层析柱装填及柱效测定及凝胶过滤层析基础知识【参考借鉴】
（完整word版）层析柱使用方法
（完整word版）层析柱使用方法层析柱使用方法层析柱使用方法柱层析和TLC是有机化学工作者必须下苦功夫的两项实验技术。
这两项技术掌握与否，对于提高实验的效率至关重要。
常见的例子是：在柱层析时，由于层析柱中的硅胶填料装得不均匀（没有填严实），使得柱子在淋洗过程中就因为出现太多气泡变花，导致分离效果不好。
更常见的例子是：层析柱虽然装得不错，但是由于淋洗剂选择不恰当，结果导致几十毫克产品，用了几百毫升淋洗剂都还没有完全分离。
分离同样的东西，熟手可能只需要半个小时，而一个层析技术不过关的人可能半天都不能得到纯品。
由此可见，这两项技术掌握与否，对于提高工作效率，减轻工作量，减少有机溶剂的使用，从而对身心健康和环境保护都有明显的作用。
柱层析关键在于柱子是否装好和淋洗剂是否选择恰当。
而淋洗剂的选择则是通过TLC 确定。
这里要指出的一点是：TLC的作用除了跟踪反应进程，检测试剂和原料纯度外，一个重要的用途就是为柱层析选择适当的淋洗剂。
首先谈柱层析：1：装柱子（添硅胶）时，有两种方法：即湿法装柱和干法装柱，二者各有优劣。
不论干法还是湿法，硅胶（固定相）的上表面一定要平整，并且硅胶（固定相）的高度一般为15cm左右，太短了可能分离效果不好，太长了也会由于扩散或拖尾导致分离效果不好。
湿法装柱：是先把硅胶用适当的溶剂拌匀后，再填入柱子中，然后再加压用淋洗剂“走柱子”，本法最大的优点是一般柱子装的比较结实，没有气泡。
干法装柱：则是直接往柱子里填入硅胶，然后再轻轻敲打柱子两侧，至硅胶界面不再下降为止，然后再填入硅胶至合适高度，最后再用油泵直接抽，这样就会使得柱子装的很结实。
接着是用淋洗剂“走柱子”，一般淋洗剂是采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。
通常上面加压，下面再用油泵抽，这样可以加快速度。
干法装柱较方便，但最大的缺陷在于“走柱子”时，由于溶剂和硅胶之间的吸附放热（可以用手摸柱子明显感觉到），容易产生气泡，这一点在使用低沸点的淋洗剂时如乙醚，二氯甲烷更为明显。
凝胶层析技术(凝胶过滤)
四、凝胶层析的特点
1、凝胶是一种不带电荷的惰性物质，本身不 会与被分离物质相互作用，分离效果好，重 复性高。 2、设备简单，操作简便。
五、影响凝胶层析的因素
（一）凝胶的选择： （二）凝胶粒度对分离效果的影响 40-60目为粗粒。 100-200目为细粒（应用较多）能使洗脱曲线的峰区变得对 称和狭窄。 250-400目为最细粒。 （三）洗脱流速对分离效果的影响： 一般采用流速在30-200ml/小时，过快会使色层谱变形。 （四）离子强度和附值 （五）样品液体积对分离效果的影响 通常样品液体积约为凝胶床总体积的5-10%。 （六）凝胶柱的长度，直径和分离效果的关系 （七）Vo和Vi
其结构如图：
由右旋葡萄糖单位通过1.6-糖苷键连结成链状结构，再由 3-氯-1,2-环氧丙烷（Cl-CH2-CH-CH2）作交联剂而形成 的多孔网状结构的高分子 、 （1）凝胶在使用前必须在过量的溶剂中充分地 膨胀，否则影响层析的均一性，甚至使柱破裂， 自然溶解需24小时以上，加热至沸需2小时即可。 （2）用倾斜法除去混杂的小颗粒，重复2-3次。 2、凝胶的装填 、 装柱是凝胶层析中最重要的一步操作。 a.将柱垂直安装好 b.在柱内先装入1/5的水，用玻棒搅拌凝胶沿玻 棒倒下待凝胶开始沉降时，打开出口。凝胶床 必须装得均匀，尽量一次装完，以免出现不均 匀的凝胶带，因此，在装柱时需打开下口，并 调节适当的流速。 c.连接恒压洗脱瓶，平衡流速，开始流速不能 太大，应低于层析时所需的流速。 d.经平衡后的凝胶床顶部留下1ml左右的液体。 关闭出口管上的螺旋夹。
小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外还可进入凝胶颗粒的微孔之中因此在向下移动的过程中它们先从凝胶内扩散至颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒这样不断进入和扩散必然使小分子物质的下移速度落后于大分子物质从而使样品中分子大小不同的物质流出柱外而得到分离
凝胶柱层析操作要点
凝胶柱层析操作要点(一) 基本原理凝胶是一种不带电荷的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，象筛子，直径大于孔径的分子将不能迸入凝胶内部，便直接沿凝胶颗粒的间隙流出，称为全排出。
