动物细胞的大规模离体培养技术

无血清培养基
血清的成分非常复杂， 血清的成分非常复杂，对一些要求较高的基础性研究的结果影 响较大； 响较大； 血清中也含有一定的毒性物质和抑制物质，对细胞有去分化作 血清中也含有一定的毒性物质和抑制物质， 用，影响某些细胞功能的表达； 影响某些细胞功能的表达； 无血清培养基一般由基础培养基和替代血清的补充因子组成。 无血清培养基一般由基础培养基和替代血清的补充因子组成。
Vero细胞和狂犬病毒的培养工艺 细胞和狂犬病毒的培养工艺
加碱（ 加碱（碳酸 氢钠） 氢钠） 加糖（ 加糖（葡萄 糖） 50L 胎牛血清 其他成分 灌注培养液 生 物 微载体 反 应 锥形瓶逐级 放大培养 5L种子罐培 种子罐培 养 培养液 器 收获病毒 出液口 接种狂犬 病毒 DMEM培养基 培养基
调节培养液pH的方法： 调节培养液 的方法： 的方法
oA、添加 缓冲剂及通入含CO2的空气进行调节； 的空气进行调节； 、添加NaHCO3缓冲剂及通入含 oB、用0.1mol/L NaOH或0.1mol/L HCl进行调节。 进行调节。 、 或 进行调节
利用酸碱直接调节会发生局部过酸或过碱的现象， 利用酸碱直接调节会发生局部过酸或过碱的现象，从而对 细胞产生毒害作用。 细胞产生毒害作用。
100－2000nm － 10－100um － 细胞壁 大小 微生物与 动物细胞 差异
109－1010/ml 106/ml 生长浓度 0.1-0.5h-1 0.01-0.05h-1
需氧量
生长 速率 营养要求
环境影响 CO2需求 需求
疫苗生产上的应用
已实现商业化生产的产品有口蹄疫苗、狂犬病毒疫苗、 已实现商业化生产的产品有口蹄疫苗、狂犬病毒疫苗、 骨髓灰质炎病毒疫苗、 骨髓灰质炎病毒疫苗、牛白血病疫苗
天然 培养基
培养基， 培养基，它主要取自动物体液或从动物组织分离 提取而得； 提取而得；
类
型
①血清 优质的血清外观应为透明、无溶血、淡黄色、无沉淀物。 优质的血清外观应为透明、无溶血、淡黄色、无沉淀物。 ②血浆 容易发生液化，目前已很少单独使用，一般是禽类血浆。 容易发生液化，目前已很少单独使用，一般是禽类血浆。 ③组织浸出液 常用的是胚胎浸出液（如鸡胚浸出液），有促进细胞生长的作用。 常用的是胚胎浸出液（如鸡胚浸出液），有促进细胞生长的作用。 ），有促进细胞生长的作用 ④水解乳蛋白 由乳白蛋白经水解而制得，氨基酸的含量较高。 由乳白蛋白经水解而制得，氨基酸的含量较高。
人工条件下，动物细胞在反应器中进行大量地、 人工条件下，动物细胞在反应器中进行大量地、 高密度培养，以生产珍贵生物制品的技术。 高密度培养，以生产珍贵生物制品的技术。
1907 Harrison创立了体外组织培养技术； 创立了体外组织培养技术； 创立了体外组织培养技术 1951 Earle开发动物细胞体外培养合成培养基； 开发动物细胞体外培养合成培养基； 开发动物细胞体外培养合成培养基 1957 Graff应用灌注技术，培养密度达1010个/L； 应用灌注技术，培养密度达 应用灌注技术 ； 1962 Capstick成功实现小鼠肾细胞的大规模培养， 成功实现小鼠肾细胞的大规模培养， 成功实现小鼠肾细胞的大规模培养 标志着动物细胞大规模培养技术的开始； 标志着动物细胞大规模培养技术的开始； 1967 Van Wezel成功地以 成功地以DEAE-Sephadex A50为载 成功地以 为 体，实现动物细胞的载体培养； 实现动物细胞的载体培养；
动 物 细 胞 的 大 规 模 离 体 培 养 技 术
引
言
动物细胞培养方法、 动物细Fra Baidu bibliotek培养方法、工艺及控制
动物细胞大规模培养反应器及改进
动物细胞的高密度培养
引言
基本概念 发展简史 微生物与动物细胞的差异 动物细胞大规模培养的应用
引言
动物细胞大规模培养技术 （large-scale culture technology） ） pH 温度 溶氧 发酵工 艺等条 件
④无机离子
⑤其他成分
细胞的重要组成部分之 一，参与细胞的代谢活 动。培养基中无机离子 除K＋、Na＋等外，还 等外， ＋ 含有Fe 含有 2+、Zn2＋、Cu2 ＋等微量离子。 等微量离子。
