 温静置20~25分钟后观察结果。
1%红细胞悬液制备
1、抗凝血的制备 采集3只非免疫成年健康鸡血液， 由翅静脉或心脏采血，按3.8%柠檬酸钠与血液1：4 混合制成。 2、1%红细胞悬液制备 将抗凝血加入离心管内， 用生理盐水洗涤5次，每次2000r/min离心5min ， 将血浆、白细胞充分弃去，最后一次离心时间为 10min，离心结束后，弃去上清液，根据剩下的红 细胞体积，用生理盐水配制成1%红细胞悬液。
红细胞凝集试验与红细胞凝集抑制试验
红细胞凝集试验（HA）与红细胞凝集抑制试验（HI）用疫苗按一定免疫程序进行免疫接种是控制鸡病流行的主要途径之一，这种观点已被广大养殖户接受并引起足够重视。
但鸡群免疫抗体的产生与维持时间受到鸡群免疫应答能力、所用疫苗种类、免疫方法、免疫次数、疫病流行状况等方面的影响，良好的免疫接种不等于鸡群能够产生良好的保护力。
因而通过对鸡群进行抗体监测，与时检查鸡群的免疫状态、疫苗使用效果，为制定合理的免疫程序提供依据就显得非常重要。
通过对广大养殖户的大量调查发现，由于缺乏有效的监测手段，养殖户普遍存在盲目免疫的现象。
因此，建立合理的抗体监测制度，开展免疫抗体监测工作，已经成为我们当前养鸡生产中急需开展的一项重要工作。
下面将抗体监测所需设备与监测过程向大家做一说明。
一、实验用设备：1、离心机 1台*（3000转离心红细胞）2、冰箱 1台*（存放抗原）3、振荡器 1台*（振荡96孔V型板）4、抗原新城疫（ND）、减蛋（EDS）、流感（AI）抗原，从正规厂家进。
5、96孔V型板稀释血清清洗后可重复使用6、八道移液器 1把（5-50微升稀释血清）7、吸头和八道移液器配套使用，清洗后重复使用）8、积液槽配制4个单位抗原与盛放生理盐水加样用9、一次性采血管采血用10、2毫升注射器采血用11、红细胞非免疫鸡心脏采血或免疫鸡也可，但需离心5次后使用。
12、柠檬酸三钠配制3.8％抗凝剂用13、重铬酸钾配制清洁液用14、硫酸配制清洁液用15、吸管 1毫升、10毫升16、吸耳球和吸管配套使用17、针头 9*13（采雏鸡）、9*25（采大鸡）18、蒸馏水当地买。
清洗96孔V型板、吸头用19、10毫升离心管离心红细胞用（塑料制）20、生理盐水做血清稀释液用、配制4单位抗原二、实验前的准备：1.抗原：从指定厂家购买稳定浓缩抗原。
2.抗凝剂的配制：用天平称量3.8克柠檬酸三钠，溶入100ml生理盐水中，待溶解完全后即可使用。
3.1％红细胞悬液：由鸡心脏或翅静脉采血，放入加有抗凝剂的离心管内（按抗凝剂：全血＝1：2的比例），迅速混匀。
病毒血凝和血凝抑制试验--(以新城疫为例)
生理盐水 病毒液 25「 25卩1\25^125^1 25 ”1 25g1 2 25gl 4 25g1、25g1 Q5 25^1 25 卩1弃去实践二病毒血凝和血凝抑制试验--（以新城疫为例）实践目的：1 •掌握血凝（HA 和血凝抑制（HI ）试验的原理2 •掌握鸡新城疫病毒血凝和血凝抑制试验的操作方法实践原理：某些病毒（如鸡新城疫病毒，禽流感病毒等）能够与人或动物的红细胞发生凝集， 此即为 红细胞凝集现象。
这种红细胞凝集现象可于病毒悬液中加入特异性抗体 （免疫血清）所抑制, 即为红细胞凝集抑制试验。
实践内容：1.红细胞凝集试验（HA 试验）主要是测定病毒的红细胞凝集价，以确定红细胞凝集抑制试验所用病毒稀释倍数（抗原单位）。
有试管法和微量法两种，现以常用的微量法进行说明。
鸡新城疫病毒的HA 试验现采用微量法，在 V 形微量反应板上进行。
（1） 首先用微量移液器向每个孔加入稀释液即灭菌生理盐水一滴 （25卩I ）。
（2）用微量移液器取病毒抗原液 25卩1加入第1孔内，吸头浸于液体中缓慢吸吹几次使病毒与稀释液混合均匀，再吸取25^1液体小心地移至第 2孔，如此连续稀释至第11孔，第11孔吸取25 ^1液体弃掉；病毒稀释倍数依为1:2〜1:2048，第12孔为红细胞对照。
