质粒提取及双酶切鉴定
质粒提取及双酶切鉴定内切酶内切重组质粒
纯化质粒
通过吸附、洗涤等步骤进一步 纯化质粒DNA。
02 双酶切鉴定
双酶切鉴定的原理
酶切原理
双酶切鉴定基于限制性内切酶对DNA的特异性切割，通过两种不同的限制性内 切酶对质粒进行切割，产生特定的DNA片段。
产物分析
通过电泳分析切割后的DNA片段，判断是否出现预期的酶切产物，从而确定重 组质粒是否正确。
酶切效率计算
通过比较酶切前后的质粒浓度，可以计算出酶切效率。
重组质粒鉴定
通过对比酶切后的质粒片段和预期的重组质粒片段， 可以初步判断重组质粒是否被成功构建。
序列分析
对重组质粒进行序列分析，可以进一步确认重组质粒 的准确性。
实验结果分析注意事项
确保电泳结果的可信度
01
在分析电泳结果时，应排除假阳性或假阴性的可能，确保结果
筛选与鉴定
通过特定的筛选和鉴定方法，如菌落PCR、酶切分析和电泳检测 等，对重组质粒进行筛选和鉴定。
内切酶内切重组质粒的步骤
酶切反应
将重组质粒与适量的内切酶混合，进行酶切 反应。
胶回收
通过凝胶电泳分离酶切产物，并使用胶回收 试剂盒回收目的片段。
连接反应
将两个不同的DNA片段进行连接，形成新的 重组分子。
质粒提取及双酶切鉴定 内切酶内切重组质粒
目录
CONTENTS
• 质粒提取 • 双酶切鉴定 • 内切酶内切重组质粒 • 实验结果分析
01 质粒提取
质粒提取方法
01
02
03
碱裂解法
利用高pH值环境下质粒 DNA与细胞基因组DNA 的变性差异，将二者分离。
煮沸法
通过加热使细胞破裂，释 放质粒DNA，再通过离心 将质粒DNA与其他细胞成 分分离。
质粒蛋白提取、纯化的具体步骤及方法
质粒蛋白提取、纯化的具体步骤及方法携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中，在37℃，IPTG诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（NTA）使镍离子（Ni2+）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（MCAC）。
蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。
一、试剂准备1. LB液体培养基：Trytone 10 g，yeast extract 5 g，NaCl 10 g，用蒸馏水配至1000 mL。
2. 氨苄青霉素：100 mg/mL。
3. 上样缓冲液：100 mM NaH2PO4，10 mM Tris，8M Urea，10 mM 2-ME，pH8.0。
4. Washing Buffer：100 mM NaH2PO4，10 mM Tris，8 M Urea，pH6.3。
5. Elution Buffer：100 mM NaH2PO4，10 mMTris，8M Urea，500 mM Imidazole，pH8.0。
6. IPTG：100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中,0.22 um滤膜抽滤，-20℃保存。
二、获得目的基因1. 通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。
2. 通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。
三、构建重组表达载体1. 载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。
2. PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。
四、获得含重组表达质粒的表达菌种1. 将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。
分子生物学实验课：胶回收-质粒提取-双酶切
子内部中央，放置2分钟，离心1分钟。收集管中的溶液即为已纯化的 GAPDH基因DNA片段。
连接
• 1）在微量离心管中配制下列DNA溶液，全 量为5 μl。
鉴定正反
• TA克隆有两种插入方式，造成正反向 • 常规PCR使得3’端多出一个A碱基
5’ nnnnnnnnnnA 3’ 3’ Annnnnnnnnn 5’
pMD®18-T Vector图谱
酶切鉴定
• 1. 建立酶切反应体系：
DNA
<=1μg
10Xbuffer2
3.0μl
10XBSA
3.0μl
• 42°C下作短暂的热刺激期间，这种复合物便会 被细胞吸收。
• 进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗 传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。 将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可 筛选出转化子。
