离体花粉(小孢子)发育途径

离体花粉(小孢子)发育途径
一、花粉的发育阶段
花粉是花粉粒的总称，花粉粒是由小孢子发育而成的雄配子体。

为了了解培养条件下的小孢子发育，有必要首先了解小孢子的正常发育情况。

以被子植物为例，正常条件下雄蕊的花药中可分化出孢原组织，孢原组织进行平周分裂形成造孢细胞，再进一步分化为小孢子母细胞(通常称为花粉母细胞，染色体数为2n，花粉母细胞经减数分裂由一个细胞形成4个细胞(四分体时期)。

每个细胞就是一个单倍的小孢子(单核花粉)，四分体的4个单倍体细胞彼此分离，形成4个具有单细胞核的花粉粒，此时的细胞含有浓厚的细胞质，核位于细胞中央，即单核居中期；之后单核小孢子的核由于细胞质的液泡化，被大液泡挤压到萌发孔相对的一边，这就是所谓的单核靠边期；紧接着进行第一次有丝分裂，成为二核小孢子，其中稍大的一个为花粉管细胞核(营养核)，较小的一个为生殖核，第二次有丝分裂是生殖核的分裂。

这样就形成有三个核的成熟花粉粒(雄配子体)(图5-2)。

植物的种类不同，第二次有丝分裂的时间也不同，一些植物在开花、授粉之前只进行一次有丝分裂。

只有发育到二核花粉时期，它们的第二次有丝分裂是在授粉之后，花粉管萌发、生殖核进入花粉管后才进行分裂的。

图5-2花粉的发育阶段
二、离体小孢子的发育途径
正常条件下，花粉发育过程都要经过一次不均等的胞质分裂，形成一个较小的生殖细胞和一个较大的营养细胞，称为A型途径。

在离体条件下，由于外界环境的改变，小孢子的首次分裂除了出现不均等分裂外，偶尔也发生不对称分裂机制受到破坏的情况，即花粉第一次有丝分裂时，细胞核在比较靠近小孢子的中心开始有丝分裂，从而发生对称的胞质分裂，最终产生两个相等细胞的花粉粒。

这种对称胞质分裂的异常发育类型称为B型途径，在大麦、烟草等作物的花药培养中可以见到。

(一)花粉不均等分裂途径(A型途径)
当小孢子的第一次有丝分裂为不均等分裂时，形成一个较小的生殖细胞和一个较大的营养细胞，在培养条件下，由于改变了花粉原来的生活环境，花粉的正常发育途径受到抑制，花粉第二次分裂不再像正常花粉发育那样由生殖核再分裂一次形成两个精子核，而是像胚细胞一样持续分裂增殖。

这时花粉的分裂增殖方式有4种类型(图5-3)。

图5-3小孢子正常发育途径和培养条件下胚胎发育途径的比较(Reinert et al.，1977，略有修改)
1．营养细胞发育途径(A-V途径)
花粉经第一次有丝分裂形成不均等的营养核和生殖核，其生殖核较小，一般不分裂或分裂几次就退化，而较大的营养核经多次分裂而形成多细胞团，并迅速增殖突破花粉壁形成胚状体或愈伤组织，最后再生成单倍体植株。

2．生殖细胞发育途径(A-G途径)
营养核分裂1次或2次后退化，而生殖核经多次分裂发育成多细胞团，最后再生成单倍体植株。

3.营养细胞和生殖细胞并进发育途径(E途径)
营养核与生殖核各自分裂形成单倍体愈伤组织或胚状体，最后形成单倍体植株。

4．营养核与生殖核融合发育途径(C途径)
营养核与生殖核融合后再分裂，最后形成二倍体或者多倍体植株。

(二)花粉均等分裂途径(B型途径)
花粉进行均等分裂形成两个均等的子核，这种分裂方式也存在两种情况，一是均等的子核各自分裂形成单倍体愈伤组织或胚状体，最后形成单倍体植株。

二是小孢子均等分裂形成两个大致相等的子细胞，这两个细胞发生第二次有丝分裂后发生核融合，并继续分裂形成多细胞团，破壁后形成胚状体或愈伤组织，最后形成多倍体胚。

虽然花粉在离体培养下存在不同的发育方式，但在某一具体植物的花药培养中可能出现一种或两种以上的不同发育方式。

三、雄核发育启动的机理
花粉是产生花粉植株的原始细胞，其第一次有丝分裂在本质上与合子的第一次孢子体分裂相似，把花粉形成植株的途径称为花粉孢子体发育途径，也称为雄核发育途径。