较小的分子在容纳它的空隙内，自由出入，造成在柱内保留时间长。
这样，较大的分子先被洗脱下来，而较小的分子后被洗脱下来，从而达到相互分离的目的。
洗脱时峰的位置和该物质相对分子质量有直接的定量关系。
在一根凝胶柱中，颗粒间自由空间所含溶液的体积为外水体积V。
不能进入凝胶孔径的那些大分子，当洗脱体积为V。
时，出现洗脱峰。
凝胶颗粒内部孔穴的总体积称为内水体积Vi ，能全部渗入凝胶的那些小分子，当洗脱体积为V。
+ Vi 时出现洗脱峰。
(二)凝胶的类型及性质1.交联葡聚糖凝胶交联葡聚糖凝胶的商品名称为Sephadex，由葡聚糖和3-氯-1.2-环氧丙烷(交联剂)以醚键相互交联而形成具有三维空间多孔网状结构的高分子化合物。
交联葡聚糖凝胶，按其交联度大小分成8种型号(表6–2)。
交联度越大，网状结构越紧密，孔径越小，吸水膨胀就愈小，故只能分离相对分子质量较小的物质;而交联度越小，孔径就越大，吸水膨胀大，则可分离相对分子质量较大的物质。
各种型号是以其吸水量(每g干胶所吸收的水的质量)的10倍命名，如，Sephadex G–25表示该凝胶的吸水量为每g干胶能吸2.5克水。
在SephadexG–25及G–50中分别引入羟丙基基团，即可构成LH型烷基化葡聚糖凝胶。
交联葡聚糖凝胶在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液和有机溶剂中较稳定，但当暴露于强酸或氧化剂溶液中，则易使糖甘键水解断裂。
在中性条件下，交联葡聚糖凝胶悬浮液能耐高温，用120?消毒10分钟而不改变其性质。
如要在室温下长期保存，应加入适量防腐剂，如氯仿、叠氮钠等，以免微生物生长。
交联葡聚糖凝胶由于有羧基基团，故能与分离物质中的电荷基团(如碱性蛋白质)发生吸附作用，但可借助提高洗脱液的离子强度得以克服。
凝胶层析——精选推荐
凝胶层析简介凝胶层析（gel chromatography）又称为凝胶排阻层析（gel exclusion chromatography）、分子筛层析（molecular sieve chromatography）、凝胶过滤（gel filtration）、凝胶渗透层析（gel permeation chromatography）等。
它是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小顺序分离样品中各个组分的液相色谱方法。
1959年，Porath 和Flodin首次用一种多孔聚合物－交联葡聚糖凝胶作为柱填料，分离水溶液中不同分子量的样品，称为凝胶过滤。
1964年，Moore制备了具有不同孔径的交联聚苯乙烯凝胶，能够进行有机溶剂中的分离，称为凝胶渗透层析（流动相为有机溶剂的凝胶层析一般称为凝胶渗透层析）。
随后这一技术得到不断的完善和发展，目前广泛的应用于生物化学、高分子化学等很多领域。
凝胶层析是生物化学中一种常用的分离手段，它具有设备简单、操作方便、样品回收率高、实验重复性好、特别是不改变样品生物学活性等优点，因此广泛用于蛋白质（包括酶）、核酸、多糖等生物分子的分离纯化，同时还应用于蛋白质分子量的测定、脱盐、样品浓缩等。
凝胶层析的基本原理凝胶层析是依据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。
层析过程如图11 所示。
凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。
当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。
比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，它们经历的流程短，流动速度快，所以首先流出；而较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出；而分子大小介于二者之间的分子在流动中部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，分子越大的组分越先流出，分子越小的组分越后流出。
凝胶过滤层析讲解
第二节 凝胶介质的分类和性质
1） 葡聚糖凝胶 ① G类葡聚糖（Sephadex） ② LH-亲脂型葡聚糖 ③ Sephacryl 2）琼脂糖凝胶 3）聚丙烯酰胺凝胶
（1）葡聚糖凝胶
① G类葡聚糖（Sephadex）