转化步骤
• 1. 于超净台中取连接产物10μl与100μl大肠杆菌感受态细胞 混合，置冰浴中30分钟。
C：溶液浓度(单位，mol/L) L：光路长度(单位，cm)
核酸纯度分析
• A280nm是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长 • A260/A280比值可进行核酸样品纯度评估：
理论上，纯DNA的A260/A280比值为1.8，纯RNA的 A260/A280比值为2.0。如果比值低，表示受到蛋白（芳 香族）或酚类物质的污染，依据具体实验要求，考虑是否 纯化样品。
沉淀。 • 10,000g 离心1分钟，弃残液。 • 用500μl HB buffer 洗柱，10,000g 离心1分钟，去残液。 • 用700μl DNA wash buffer (乙醇稀释)洗柱，10,000g离心1分钟，去
实验一二重组质粒DNA提取双酶切鉴定凝胶电泳紫外分光法
制胶的桌面相对水平。倒胶时尽量减少气泡的产 生。EB如果在制胶时加入，在60度左右时加入， 使终浓度为0.5ug/ml。不宜过低，染色成像不明显；
不宜过高，导致背景太深。摇匀要沿着瓶壁摇动， 尽量减少气泡产生的可能性。高浓度胶例如2%以 上的EB很难摇匀，而且凝的速度也相对快，强烈 建议跑完胶之后再用EB染色。
31
2.4 双酶切体系
合计
质粒DNA 10×M buffer BamHⅠ HindⅢ ddH2O
37 ℃，1-2h
10μl 2μl 1μl 1μl 6μl
20μl
同学自己加
准备室 老师已 加好
32
思考题？
❖ 为什么要对重组质粒DNA进行双酶切？
33
三、酶切质粒DNA后的琼脂糖凝胶 电泳
1 原理
上层水相转移到新EP管，加入2倍体积无水乙醇，颠倒混匀， -20 ℃ 冰箱中放置15min，12000g10min
弃上清，沉淀中加1ml 70%乙醇，12000g×5min 去上清，管平放室温静置10min， 20 µl TE 溶解DNA
RCF = 1.12r（rpm/1000)2
RCF: 离心力（g） r: 离心半径（mm） rpm: 每分钟转速（r/min）
4.室温凝胶30分钟
过程中不要碰到梳子，尽量保持胶的位置不移动。 时间不宜过久，导致胶干燥变形；不宜过短，影 响胶内部孔径形成。
5.拔梳子，放入电泳槽。
缓缓地将梳子垂直从梳孔拔出，尽可能使梳子是 同时从各个胶孔拔出的。暂时不用的胶最好放入 电泳槽电泳液中浸泡。电泳液要浸没胶1mm。
三、上样电泳
步骤
Buffer不要用成H2O，称量相对准确
2.融胶，加热到胶产生大量的气泡时，拿出摇匀， 非常热，小心烫手，另外注意不要加热过度使胶 继续加热到完全溶解，拿出摇匀，再加热到沸腾。 冲出瓶子。因此注意选择起码为胶体积2倍以上的
实验报告双酶切实验目的(3篇)
第1篇一、实验目的1. 学习双酶切法获取目的基因片段的原理和方法。
2. 掌握DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。
3. 熟悉核酸琼脂糖胶回收的原理和方法。
4. 熟练操作限制性核酸内切酶、DNA连接酶等分子生物学实验技术。
5. 培养实验操作规范，提高实验技能。
二、实验原理1. 双酶切法：利用两种限制性核酸内切酶分别识别并切割目的基因片段和载体质粒，产生黏性末端或平末端，以便于连接。
2. DNA琼脂糖凝胶电泳：通过琼脂糖凝胶电泳分离不同分子量的DNA片段，便于观察和分析目的基因片段。
3. 核酸琼脂糖胶回收：利用琼脂糖凝胶电泳分离的DNA片段，通过酶解、溶解、纯化等步骤获得高纯度的目的基因片段。
三、实验器材1. 仪器：DNA电泳仪、凝胶成像系统、紫外分光光度计、PCR仪、移液器、微量离心机、恒温培养箱、电热恒温器等。
2. 试剂：限制性核酸内切酶、DNA连接酶、T4 DNA连接酶、DNA标记物、琼脂糖、DNA模板、DNA载体、DNA标记染料、缓冲液、DNA提取试剂盒等。
四、实验步骤1. 提取DNA模板：按照DNA提取试剂盒说明书提取目的基因片段和载体质粒的DNA。
2. 设计酶切反应体系：根据限制性核酸内切酶的识别序列，设计酶切反应体系，包括限制性核酸内切酶、DNA模板、缓冲液、DNA标记物等。
3. 酶切反应：将酶切反应体系放入恒温培养箱中，在适宜的温度下进行酶切反应。
4. 酶切产物鉴定：通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，观察DNA条带，鉴定酶切是否成功。
5. DNA连接：将酶切后的目的基因片段和载体质粒进行连接反应，连接条件按照DNA连接酶说明书进行。
6. 连接产物鉴定：通过琼脂糖凝胶电泳分离连接产物，观察DNA条带，鉴定连接是否成功。