（3） 再以微量移液器每孔加1.0 %红细胞悬浮液1滴（25卩I ）。
（4） 在振荡器上振荡混匀约 I 〜2分钟，再置37 C 作用15分钟后观察结果。
（5）每次测定样品都应同时做红细胞对照。
表1鸡新城疫血凝效价（HA ）的测定术式（微量法）孔号1 234567891011 12病毒稀释倍数 1:2 1:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:10241:2048 对照1%红细胞悬液 25g1 25g1 25g1 25g1 25g1 25g1 25g1 25g1 25g1 25g1 25g1 25g1 感作 置振荡器上混匀1〜2分钟，放37 C 静置15分钟结果例示 # # # # # # # ++ - - - -表示%完全凝集 表示%凝集 表示不凝集结果判定：将反应板倾斜成45度角，沉于管底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者沉淀, 表明红细胞未被或不完全被病毒凝集； 如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验流感病毒表面得血凝素(ＨＡ)蛋白,含有识别与结合宿主细胞表面受体得结构，能使一些特定得红细胞发生凝集现象.当红细胞与病毒按适当得比例混合后，由于病毒得作用使红细胞发生凝集,此为凝集现象。
含有特异得抗流感病毒HA蛋白得抗血清，能抑制红细胞凝集现象得出现,即抗体与病毒结合后，可以使血凝素不能吸附于红细胞表面得受体上,此为红细胞凝集抑制（HＡI).微量红细胞凝集抑制试验就是目前最常用得一种鉴定流感病毒型／亚型及分析流感病毒HA抗原性变异得试验方法,也可以用于对一般人群抗体水平得检测与疫苗效果得评价等方面。
用于HAI试验得标准参照血清必须及时更新,用于鉴定流感病毒型/亚型应包括当年得国际疫苗株或国内流行代表株得抗血清,可以用羊、鸡、雪貂、兔等实验动物得抗血清；用于抗原分析得抗血清建议包括同一型别与亚型不同毒株免疫得标准参考抗血清,由于用雪貂制备得抗流感病毒血清特异性高,易将不同毒株间抗原性差异显示出来,因此常用免疫雪貂得抗血清进行抗原分析。
HＡI试验中所用得血清必须经特殊处理以去除非特异性抑制素及非特异性凝集素。
(一）生物安全要求所有有关试验操作都应在相应生物安全级别得实验室中进行，必须遵守生物安全规定，严格执行标准操作规程与废弃物管理规定，做好个人防护要求。
季节性流感病毒病毒或经完全灭活得高致病性禽流感病毒操作可以在BSL—2实验室里进行，高致病性禽流感病毒得操作在BＳＬ—3级实验室中进行。
（二)实验所用试剂1。
标准参考抗原:以国际疫苗株与国内流行株作为标准参考抗原,新分离得毒株作为待测抗原。
2.标准参考抗血清:以国际疫苗株与国内流行株制备得抗血清作为标准参考血清。
血清要经ＲＤE处理。
（三)其她试剂/材料/仪器1. 红细胞悬液ﻩﻩﻩﻩﻩﻩﻩﻩ2. PH７、4得PＢS缓冲液3. RDＥ（日本生研）ﻩﻩﻩ4. 水浴箱（3７℃,5６℃)5. 台式离心机6. 多道可调加样器、单道可调加样器7. 离心管8. 96孔微量血凝板(使用豚鼠与人红细胞进行实验须用“Ｕ"底板,使用火鸡红细胞进行实验用“V”底板)9. ２０0µL、１000µLTIP头、水槽表１、流感病毒红细胞凝集试验各项条件比较红细胞火鸡豚鼠人“O"型血终浓度０、5 0、５0、5 孔底部形状V型Ｕ型Ｕ型孵育时间25-30min ４5—６０mｉｎ４5—60min红细胞沉积形状细胞沉积成点状，倾斜时细胞向下流成泪滴状细胞沉积成环状细胞沉积成环状（四)流感病毒鉴定与抗原分析步骤1. 实验前准备（1）标准参考抗血清得处理1）去除血清中得非特异性抑制素a）所谓抑制素就是指各种动物血清、体液、组织液中所含与红细胞表面受体相似得物质,它们能与红细胞受体一起竞争性地被病毒表面血凝素所识别与结合。