代谢的中间产物 氧化还原剂 三磷酸腺苷 辅酶A等成分。 辅酶 等成分。 等成分
常用的合成培养基
较为常用的有199培养液、Eagle（MEM、DMEM）、 培养液、 ）、RPM1640 、 较为常用的有 培养液 （ 、 ）、 HAM培养液等。 培养液等。 培养液等 随着细胞培养技术的发展和应用范围的扩大， 随着细胞培养技术的发展和应用范围的扩大，对各种培养的要求 也越来越严格， 也越来越严格，多数人工合成的培养基都要加入不同浓度的血清才 能培养细胞。 能培养细胞。
动物细胞培养方法 工艺及其控制
环境系统
培养系统
反应器 提取系统
动物细胞 培养条件
1、动物细胞 、 培养的环境
①温度
细胞体外生存的基本条件之一； 细胞体外生存的基本条件之一；
不同源细胞，最适生长温度不尽相同，昆虫细胞 ℃ ℃ 不同源细胞，最适生长温度不尽相同，昆虫细胞25℃-28℃， 哺乳动物细胞37℃ 哺乳动物细胞 ℃； 低温耐受力强于高温； 低温耐受力强于高温； 动物细胞培养的温度允许波动的范围在± 动物细胞培养的温度允许波动的范围在±0.25℃。 ℃
2、营养成分 、
细胞的生长、 细胞的生长、繁殖以及产物的合成都必须从环境中摄取各 种营养物质以合成细胞物质及在新陈代谢中起调节作用。 种营养物质以合成细胞物质及在新陈代谢中起调节作用。 这些营养物质包括碳源、氮源、氨基酸、无机盐、 这些营养物质包括碳源、氮源、氨基酸、无机盐、微量元 素、生长因子，等。 生长因子，
其他基因重组产品生产上的应用
细胞能精确地转录、翻译和加工较大或更复杂的克隆蛋白质； 细胞能精确地转录、翻译和加工较大或更复杂的克隆蛋白质； 可以简化蛋白质的分离提纯； 可以简化蛋白质的分离提纯； 美国Endotronic公司用中空纤维生物反应器大规模培养动物细 公司用中空纤维生物反应器大规模培养动物细 美国 胞生产出免疫球蛋白G、 和 ，尿激酶，人生长激素等。 胞生产出免疫球蛋白 、A和M，尿激酶，人生长激素等。
②pH
合适的pH是细胞生存的必要条件之一。 合适的 是细胞生存的必要条件之一。 是细胞生存的必要条件之一 开始培养时培养液的理想pH为 ，随着培养的进行， 会因细 开始培养时培养液的理想 为7.4，随着培养的进行，pH会因细 胞代谢所释放的CO2而下降，但必须控制在 以上。 而下降， 以上。 胞代谢所释放的 而下降 但必须控制在7.0以上 大规模培养时，影响培养液的 稳定性的主要因素有三种 稳定性的主要因素有三种： 大规模培养时，影响培养液的pH稳定性的主要因素有三种：缓 冲液的缓冲能力及种类；对流空间大小；葡萄糖浓度。 冲液的缓冲能力及种类；对流空间大小；葡萄糖浓度。 磷酸对动物细胞有毒害作用，常用的缓冲系统是 磷酸对动物细胞有毒害作用，常用的缓冲系统是NaHCO3/CO2。
动物 细胞 培养 技术 应用
干扰素生产上的应用
年发现干扰素以来， 自1957年发现干扰素以来，经历了自然干扰素、基因重 年发现干扰素以来 经历了自然干扰素、 组干扰素和蛋白质工程干扰素等3个发展阶段 个发展阶段。 组干扰素和蛋白质工程干扰素等 个发展阶段。 英国Wellcome公司为了满足临床实验的需要，采用 公司为了满足临床实验的需要， 英国 公司为了满足临床实验的需要 8000L Namalwa细胞生产 干扰素。 细胞生产α干扰素 细胞生产 干扰素。
3、溶解氧 、
氧气是细胞代谢所必需的。 氧气是细胞代谢所必需的。 一般在培养初期要求较低的溶氧水平， 一般在培养初期要求较低的溶氧水平，而在对数生长期或 培养后期，当细胞增多时溶氧的水平代谢将受到阻碍； 培养后期，当细胞增多时溶氧的水平代谢将受到阻碍； 而溶氧浓度过高又对细胞产生毒害作用， 而溶氧浓度过高又对细胞产生毒害作用，使细胞的代谢受 到抑制。 到抑制。
优点是营养成分丰富、培养效果良好； 优点是营养成分丰富、培养效果良好；
缺点是成分复杂、个体差异大、来源有限。 缺点是成分复杂、个体差异大、来源有限。