7. 核酸琼脂糖胶回收：将连接产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，回收目的基因片段。
8. 目的基因片段纯化：利用核酸琼脂糖胶回收试剂盒对回收的目的基因片段进行纯化。
9. 纯化产物鉴定：通过琼脂糖凝胶电泳分离纯化产物，观察DNA条带，鉴定纯化是否成功。
研究生实验三 重组质粒DNA提取、双酶切鉴定共37页
6、最大的骄傲于最大的自卑都表示心灵的最软弱无力。——斯宾诺莎 7、自知之明是最难得的知识。——西班牙 8、勇气通往天堂，怯懦通往地狱。——塞内加 9、有时候读书是一种巧妙地避开思考的方法。——赫尔普斯 10、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话。——笛卡儿
研究生实验三 重组质粒 DNA提取、双酶切鉴定
31、别人笑我太疯癫，我笑他人看不 穿。(名 言网) 32、我不想听失意者的哭泣，抱怨者 的牢骚 ，这是 羊群中 的瘟疫 ，我不 能被它 传染。 我要尽 量避免 绝望， 辛勤耕 耘，忍 受苦楚 。我一 试再试 ，争取 每天的 成功， 避免以 失败收 常在别 人停滞 不前时 ，我继 续拼搏 。
Thank you
பைடு நூலகம்
33、如果惧怕前面跌宕的山岩，生命 就永远 只能是 死水一 潭。 34、当你眼泪忍不住要流出来的时候 ，睁大 眼睛， 千万别 眨眼!你会看到 世界由 清晰变 模糊的 全过程 ，心会 在你泪 水落下 的那一 刻变得 清澈明 晰。盐 。注定 要融化 的，也 许是用 眼泪的 方式。
35、不要以为自己成功一次就可以了 ，也不 要以为 过去的 光荣可 以被永 远肯定 。
重组质粒鉴定
重组质粒进行鉴定时，可以采用两种方法进行鉴定。
1.通过pcr方法鉴定：以重组质粒为模板，pcr产物的特异性引物或载体的通用引物进行PCR 扩增后电泳鉴定。
2..就是酶切鉴定：双酶切鉴定时只要出现质粒条带和你的插入片段的目的条带就行了。
至于出现质粒条带很亮，而目的条带暗的现象，其实很正常。
因为一般情况下，质粒的碱基数比你的目的条带的碱基数多的多（一般质粒碱基都有好几千bp，而目的条带通常就几百到一千多bp）。
当我们用EB进行染色时，EB是掺入到到dna链中，碱基数越多则掺入的eb就越多，在紫外光下显示的条带就越亮，也就是说条带亮度与你的片段的长度成正比。
最后，如果两种方法都鉴定正确了，你就可以送到公司进行测序，做最后的鉴定了。
如果你非要看到你的目的条带很明显的话，也可以采取如下方法：
1.电泳时吸取的产物量加大，加入到大孔梳子的胶当中，如可以加产物10微升或更多。
2.凝胶成像拍照时，可以适当把曝光时间提高一点。
3.如果还是不清楚，就把你的酶切产物浓缩一下。
实验二-质粒DNA的提取及酶切
实验二质粒DNA的提取及酶切（8学时，6小时）一、实验目的：通过本实验学习和掌握碱裂解法提取和酶切质粒的技术与方法。
二、实验原理：碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA之间在拓扑学上的差异而达到分离目的。
环状闭合的质粒DNA在限制性内切酶的作用下成为线状质粒DNA，内切酶能识别DNA分子中某一特定的核苷酸序列。
三、仪器、材料、试剂(一)仪器：1、恒温摇床2、台式离心机3、高压灭菌锅4、振荡器(二)材料：1、含PUC-18质粒的大肠杆菌2、乙二胺四乙酸(EDTA)3、三羟甲基氨基甲烷(Tris) 4.葡萄糖 5.氢氧化钠(NaOH) 6.十二烷基硫酸钠(SDS) 7、乙酸钾(KAc) 8、冰醋酸(HAc) 9、盐酸(HCl) 10、Tris饱和酚11、氯仿12、异戊醇13、乙醇14、胰RNA酶15、氨苄青霉素16、离心管(三)试剂：1、溶液І (pH8.0) 2、溶液Ⅱ3、溶液Ш4、TE缓冲液(pH8.0)5、0.5mol/LEDTA6、氯仿:异戊醇(V:V=24:1)7、Tris饱和酚:氯仿:异戊醇(V:V:V=25:24:1)8、70%乙醇9、胰RNA酶10、ECOR I酶四、实验步骤（一）质粒DNA的提取1、先在3mL LB液体培养基中加入3uL羧苄青霉素(终浓度50ug/mL)，然后接入一个含puc-18质粒的大肠杆菌单菌落，37℃震荡培养过夜。
2、取过夜培养的菌液1mL加入1.5mL离心管中，4000r/min，倒出培养液，将所有菌体细胞收集在一个离心管中。
3、加入100µl溶液І于含菌体细胞的小指管中，旋涡震荡将细菌沉淀悬浮，室温放置10min。
4、加入200µl溶液Ⅱ(新鲜配置)，轻轻混匀内容物，溶液逐渐变清亮后加入溶液Ш(千万不可用旋涡震荡器，裂解时间不超过5min)。
5、加入150µl溶液Ш(冰上预冷)，盖紧管口，轻轻混匀数次。
质粒DNA提取、定量、酶切与PCR鉴定
限制性内切酶
影响酶切反应的因素