目前所知道得非特异性抑制素,除大白鼠血清中对丙型流感病毒特殊得非特异性抑制素,还有三种:α、β与γ。
在ＨAI试验中,必须将非特异性抑制素从抗血清中去除干净,才能准确地测定出ＨAI得抗体效价。
常用得清除非特异性血凝抑制素得方法有霍乱滤液（RＤE,受体破坏酶得一种)清除法,过碘酸钾清除法等。
b）RＤE处理步骤:用２5mL生理盐水稀释RＤE；在1体积血清中加入3体积RDＥ（如0、１mＬ血清+０、３mLRDE),37℃水浴１6-18ｈ;５6℃水浴30 min；加入6体积生理盐水(在０、４mL RDＥ与血清混合物中加入0、6mＬ生理盐水)。
2）去除非特异性凝集素a）向20体积RDE处理后得血清中加入1体积得纯血球。
b）完全/彻底混匀,在2—8℃孵育，每15ｍin重新混匀一次。
c）1ｈ后，20０0转离心5min。
吸出血清上清液。
d）取出一块9６孔血凝板，在第一列每孔加入５0uLPBＳ缓冲液,吸出５0uL处理好得血清，做2倍稀释,加入50uL红细胞悬液,室温静置３0—６0ｍin,观察试验结果,如果红细胞沉积,证明血清中非特异性凝集素去除干净(去除非特异性凝集用红细胞类型与下一步试验用红细胞类型一致）。
（2）红细胞悬液配制1）A、S液全称为Alsｅveｒ氏液。
配制方法为葡萄糖2、0５ｇ、柠檬酸钠0、8g、柠檬酸0、0５5g、氯化钠０、42g、去离子水加至１00mL,微热溶解,将ｐH值调到６、1,8磅20ｍｉn高压灭菌，4℃贮存备用。
2）将含有红细胞得A、S液,离心5min（火鸡/鸡红细胞１800rpm;人“O”型、豚鼠红细胞2000rpm，不同离心机转速稍有不同)，弃上清。
3）加入等量得ＰBS缓冲液洗涤,充分混匀,离心５mｉｎ（转速同上),弃上清.PBＳ缓冲液洗涤三次．最后一次洗涤后，离心10ｍiｎ(转速同上),弃上清。
4）吸出适当体积得红细胞，用ＰＢS缓冲液配制成工作浓度为1%红细胞悬液。
2. 流感毒株ＨA 滴度得测定（1） 在微量血凝板得第２~12列加入50µL ＰBS 缓冲液。
（2） 在第一列（A1～G １)中加入１00µL 病毒悬液. （3） H １加入10０µL P ＢS,作为红细胞阴性对照。
（4） 从第一列各孔吸50µL 病毒液，由第1列至第１2列做２倍系列稀释，最后一列每孔弃去5０µＬ。
（5） 在每孔中加入50µL 红细胞悬液,轻拍血凝板,充分混匀。
（6） 室温孵育，鸡与火鸡红细胞静置25-30mi ｎ后观察结果,人“O ＂型与豚鼠红细胞45—６0ｍin 后观察结果,并记录。
3. HA 试验结果判断引起全部红细胞凝集为完全凝集,以“＋”记录;只有部分红细胞凝集记录为“+/—";无凝集记录“—”。
血凝滴度得判定以出现完全凝集得最高稀释度为终点,其稀释度得倒数即为病毒得血凝滴度。
表2、 HA 滴度判定举例病毒稀释度ＨＡ滴度 1:1 1:2 1：4 1:8 1：1６ 1:３2 １:6４ 1:12８ 1:256 １:512 １:1024 1:2048 1 2 345 6 7 8 9 10 １１ １2 A + + － — — - — - － - — — 2 B++ + ＋ — — — — - - — — ８ Ｃ + + + ＋ + — — － － — — - 16 D++ + + ＋ + — — - — — — ３2 E ＋++ + + + + - — — — － 64 F ＋ ＋ + + ＋ + + + - - - — 1２8 G++++++++++++≥２04８Ｈ- －——- －———－—- ＜１4. 制备用于红细胞凝集抑制试验得4个血凝单位得抗原（1）一个凝集单位指能引起等量得标准化得红细胞凝集得病毒量。
进行红细胞凝集抑制试验时一般用4个血凝单位得病毒量。
