DNA提取(苯酚-氯仿小体法)

苯酚-氯仿法小提DNA

试剂配制：

1：细胞裂解液：0.32 M 的蔗糖；5 mM 的MgCl2

2：DNA稀释缓冲液：0.375 M的NaCl；12 mM的Tris-HCl [PH 7.5]

3：10%的SDS [PH 7.2]

4：5 M的NaCl

5：苯酚-氯仿混合液V/V = 1:1

6：无水乙醇和70%的乙醇

DNA 抽提：

1、收集白细胞:500 μl新鲜/冻存全血(EDTA-2Na抗凝),加入1 ml的细胞裂解液

充分混匀后孵育10分钟，,13000 rpm离心15 sec/3min；

2、洗涤白细胞:离心后弃去上清液,加入1ml双蒸水重悬沉淀,将沉淀充分吹打使

起完全溶解后, 13000 rpm离心1 /5min；

3、稀释DNA，去除蛋白:弃离心后上清液，加入80 μl DNA 稀释缓冲液,重悬

沉淀，完全溶解后，加入10 μl 10% SDS 和5 M NaCl 100μl，用手摇匀,再加双蒸水240 μl稀释DNA；

4、加入300 μl苯酚-氯仿-异戊醇溶液(V/V=25:24:1,PH=7.5).盖紧试管,彻底混合

均匀后, 13000 rpm离心12 min;

5、取上清相转至另一1.5 ml EP管中，加入上清液体积比的1.5-2倍体积的预冷

无水乙醇。反复颠倒数次后,可见有絮状DNA沉淀析出；

6、13000 rpm离心5 min,去上清水相。加入和无水乙醇等量的70%预冷乙醇洗去DNA中的盐后,离心5 min。用100 μl ddH2O或50 μl TE保存DNA备用。

为什么用酚与氯仿抽提DNA时，还要加少量的异戊酵？在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。一般采用氯仿与异戊酵为24：1之比。也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25：24:1（不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24：1的氯仿与异戊醇即成），同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。