➢ 底物DNA的纯度：主要污染DNA 的某些物质，如酚、氯仿、乙醇等 均能抑制酶反应; ➢ 反应系统：主要是反应缓冲液中的离子强度,如NaCl和Mg2+, 合适 离子强度可以激发酶切反应; ➢ 反应体积：一般应尽量小，且酶切反应中甘油浓度应低于5%; ➢ 保温时间与温度：温度改变会使酶识别错误;
DNA样品较纯,符合实验要求 RNA污染 有蛋白质或其它杂质的污染
实验仪器
核酸蛋白检测仪(Eppendorf BioPhotometer plus)
比色杯
数据处理
测量次数 1 2 3
平均值
质粒DNA浓度
(μg/ml)
Ratio值
(A260/A280)
定量检测
第三部分 酶切鉴定
DNA Restriction Enzyme Digestion
溶液反应温度 升至中温72℃ ，在 Taq酶作 用下，以dNTP 为原料，引物 为复制起点， 模板DNA的一 条单链在解链 和退火之后延 伸为一条双链
延伸
72˚C
实验原理
变性
95˚C
加热使模板DNA 在高温下90℃-95 变性，双链解链
退火
Tm-5˚C
降低溶液温 度，使合成 引物在低温 （35－70℃, 一般低于模 板Tm值的5℃ 左右），与 模板DNA互补 退火形成部 分双链
✓ 注意:我们接下来要用的eppendorf公司生产的紫外分光光 度计,会根据样品的稀释倍数自动算出质粒DNA的最终浓度 和Ratio值.
实验方法
2.根据在260nm以及在280nm的读数比值估计核酸的 纯度（Ratio=A260/A280）
• Ratio= 1.8 • Ratio＞1.9 • Ratio＜1.6
实验3质粒的提取和鉴定
Ⅱ型限制与修饰系统
• 占90%以上，即通常指的DNA限制性内切酶，它 们能识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内 进行切割，产生特异的DNA片段；
• Ⅱ型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅 助因子，识别顺序一般为4-6个碱基对的反转重复 顺序；
• Ⅱ型内切酶切割双链DNA产生3种不同的切口： 5’端突出，3’端突出和平末端。
• 溶液Ⅰ—溶菌液： 50mM 葡萄糖，（），10mM EDTA，2mg/ml 溶
菌酶。
• 溶液Ⅱ— NaOH-SDS液：0.2N NaOH，1% SDS。
• 溶液Ⅲ— 3mol/L NaAc（）溶液：5M KAC 10ml，冰醋酸 ，水 。
四步骤(一) 细菌培养与质粒扩增
1. 挑单克隆菌株接种到4ml LB培养液中（含Amp 50µg/ml），37 ℃225rpm振荡培养过夜。
• 12．取样品10 µl加2ul 6× Loading buffer于1 %琼脂糖电泳，电泳凝胶在凝胶成像系统上成像。
双酶切实验材料
• 限制性内切酶：EcoRⅠ、XbaⅠ和HindⅢ • DNA：λDNA和质粒pCDNA-p38 •Cl 10M MgCl2
限制性切酶以内切的方式水解核酸链中的磷酸二 酯键，产生的DNA片段5’端带磷酸基团，3’ 端为-OH。
限制性核酸内切酶分类
• 识别切割特性 • 催化条件 • 是否具有修饰酶活性
• 至2005年1月，共发现限制酶3681种
– Ⅰ 型59种 – Ⅱ 型3612种 – Ⅲ 型10种
• 商业化的限制酶有 588 种，在 Ⅱ 型限制酶 中共有 221 种特异性。
2.在一定电场强度下，DNA分子的迁移取决于分子 筛效应，即DNA分子本身的大小和构型(相对分子 质量不同的DNA片段泳动速度不一样)，且DNA分 子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。 因此，凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的 DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不 同的DNA分子：其中超螺旋结构泳动最快，其次 为线性结构，最慢的可能是复制中间体（没有复制 完的两个质粒连在一起），而不是开环结构（用
实验二 阳性重组质粒的抽提及双酶切鉴定
实验二阳性重组质粒的抽提及双酶切鉴定实验目的：练习质粒的抽提及双酶切的实验过程，熟悉相关操作。
实验材料及设备pMD-T重组质粒；内切酶Xba I 及Pst I；10×M Buffe r；琼脂糖；电泳仪及电泳所需试剂。
