琼脂糖凝胶电泳

• 3．用于RNA电泳的电泳槽用去污剂洗干净，再用水冲洗，用 乙醇干燥后灌满3% 的H2O2溶液，于室温放置10分钟，然后 用DEPC—SDW冲洗电泳槽，梳子同样处理。 • 4．用胶带封住胶床，放好梳子。
• 5．将温热琼脂糖倒入胶床中，凝胶的厚度在3—5mm之间， 凝固20—60min。
• 6．在凝胶完全凝固之后，小心移去梳子，将胶床放 在电泳槽内，加样孔一侧靠近阴极（黑极）。 • 7．向电泳槽中注入适量的TAE缓冲液，通常缓冲液 高于胶面1cm。 • 8．分别将DNA/RNA样品与加样缓冲液混合,用移液枪 将样品加入加样孔。 • 9．正确连接电泳槽和电源，设定稳压为75V，电流一 般为50mA。 • 10．电泳结束后，在紫外观测仪上进行观察。
200bp—近50kb
5—500bp 分辨率高
•
采用不同浓度的凝胶可以分辨范围广泛的DNA分子。
含不同量琼脂糖的凝胶的分离范围 凝胶中的琼脂糖含量 [%（W/V）]
0.3
0.6
DNA/RNA分子的分离范围 （ kb ）
5—60
1—20
0.7
0.9 1.2
0.8—10
0.5—7 0.4—6
1.5
2
0.2—3
（2）琼脂糖是一种线性多糖聚合物，可以形成具有刚 性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。 浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与 分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同， 电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。
分离长度
琼脂糖凝胶电泳
凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 常用的电泳缓冲液有TAE，TPE和TBE，其中TAE的缓冲容量 最低，长时间电泳将被消耗。
上样缓冲液
电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一 般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液。
作用：
①增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样 孔内。 ②形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速 度和位置。
DYY-6C型 双稳定时电泳仪电源（北京 六一） 输出范围（显示分辨率）：6600V(1V) 4-400mA (1mA) 240W
凝胶成像分析系统
DNA Marker
一个已知分子质量的 DNA样品做对照，用 来确定待测样品的相 对分子质量。
常用电泳缓冲液
缓冲液
缓冲容量
迁移速度
分辨率
用途
高度复杂 DNA混合 物；超螺 旋DNA
Thanks
0.1—2
二、实验仪器、材料与试剂
• 质粒样品、酶切样品和PCR样品。
• 凝胶电泳系统和电泳图像分析系统(凝胶成 像系统)等。 • 琼脂糖、 1XTAE电泳缓冲液、溴化乙锭、 6X载样缓冲液 （ 6X loading buffer）和 DNA分子量标准等。
凝胶电泳系统
美国Bio-rad伯乐 小型水平电泳槽MiniSub Cell GT Cell
• SYBR: 新型低毒，高灵敏度染料，但操作不便，信 号不稳定，易猝灭，价格较昂贵。 • Goldview:主要成分吖啶橙，高毒，在相当程度导致 细胞凋忘。较便宜，但效果不及EB。
三、实验步骤
1. 制备琼脂糖凝胶（1%） 2. 制备凝胶板 3. 加样 4. 电泳 5. 染色 6. 结果观察
二、实验方法 • 1．50×TAE的稀释：如 制备50mL 1×TAE，取 1mL 50×TAE加入 49mL水定容至50mL。 • 2．制备1%的琼脂糖胶 液：取0.2g琼脂糖溶于 20mL TAE中，在短时间 里加热琼脂糖全部熔化， 使溶液冷却至40℃.(加入 浓度为10mg/mL的EB 2μL，使EB的终浓度为 1μg/mL)。
③使样品呈色，使加样操作更方便。
EB染料
• 溴化乙锭（EB）是一种高度灵敏的荧光染色剂， 它在标准的302mm紫外光照射下能发射橙红色 信号，当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼 脂糖凝胶中的EB就插入DNA分子中形成荧光络 合物，使DNA发射的荧光增强几十倍，电泳后 就可直接紫外灯照射下检测琼脂糖中的DNA。
• EB 染 料 优 点 ： 染 色 操 作 简 便 ， 快 速 ， 室 温 下 1 5 20min；不会使核酸断裂；灵敏度高， 10ng 或更少 的 DNA 即可检出，效果较好；可以加到样品中或胶 中。 • EB是诱变剂，有剧毒，使用时一定要戴手套，且一 定要注意等到琼脂糖凉到四十多度的时候再加 EB， 否则EB有一定的挥发性，而鼻黏膜对EB的吸收是较 明显的。 EB废液要经过净化处理再行弃置。
跑出好看的电泳图
• 凝胶一定要加热熔解完全，均匀，可以对着光亮的地方看看清 澈不清澈 ； • 一般情况下，梳子越薄而长，条带越好看 ； • 上样量不宜过多，会造成条带的相互挤压； • 如果点样孔多余，将样点到中间，中间电场比较均匀 ，尽量避 免边缘效应 ； • 做胶的缓冲液和跑胶的缓冲液浓度应该一致； • 加样时不要太快，让其自然沉底，均匀分布在电泳孔内 ； • 电泳开始时可以采用低电压使其跑出孔后，再调高电压。
TAE
TBE TPE
最低
最快 高分子量 高 (高10％) 较慢
很高
价格昂 低分子量 贵，不 高 常用
–Tris-硼酸（TBE）Fra Baidu bibliotek– Tris-乙酸（TAE） – Tris-磷酸（TPE）
• DNA的泳动受到电泳缓冲液和离子浓度的影响。 缺乏离子，电导率严重降低，电泳迁移率很慢；离子强度过高， 电导率升高，极易产生大量的热能，最严重的结果是凝胶熔化， DNA变性。
DNA/RNA的琼脂糖凝胶电泳
一．实验原理
二．实验仪器、材料与试剂 三．实验步骤 四．注意事项与实验技巧
凝胶电泳是分离和纯化DNA片段最常用的技术；
分离、鉴定和提纯核酸首选的标准方法。
根据制备凝胶的材料: 琼脂糖电泳 凝胶 电泳 聚丙烯酰胺电泳
一、实验原理
（1）某物质在电场作用下的迁移速度叫做电泳 的速率，电泳的速率与核酸分子大小和构型有关。 DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场 作用下向正极泳动。分子质量越小跑得越快，紧 密构型快于松散型开环分子或线性分子，从而可 以分离大小不同的DNA或RNA分子。
四、注意事项与实验技巧
• • • • 制胶和加样过程中要防止气泡的产生。 紫外光对人眼有害，观察时加盖玻璃罩，观察时间不宜太长。 EB具有强诱变性，可致癌。必须戴手套操作，严格注意防护。 加样时，Tip头不宜插入样品孔太深，也不要穿破胶孔壁，否 则样品渗漏或DNA带型不整齐。 • 配胶和灌电泳槽需使用同一批缓冲液。因为pH 或离子强度很 小的差别也会在凝胶前部造成紊乱，影响DNA 片段的泳动。 • 梳板的选用 一般每个制胶模具均配有多个齿型不同的梳板，梳 齿宽厚，形成的点样容积较大，用于DNA 片段回收实验等； 相反，梳齿窄而薄，形成的点样容积就较小，用于PCR产物、 酶切产物鉴定等。一般来说，上样量小时尽量选择薄的梳板制 胶，此时电泳条带致密清晰，便于结果分析。