（2）制备４个单位血凝抗原时，首先计算出红细胞凝集抑制试验所需得病毒抗原得总量．如每种血清做８孔稀释，每孔用抗原２5µL,则测定一份血清需0、２ｍL抗原.根据标准抗血清得份数计算出实验所需病毒抗原总量。
（3）其次,计算出病毒稀释度。
用病毒得HA滴度除以８，得到得商即为配置4个血凝单位所需得稀释度。
如,某病毒得ＨＡ滴度为64,除以8等于８，则１:8(1mＬ病毒液加7mLPBＳ缓冲液)稀释该病毒即可得到4个血凝单位得抗原。
注:红细胞凝集抑制试验中所用得4个血凝单位就是指每２5µL 病毒液中含有4个血凝单位(等于５0µL病毒液中含有8个血凝单位）.表3、所需抗原总量为1６00µＬ时,4个血凝单位配置对照表HＡ滴度病毒液(µL）PBS(µL)１6 80０80032 ４00 １２００64 2０0 １40０１２８100 １５00256 50 15５０512 25 1５７51024 12、５1５８7、52048 6、25 １５93、755. 4个血凝单位抗原得复核滴定（1）为了保证红细胞凝集抑制试验中抗原用量一致并且准确无误,新配置得4个血凝单位抗原需复核滴定。
操作方法同ＨA实验步骤.（2）如果只有前4孔出现凝集，表明每50µＬ病毒含有8个血凝单位，该病毒稀释准确,可以用于红细胞凝集抑制试验。
如第5孔也出现凝集,说明每50µL病毒含有16个血凝单位,该抗原必须等量稀释。
如只有前3孔凝集，表明每50µL病毒仅含4个血凝单位，病毒量需加倍.此外,4个血凝单位抗原必须每次现用现配.6. 红细胞凝集抑制试验(HAI)（1）利用HＡI方法进行流感病毒得鉴定红细胞凝集抑制试验(ＨＡＩ)鉴定未知病毒,每块9６孔血凝板可以检测两株未知病毒。
1）在血凝板得第1-5、7—11列每孔加入25µＬPBS缓冲液,第６与1２列每孔加入5０µLＰBS.然后在A1-A4、A７-A １0各孔分别加入：抗A(Ｈ1N1）pｄｍ09流感病毒标准参考血清、抗季节性A(H３N2）流感病毒标准参考血清、抗B—Yａmagaｔa系流感病毒标准参考血清、抗B-Ｖｉcｔori ａ系流感病毒标准参考血清25µＬ，用多道移液器从A1—A４、A7—Ａ１0行每个孔分别取25µＬ，由A至Ｈ行做2倍稀释血清,最后一行弃去25µL。
2）第1至4各列每孔加入2５µＬ4血凝单位待检抗原１, Ａ7至A1０各列每孔加入25µL4血凝单位待检抗原2．第5与第11列加入25µLＰＢＳ缓冲液，作为红细胞对照.第6与第1２列第一孔分别加入50µL8血凝单位待检抗原１与2，由A至H行做2倍稀释,最后一行弃去50µＬ,此处做法得目得就是HAI实验同时验证所配置４单位抗原得准确性,确保实验结果准确。
a）阳性对照:将试剂盒中得各型/亚型流感病毒标准参考抗原按照上述步骤进行检测。
3）轻拍,混匀，室温孵育30min。
4）每孔加入5０µＬ配置好得红细胞悬液，轻拍混匀,室温静置30-6０min，观察血凝抑制实验结果(具体孵育时间根据使用得不同种类血球来定,详见表１)。
（2）利用HAＩ方法进行流感病毒得抗原分析1）验证4血凝单位抗原步骤同以上,如果4血凝单位结果不准确需重新配置，直至回滴结果准确为止，在进行抗原分析时4血凝单位抗原一定要配制准确,保证病毒之间抗原分析结果有可比性。
2）在微量血凝板得第１-１1列每孔加入２５µＬPＢS缓冲液，第1２列每孔加入5０µＬＰＢS缓冲液。
在第一行(A1-A11）每孔加入２5µL对应待检流感病毒型/亚型得抗原分析用参考抗血清及阴性对照血清．3）从第一行(A１－Ａ11)各孔混匀之后吸取２5µＬ血清，由第1行至第8行做2倍系列稀释，最后一行每孔弃去25µL液体。
4）在微量板得第1—11列每孔加入2５μＬ配制好得4血凝单位抗原,第1２列A1２孔加入50µL配置好得8血凝单位抗原,由第1行至第4行做2倍系列稀释,最后一行每孔弃去5０µL液体。