实验步骤A 大肠杆菌的扩繁及质粒DNA碱裂解法抽提挑取筛选平板上的白色菌落，接种到5ml LB液体培养基(含100μg/ml Amp)中，37℃振荡培养约12小时至对数生长后期↓取培养液倒入2 ml eppendorf管中，4℃下12000 rpm离心2分钟，去上清↓沉淀中加入150 μl溶液I（50 mmol/L 葡萄糖,25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0),10mmol/L EDTA (pH8.0)），剧烈振荡使菌体悬浮，室温下放置5分钟↓加入250 μl新配制的溶液II (0.2 mol/L NaOH, 1％SDS, 临用前配制)盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次，以混匀内容物(千万不要振荡)，室温下放置5分钟↓加入180 μl预冷的溶液III（5 mol/L KAc 60ml, 冰醋酸11.5ml, H2O 28.5ml, 定容至100ml , 并高压灭菌）盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒，使沉淀混匀↓冰浴10分钟，4℃下12000rpm离心10分钟↓上清液移入干净eppendorf管中，计算体积↓加入各1/2体积的Tris-饱和酚以及氯仿/异戊醇(24：1)，混匀20℃下12000 rpm离心10分钟，取上清, 计算体积↓加等体积的氯仿/异戊醇（24：1），12000 rpm离心10分钟↓将上清移入干净eppendorf管中，计算体积↓加入2倍体积的无水乙醇↓混匀后置于-20℃冰箱中30分钟↓然后4℃下12000 rpm离心10分钟↓弃上清，将管口敞开倒置于纸巾上使所有液体流出，用70％乙醇、无水乙醇各洗沉淀一次↓将管倒置于纸巾上使液体流尽，室温干燥↓将沉淀溶于100 μl TE缓冲液(pH8.0，（含20μg /ml RNaseA )中，储于-20℃冰箱中备用B 双酶切反应1、在PCR管中配制下列酶切体系（1×M Buffer）：重组质粒10 ul（未稀释的原液）ddH2O 6 ul10×M Buffer 2ulXba I 1ul (15 U )Pst I 1ul (15 U )总体积20ul2、反应管置37℃下，酶切反应3～4小时。
各种酶切体系
－
2
6
2.4
10×buffer D
2
1
1
1
3
4
BSA(10µg/µl)
0.2
0.1
0.1
0.2
0.6
0.6
DNA(1µg/µl)
8.3
4
7.9
6
18
30
Not I(10U/µl)
0.5
0.3
0.5
0.4
1.2
1.5
Sal I(10U/µl)
0.5
0.3
0.5
0.4
1.2
1.5
反应条件
37℃，1~3hr，电泳检测
NheI单酶切
依DNA量定体系
20µl
10µl
灭菌去离子水
-
-
10×buffer
2
1
DNA(1µg/µl)
17
8.5
Nhe I
1
0.5
反应条件
37℃，1~3hr，电泳检测
Xbal I和Sal I双酶切体系鉴定
依DNA量定体系
20µl
10µl
10µl
灭菌去离子水
8.5
4.3
－
10×buffer
2
1
1
BSA(10µg/µl)
0.2
0.1
0.1
DNA(1µg/µl)
8.3
4
7.9
Xba I(10U/µl)
0.5
0.3
0.5
Sal I(10U/µl)
0.5
0.3
0.5
反应条件
EcoR I酶切鉴定
组分
体系
质粒DNA
质粒提取及双酶切鉴定
(5) 氯仿：异戊醇（24:1）
(6) 无水乙醇、70%乙醇、醋酸钠（pH5.2）
（三）限制性内切酶
1）EcoRI
识别顺序为：5’…… G|AATTC ……3’ 3’…… CTTAA|G ……5’
2）XhoI 识别顺序为：5’…… C|TCGAG ……3’ 3’…… GAGCT|C ……5’
四、实验步骤
一实验目的及原理学习和掌握碱裂解法提取质粒的方法学习和掌握碱裂解法提取质粒的方法学习和掌握双酶切鉴定学习和掌握双酶切鉴定二实验原理一质粒提取原理一质粒提取原理质粒plasmid独立于染色体外的能自主复制且稳定遗传的遗传因子是一种环状的双链dna分子
LOGO
质粒提取及双酶切鉴定
2011年5月9日
主要内容
4. 加200μl新配制的溶液Ⅱ,立即温和颠倒离心管5次， 使菌体充分裂解, 切勿振荡!将离心管放置于冰上12min。(不要超过2min)。
5. 加150μl用冰预冷的溶液III, 反复温和颠倒5次, 将 管置于冰上3～5min。
6. 4 ℃、12000rpm离心15min,将上清液约400ul转移到另 一离心管中。
(1)溶液Ⅰ:
Tris·HCl(pH8.0)
EDTA(pH8.0)
葡萄糖
(2)溶液Ⅱ(新鲜配制) :
NaOH
0.2mol/L
SDS
1%(W/V)
25mmol/L 10mmol/L 50mmol/L
(3)溶液Ⅲ(100ml):
5mol/L乙酸钾
60ml
冰乙酸
11.5ml(pH4.8)
水
28.5ml
(4) 苯酚
10ХBuffer
2ul
DDW
8ul
感受态细胞的制备和转化,质粒提取和酶切鉴定
实验注意事项
微量移液器的正确使用 废液倒在水池中，枪头扔到垃圾桶中 加不同溶液要更换枪头 转移上清时不要吸到下层沉淀
注 意
四、酶切鉴定
限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）：能在 特异位点（酶切位点）上催化双链DNA分子的断裂，产 生相应的限制性DNA片段