为了对单倍体诱导进行遗传操作和控制，人们对雄核发育启动的机理一直很感兴趣。

在研究早期，人们发现植物中存在一种不正常的花粉具有胚胎发生潜力，后来人们又发现不正常花粉并不是花粉胚的唯一或主要的来源。

离体条件下，在外界环境的诱导下，花粉可以改变其正常发育途径转入雄核发育途径，在这个过程中，细胞内的基因表达和生理生化反应均发生了相应的变化。

归结雄核发育启动的机理，大致可以分为以下三点。

(一)雄核发育与P-花粉
Sunderland等在烟草和杂种牡丹的活体花粉和离体培养的花药中发现，在一个植物种或品种的花粉群体中出现正常和非正常两种类型花粉粒的现象，称为花粉的二型性。

正常花粉的发育可划为单核小孢子早期、单核小孢子晚期、花粉第一次有丝分裂期、2细胞花粉早期和2细胞花粉晚期(成熟期)5个时期。

异常
花粉在单核小孢子晚期开始分化，其中大部分逐渐停止发育，少数(不超过100)可在体内启动雄核发育途径，朝着形成孢子体的方向发展，这类花粉比正常花粉粒小、细胞质染色浅、发育迟缓，具胚胎发生潜能，是在培养前由作用于活体的因素所预先决定的，离体花粉只是起孢子体发育的触发作用和维持相继生长的作用，称为P-花粉(Sunderland, 1978)，又称为S-花粉或E-花粉，或不染色花粉(NS-花粉)，也称为小花粉。

在正常条件下，也有少数活体小孢子由于所处的局部条件的变化(包括遗传方面的或生理上的变化)改变了它们的正常发育途径，形成不正常发育的花粉，如果在适当时期将这些小孢子进行培养，这些小孢子比其他正常发育小孢子更易于接受培养条件的影响，在离体条件下形成花粉胚。

不正常花粉并不是花粉胚的唯一或主要的来源，但是自然发生的不正常花粉与离体培养诱导的发育早期的花粉胚具有明显的相似性，在已得到大量花粉胚的茄科和禾本科植物中都发现有花粉二型性。

(二)逆境处理对雄核发育的诱导
处于诱导适宜期的小孢子在受到胁迫因素诱导时，正常的花粉发育途径即会改变而转向雄核发育途径。

大麦、油菜、小麦和烟草被认为是研究胁迫诱导雄核发育的模式植物。

从这些模式系统的研究中可以看出，改变小孢子发育命运的胁迫诱导因素常取决于物种和种内的基因型。

1．热激处理
热激处理在甘蓝型油菜中应用最普遍，32℃处理8h以上才能有效地诱导孤雄生殖，如果在32℃的条件下处理不到4h就转移到常温下培养，孤雄生殖的诱导过程会被中断。

32℃的温度处理对甘蓝型油菜是必需的，这个温度几乎接近花粉的致死温度(一般致死温度为35～37℃或37℃以上)(Smykal et al.，2000)。

有趣的是，供体植株生长的温度与花药培养时热激处理的温度至少应有5℃的差异，这个差异越大，热激处理的效果越明显。

对于十字花科植物，高温处理有效地提高了小孢子核对称分裂的频率，使部分小孢子在第一次核分裂过程中偏离原配子体的发育模式而向孢子体方向发育。

尽管已经发现逆境有促进孤雄生殖的效果，但对其机制了解甚少。

发现一种小热激蛋白(smHSP)在热激处理时转录增加，可能与热激诱导孤雄生殖有关。

2．物理或化学处理
γ射线对小孢子胚胎发生也具有刺激作用，尤其是与热激处理相结合时。

最有效的处理是在5 rad/min的低照射率，总剂量为500rad的情况下。

花药培养前用γ射线照射促进花粉愈伤组织形成和花粉胚胎发生在烟草、小麦、水稻和油菜中均有报道。

秋水仙素处理比γ射线处理的效果明显，但不如热激处理，在培养基中添加25～50umo1/L秋水仙素，对小孢子和花粉处理48h，可以收到很好的效果(Zaki et al.，1995)。