根据天然培养基的成分， 根据天然培养基的成分，用化学物质对细胞体生存环 境中各种已知物质在体外人工条件的模拟， 境中各种已知物质在体外人工条件的模拟，经过反复实 验筛选、强化和重新组合后形成的培养基。 验筛选、强化和重新组合后形成的培养基。
1975 Kohler和Milstein成功建立单克隆抗体技术； 和 成功建立单克隆抗体技术 成功建立单克隆抗体技术； 1975 Sato用激素代替血清使垂体细胞株在无血清介 用激素代替血清使垂体细胞株在无血清介 质中生长成功，预示无血清培养的诱人前景； 质中生长成功，预示无血清培养的诱人前景； 无血清培养的诱人前景 1986 Deme Biotech公司首次成功地用微囊化技术大 Biotech公司首次成功地用微囊化技术大 公司首次成功地用微囊化技术 规模培养杂交瘤细胞来生产单克隆抗体； 规模培养杂交瘤细胞来生产单克隆抗体； 1989 Konstantinovti首次提出大规模细胞培养过程中 首次提出大规模细胞培养过程中 的生理状态控制技术，更新培养工艺的优化控制理论 优化控制理论。 的生理状态控制技术，更新培养工艺的优化控制理论。
单克隆抗体生产上的应用
应用动植物细胞生产单克隆抗体是一条经济、可靠的途径。 应用动植物细胞生产单克隆抗体是一条经济、可靠的途径。 英国Celltech公司采用无血清培养液在 公司采用无血清培养液在10000L气升式生物反应 英国 公司采用无血清培养液在 气升式生物反应 器中培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体； 器中培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体； 国内也已成功地应用中空纤维培养系统和微载体培养动物细 国内也已成功地应用中空纤维培养系统和微载体培养动物细 胞生产单克隆抗体作为血型定型试剂。 胞生产单克隆抗体作为血型定型试剂。
主要营养成份
①氨基酸 合成培养基的主要成分，以必需氨基酸为主， 合成培养基的主要成分，以必需氨基酸为主，一般细胞仅能利用氨 基酸的L－型同分异构体。 基酸的 －型同分异构体。几乎所有的细胞对谷氨酰胺都有较高的 要求，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质。 要求，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质。 ②维生素 维持细胞生长的一种生物活性物质， 维持细胞生长的一种生物活性物质，它们在细胞中大多形成酶的辅 基或辅酶，对细胞的代谢有重大的影响。 基或辅酶，对细胞的代谢有重大的影响。 ③糖类 主要是葡萄糖，通过糖酵解形成丙酮酸， 主要是葡萄糖，通过糖酵解形成丙酮酸，并可转化乳酸或乙酰乙酸 进入柠檬酸循环形成CO2。对胚胎细胞和转化细胞，乳酪在培养基 进入柠檬酸循环形成 。对胚胎细胞和转化细胞， 中的积累特别明显。 中的积累特别明显。
流加式
分批式 动物细胞 发酵工艺
半连续式
灌注式
连续式
细胞接种后进行培养，一方面新鲜培养基不断地加入反应器内， 细胞接种后进行培养，一方面新鲜培养基不断地加入反应器内，另 一方面又将培养液连续不断地取出，但细胞留在反应器内， 一方面又将培养液连续不断地取出，但细胞留在反应器内，使细胞 处于不断的营养状态中。 处于不断的营养状态中。
合成 培养基
既能提供一个近拟于体内的生存环境， 既能提供一个近拟于体内的生存环境，又便于控制 和提供标准化体外生存环境。 和提供标准化体外生存环境。
合成培养基种类很多，但一般都含有氨基酸、 合成培养基种类很多，但一般都含有氨基酸、维生 素、糖类、无机离子和一些辅助性成分。 糖类、无机离子和一些辅助性成分。
影响溶解氧的因素： 影响溶解氧的因素：
①通风与搅拌 ②罐压 ③培养液的理化性质 ④反应器的结构及空气分布器 ⑤传递推动力
4、渗透压等其他因素 、
渗透压、血清、剪切力等动物细胞有很大的影响。 渗透压、血清、剪切力等动物细胞有很大的影响。
天然培养基
动物细胞 大规模 培养用 培养基
合成培养基
天然培养基是使用最早、 天然培养基是使用最早、最为有效的动物细胞