利用限制性内切酶特异的识别DNA特异的核苷酸序列， 并切割DNA，产生一定长度的DNA片段，通过琼脂糖电 泳对酶切前后产物分析可鉴别目的基因（重组质粒DNA）
XhoI EcoRI
双酶切 重组质粒
pCS2+） ngn3
电泳检测
酶切实验步骤
酶切反应体系配制
重组质粒DNA 10×M buffer XhoⅠ EcoRI ddH2O
当OD600nm值为0.3～0.5时，取出
3. 取1mL菌液于1.5mL离心管中，置冰浴5min，离心， 收集菌体
4. 弃上清，加0.5mL冰预冷的0.1mol/L CaCl2悬浮细菌， 冰浴10min
5. 离心，弃上清，收集菌体 6. 加入冰预冷的 CaCl2悬浮细菌，冰上放置，即为感受
态细胞
二、重组质粒DNA的转化
实验内容
1
感受态细胞的制备
2
重组质粒DNA的转化
3
质粒提取
4
酶切鉴定
感受态细胞(COMPETENT CELL)
感受态：细胞处于能够吸收外源DNA的状态 感受态细胞：受体细胞经特殊处理后，细胞膜的通透
性发生变化，能允许外源DNA的载体分子通过的细 胞
质粒DNA的转化
转化（transformation）：目的基因进入受体细胞 内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程
实验一 质粒提取、酶切及琼脂糖电泳检测
实验一质粒提取、酶切及琼脂糖电泳检测一、实验内容1.采用碱裂解法提取质粒DNA2.采用限制性内切酶对质粒进行酶切3.采用琼脂糖电泳对所提取的质粒DNA及其酶切产物进行鉴定二、实验目的和要求1.掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理和方法2.掌握限制性内切酶酶切DNA的操作过程3.掌握琼脂糖电泳的原理和方法三、实验仪器、材料和试剂1.仪器：摇床、无菌操作台、离心机、电泳仪、凝胶成像仪等2. 材料：移液枪、枪头、离心管、三角烧瓶等3. 试剂：LB培养基，卡那霉素，质粒提取试剂盒，琼脂糖，电泳缓冲液TAE,核酸染料，DNA Marker(DL2000，λ-Hind III digest DNAMarker), Eco R I内切酶等。
四、实验操作1. 质粒提取（1）挑取单菌落至3 mL LB液体培养基，37℃摇动（200 rpm）培养过夜。
（2）转移菌液至1.5 mL Eppendorf管中，12000 rpm离心45 sec，尽量弃尽上清。
（3）加入250 l 预冷的PI(请先检查是否加入RNaseA)，使用移液器彻底混匀细菌沉淀，充分悬浮，静置2 min。
注意：如果有未彻底悬浮的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度的偏低。
（4）向离心管中加入250ul溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
注意：温和地混合，不要剧烈振荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片段。
此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒收到破坏。
如果未变得清亮，可能菌体过多，裂解得不彻底，应减少菌体量。
（5）向离心管中加入350ul 溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。
12,000rpm离心1min，此时在离心管底部形成沉淀。
注意：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。
如果上清中还有微小的白色沉淀，可再次离心后取上清。
（6）向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500ul的平衡液BL，12,000rpm 离心1min，倒掉收集管中废液，将吸附管重新放入收集管中。
双酶切实验原理
双酶切实验原理双酶切实验是一种常用的分子生物学技术，用于分析DNA序列。
它基于限制性内切酶的特异性切割DNA的原理，结合凝胶电泳技术，可以对DNA进行特异性切割和分离，从而获得所需的DNA片段。
本文将介绍双酶切实验的原理及其操作步骤。
1.双酶切实验原理。
双酶切实验的原理基于限制性内切酶对DNA的特异性切割。
限制性内切酶是一类能够识别DNA特定序列并在该序列上切割的酶，它们能够将DNA分子切割成具有特定序列的片段。
在双酶切实验中，通常会使用两种不同的限制性内切酶，它们分别识别DNA的不同序列，并在这些序列上进行切割。
通过这种双酶切割的方式，可以获得具有特定序列的DNA片段。
2.双酶切实验操作步骤。
双酶切实验的操作步骤主要包括DNA提取、酶切反应、凝胶电泳和DNA可视化等步骤。