秋水仙素的作用被认为扰乱了对不对称分裂起决定作用的微管细胞骨架，使单核花粉的细胞核移向中央，导致均等分裂。

3．低温处理
低温是另一种促进小孢子胚胎发生的方法，对多数物种来讲，花药／花粉在低温(4～13℃)处理一段时间再转移到25℃培养能促进孤雄生殖。

最适低温处理时间的长短随温度、花粉发育时期和基因型而变化。

在水稻的花药培养中，通常需要将取回的幼穗在4℃或其他较低的温度下处理一段时间，再进入培养程序，能获得较理想的效果。

低温预处理的作用机理可能有以下几个方面：①低温处理可能引起花药、花粉内源激素、mRNA、糖类、蛋白质含量发生变化，从而阻断了花粉原来的发育方向，使其由配子体的发育途径转向孢子体的发育途径。

②提高小孢子的生活力，延缓退化速度，从而提高了诱导率。

③引起小孢子孤立化，即小孢子从花药中分离。

因为在低温处理过程中，花药内薄壁细胞和绒毡层逐渐退化，从而切断了母体组织与小孢子之间的联系。

无论哪种机理，结果是预处理能促进花粉启动，提高诱导率和再生。

④产生特定的蛋白质。

冷处理时，在玉米花药中产生并积累了一种分子质量为32kDa的MAR32蛋白。

冷处理7d后MAR32的积累量与随后的胚状体产量呈正相关。

4．营养饥饿处理
饥饿处理也是促进小孢子胚胎发生的一种方法，在25℃条件下对烟草小孢子饥饿处理，或有糖存在的情况下以33～37℃热激均能使小孢子实现胚胎发生，而且，将糖饥饿与热激处理结合起来具有一定加性效应(Touraev et al.,1996)。

最近在大麦的研究发现，肌醇、钙和脱落酸胁迫均有刺激小孢子胚胎发生的效果(Hoekstra etal.,1997)。

Aruga等(1985)将烟草花药放在无糖培养基上培养几
天抑制了小孢子的正常发育途径，启动了孤雄生殖途径。

糖饥饿处理后再转移到含糖培养基上使生殖细胞核合成DNA的能力丧失，而营养细胞核在糖饥饿的情况下却获得了合成DNA的能力。

Zarsky等(1990)推测，在完全培养基上培养之前对花粉进行饥饿处理，可能使雄配子体细胞质受抑制，启动营养细胞分化，使营养细胞脱离G1状态而进入细胞周期的S期，这一过程是小孢子向胚性发展所必需的。

5．重金属胁迫
重金属胁迫能够提高玉米花培效率。

将玉米花药接种在添加了0.25～1.0mmol/L的NiC12,CdC12,ZnCl2的诱导培养基中处理1～14d，然后转移到正常诱导培养基中，结果表明，对具有花药培养能力的基因型而言，三种重金属盐均能明显影响其培养效率，其中以0.5mmol/L处理1d效果最好，但对无花药培养能力的基因型无效(姜丽君等，1998)。

(三)雄核发育启动的分子机理
处于诱导条件下的小孢子在受到外界因素诱导时，正常的花粉发育途径即会改变而转向雄核发育途径。

在这个过程中，细胞内的基因表达和生理生化过程均发生了相应的变化。

关于雄核发育启动特异性或相关基因的研究已有一定进展，但目前分离得到的基因仍然只能说是花粉或胚特异性的基因，还难以断定与雄核发育启动有关。

甘蓝型油菜单倍体胚胎发生的前8h，有大约18种蛋白质以很高的频率合成(Cordewener et al.，1994)。

热激诱导早期热激蛋白Hsp70在甘蓝型油菜小孢子胚胎发生中有明显上升表达，Hsp70在胚性小孢子中明显高于正常小孢子。

蛋白质的修饰(如磷酸化和甲基化)可能比基因产物的存在与否更重要。

很多基因仅仅在花粉第一次有丝分裂后表现出很高的转录活性(Bedinger,1992)，甘蓝型油菜孤雄生殖能力的缺失与所谓“晚期基因”的表达相吻合。

“晚期基因”在花粉第一次有丝分裂后活跃转录，是花粉萌发和受精过程所必需的。

有些花粉特异性基因的下降调控与孤雄生殖的诱导有关，因此，封阻花粉特异基因的转录对烟草孤雄生殖的启动有帮助(Harada et al.，1986)。

用差异显示技术对胁迫处理诱导雄核发育的小孢子进行分析，发现了一批与雄核发育潜能获得有关的基因，同时也发现了一些与诱导胚胎发生有关的调节基因(如BBM, LEC, PKL等)，但这些发现比较零散，其间的信号转导途径尚不清楚。

但是人们已十分肯定，单
倍体的诱导受基因控制，并且可以杂交转育。

同一种基因型个体间的花药培养特性也存在差异，通过选择可提高花药培养的反应能力。