首先，需要从样品中提取DNA。
提取的DNA可以是来自细菌、动植物或其他生物体的基因组DNA，也可以是从质粒或病毒中提取的DNA。
提取的DNA需要经过纯化和定量后，才能进行后续的操作。
接下来，将提取的DNA与两种限制性内切酶和相应的缓冲液混合，进行酶切反应。
酶切反应的条件需要根据所使用的酶的特性来确定，包括反应温度、反应时间和反应缓冲液的配制等。
酶切反应完成后，需要对反应产物进行电泳分离。
在凝胶电泳中，将酶切反应产物加载到琼脂糖凝胶上，通电进行分离。
由于DNA分子在电场中具有不同的迁移速度，可以根据DNA片段的大小进行分离和检测。
分离完成后，可以通过染色或荧光标记等方法对DNA进行可视化。
3.双酶切实验的应用。
双酶切实验在分子生物学研究中有着广泛的应用。
它可以用于分析DNA序列的特异性，鉴定基因型、进行基因工程、构建基因库等。
通过双酶切实验，可以获得特定序列的DNA片段，为后续的克隆、测序和分析提供了重要的基础。
总的来说，双酶切实验是一种重要的分子生物学技术，它基于限制性内切酶的特异性切割原理，能够对DNA进行特异性切割和分离。
重组质粒双酶切鉴定结果
重组质粒双酶切鉴定结果
质粒双酶切鉴定是一种用于确定质粒DNA序列的技术。
通过
使用限制性内切酶对质粒进行酶切，然后运用电泳分析，可以获得关于质粒DNA序列的信息。
重组质粒双酶切鉴定结果通常包括以下内容：
1. 双酶切酶的酶切模式：双酶切鉴定通常使用两种限制性内切酶来进行酶切。
酶切模式描述了每个酶切酶在质粒上切割的位置，包括切割位点及其与质粒线性DNA的相对位置。
2. 酶切产物的大小：通过电泳将酶切后的质粒DNA进行分离，可以得到一系列的DNA片段。
通过估算这些片段的大小，可
以进一步确定酶切酶的切割位点以及质粒DNA的序列。
3. 酶切图谱：酶切图谱是通过将电泳分离的酶切产物进行可视化的图像，通常以荧光标记或放射性标记的方式进行。
酶切图谱可以帮助鉴定质粒的酶切模式，确认切割位点，以及评估酶切的效果。
通过分析重组质粒双酶切鉴定结果，可以确定质粒的基本结构和序列信息。
这对于研究质粒的功能和用途，以及进行基因工程和生物技术研究都具有重要意义。
动物分子生物学实验6重组质粒DNA的提取及插入DNA的酶切鉴定
125
四、实验步骤
接含质粒的单菌落于3ml LB Amp+液体培养基中 370C，190rpm振荡培养过夜
取1.5ml菌液入1.5ml的dorf管中 6000rpm、离心2min，弃上清，收集菌体 100uL溶液I悬浮菌体（充分振荡），室温（或冰浴）
10min 加入200uL溶液II（轻轻混匀），冰上静置5min裂解菌体
3 将细菌沉淀悬浮于100μL溶液Ⅰ中，充分混匀，室 温放置10 min。
4 加200μL溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管盖，混匀内 容物，将离心管放冰上5 min。
5 加入150μL溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数 次使混匀。冰上放置15min。
6 12 000r/min，离心10 min，将上清转至另一离心管中。 向上清中加入等体积酚：氯仿 (1:1)（去蛋白），反复 混匀，12 000r/min，离心5 min，将上清转至另一离心 管中。转移时小心！（total volume: 400 μL）
－ 原核细胞 － 繁殖力强, 2-30 分细胞分裂、加倍
DNA
基因组107bp, 编码约2000种蛋白质
质粒（plasmid）
－ 染色体外的稳定遗传因子
－ 双链、闭环的DNA分子，大小1-200 kb 不等 － 存在于细菌、放线菌和真菌细胞中
－ 具有自主复制和转录能力，并表达所携带的遗传信息
DNA
*溶液II 0.2mol/L溶液(3M, pH=4.8)：
60mL的5mol/L KAc, 11.5ml冰醋酸， 28.5mL H2O
*饱和酚(pH8.0 Tris-HCl饱和) *氯仿 *3M乙酸钠溶液(pH5.2) * TE缓冲液:
10mmol/L，Tris-HCl, 1mmol/L，EDTA ， pH8.0, * 100%乙醇与70％乙醇
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
（二）双酶切原理
❖ 限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）是一 类能识别双链ＤＮＡ中特定碱基顺序的核酸水解酶，这 些酶都是从原核生物中发现。
❖ 根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰 酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类，我们这里用到的是 Ⅱ型。
❖ Ⅱ型限制性内切酶它们能识别双链ＤＮＡ的特异顺序， 并在这个顺序内进行切割，产生特异的ＤＮＡ片段。
如EcoRI的识别顺序为：
5’…… G|AATTC ……3’
3’…… CTTAA|G …… 5’
在双链上交错切割的位置切割后生成
5’……G
AATTC……3’
3’……CTTAA
G……5’
三、实验材料与试剂
（一）材料 大肠杆菌DH5α（含有携带插入片段gcp的质粒
PMD19-T）
三、实验材料与试剂
（二）试剂
(一) 质粒提取
1. 挑转化后的单菌落接种到含有适当抗生素(Amp)的LB液 体培养基中,37℃振荡培养过夜。
2. 将1ml的培养物倒入1.5ml的EP管中, 4℃、12000rpm离 心1min。弃去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。
3. 将细菌沉淀重悬于100μl冰预冷的溶液Ⅰ中, 吹打沉 淀至完全混匀(无块状悬浮)。
(5) 氯仿：异戊醇（24:1）
(6) 无水乙醇、70%乙醇、醋酸钠（pH5.2）
（三）限制性内切酶
1）EcoRI
识别顺序为：5’…… G|AATTC ……3’ 3’…… CTTAA|G ……5’
2）XhoI 识别顺序为：5’…… C|TCGAG ……3’ 3’…… GAGCT|C ……5’
四、实验步骤
(1)溶液Ⅰ:
Tris·HCl(pH8.0)
EDTA(pH8.0)
葡萄糖
(2)溶液Ⅱ(新鲜配制) :
NaOH
0.2mol/L
SDS
1%(W/V)
25mmol/L 10mmol/L 50mmol/L
(3)溶液Ⅲ(100ml):
5mol/L乙酸钾
60ml
冰乙酸
11.5ml(pH4.8)
水
28.5ml
(4) 苯酚
LOGO
质粒提取及双酶切鉴定
2011年5月9日
主要内容
1
实验目的及原理
2
实验过程
3
实验结果
4
思考题
一、实验目的及原理
❖ 学习和掌握碱裂解法提取质粒的方法 ❖ 学习和掌握双酶切鉴定
二、实验原理
（一）质粒提取原理
❖质粒(Plasmid) ： 独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的 遗传因子，是一种环状的双链DNA分子。 存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细 胞中，在细菌细胞中最多。
❖ 2.试述质粒提取过程中苯酚：氯仿：异戊醇 （25：24：1）各自的作用？
❖ 3.通过查找资料，简述三种限制性内切酶的特 点。
LOGO
以上有不当之处，请大家给与批评指正， 谢谢大家！
20
10. 加1ml 70％乙醇溶液洗涤沉淀，4 ℃、12000rpm离心 5min。弃去上清液，在空气中使DNA沉淀干燥。
11. 用20μl灭菌的蒸馏水溶解DNA,加1μl胰RNA酶消化 RNA 30min。
（二）双酶切及电泳检测
双酶切体系（20ul）：
质粒
7ul
EcoRI
1.5ul
XhoI
1.5ul
4. 加200μl新配制的溶液Ⅱ,立即温和颠倒离心管5次， 使菌体充分裂解, 切勿振荡!将离心管放置于冰上12min。(不要超过2min)。
5. 加150μl用冰预冷的溶液III, 反复温和颠倒5次, 将 管置于冰上3～5min。
6. 4 ℃、12000rpm离心15min,将上清液约400ul转移到另 一离心管中。
7. 加1/2体积的苯酚，1/2体积的氯仿：异戊醇（24:1） 振荡混匀。 4 ℃、12000rpm离心10min，将上清液约 400ul转移到另一离心管中。
8. 加2倍体积的无水乙醇和1/10体积的醋酸钠沉淀质粒 DNA,振荡混匀,于－20 ℃放置15min。
9.4 ℃、12000rpm离心5min。小心除去上清液，将附于管 壁的液滴除尽。
10ХBuffer
2ulLeabharlann DDW8ul37℃水浴酶切半小时，加2ul Loading Buffer终止反应。
电泳检测。
五、实验结果
❖ 质粒电泳图 有三条条带，分别是超螺旋、线性和开环结构。
五、实验结果
酶切电泳图
载体PMD—19T（2692bp） 插入片段gcp（702bp）
六、思考题
❖ 1.试述在提取质粒过程中溶液II、III的作用是 什么?
本实验采用SDS（十二烷基硫酸钠）碱裂解法提取质 粒DNA。将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂 中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质 粒DNA释放到上清中。在裂解过程中，细菌蛋白质、破 裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合 物，被十二烷基硫酸盐包盖。当用K+取代Na＋时，这些 复合物会从溶液中有效地沉淀下来。离心除去变性剂后， 就可以从上清中回收复性的质粒DNA。