由葡聚糖（右旋糖酐）和交联剂以醚键交联而成 理化性质 1）型号不同，交联度不同，膨胀度和吸水量不同，筛孔大 小和分级范围也不同； 2）商业用的型号又G10、G15、G25，G100等，数字代 表每g干凝胶吸水量×10，如G50即表示每克干凝胶的吸水 量为5.0毫升； 3）数字越小，分级范围窄，适合低分子量的蛋白质的分离， 数字越大，适合宽范围分子量的分级
几种凝胶的比较
种类（商品名） 商品型号 葡聚糖凝胶 （Sephadex） 琼脂糖凝胶 （Sepharose） G15， G25， G100… 2B, 4B, 6B… 型号中数字意义 每g的吸水量(ml)×10 数字越大，筛孔越大 颗粒中琼脂糖的含量 （％）； 数字越大，筛孔越小 排阻限度 6×105 稳定性 水、盐、碱、弱酸 中稳定；对强酸敏感
（2） 琼脂糖凝胶
商品名 Sepharose（瑞典）
1）2B,4B等型号，数字代表颗粒中琼脂糖的百 分含量，数字越大，分离的范围越小 2）与1，3－二溴异丙醇反应生成交联琼脂糖， 稳定性提高；
Bio－gel A(美国）
一般有A0.5, A1.5等型号，数字×106代表分 离的分子量极限； 与葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶相比，琼脂糖凝 胶机械强度和筛孔稳定性好，洗脱速度可以快些
琼脂糖凝胶的优点和缺点
优点 琼脂糖凝胶（agarose gel）比葡聚糖凝 胶和生物胶的排阻范围大，可达相对分子质量 108，使凝胶层析的分离区间扩大到大分子和 病毒颗粒；机械性能好。 缺点 稳定性较葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶稳定性 差，不耐酸碱，最好将条件控制在pH 4～9 之间，温度0～40℃，超出此范围,可能被破 坏。
层析柱 填料
层析柱填料
【实用版】
目录
1.层析柱填料的概念和分类
2.层析柱填料的性能要求
3.层析柱填料的选择方法
4.层析柱填料的应用领域
正文
层析柱填料是指在层析柱中使用的填充物，主要用于样品的分离和纯化。
层析柱填料可以根据其性质和用途进行分类，常见的分类包括无机填料和有机填料、吸附剂和凝胶渗透剂等。
层析柱填料在使用过程中需要满足一定的性能要求，例如填料的粒径分布要均匀，表面要光滑，吸附能力要适中，以保证样品在层析柱中的分离效果。
此外，填料还需要具有良好的热稳定性和化学稳定性，以保证其在高温和高压下不失活。
选择层析柱填料时，需要根据样品的特性和分离要求进行选择。
一般来说，无机填料适用于吸附能力强的样品，而有机填料适用于吸附能力弱的样品。
吸附剂适用于对样品进行吸附分离，而凝胶渗透剂适用于对样品进行分子筛分离。
层析柱填料的应用领域广泛，不仅用于化学实验室的分析和研究，还用于工业生产中的样品分离和纯化，例如制药、食品加工、环境监测等领域。
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生物制药工艺学第7章凝胶层析
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葡聚糖凝胶性能与编号的关系
编号
交联 吸液量 膨胀 凝胶 分离限 凝胶
度
速度 孔径
强度
大
小
（ Sephadex G－150 ）
小
大
（ Sephadex G－ 50 ）
大慢 小快
大
大
小
小
小
大
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葡聚糖凝胶（G类）的规格
❖
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24
思考题
❖ 用葡聚糖凝胶分 离蛋白质与多糖 时，其分离范围 不同，为什么？
；
（1）相对粘度为0.118；
（2）相对粘度为0.042； （3）相对粘度为0.010
❖ 粗粒凝胶柱流速高，洗 脱峰平坦，分辨率低， 用于粗制分离，脱盐。
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（三）凝胶的预处理
❖ 使用前须溶涨，使干胶颗粒充分吸收溶剂， 并达到平衡。
❖ 干胶以10倍以上吸液量的溶剂浸泡。 ❖ 热法溶涨(水浴)。
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二、凝胶层析柱的设计和制备
❖ （一）层析柱的选择 ❖ 层析柱长度与直径的比值称作“柱
❖ 物质B分子量介于渗入限与排阻限之
间。 “部分排阻”或“部分渗入”。
流 经 体 积 Ve 是 全 部 外 水 体 积 加 上 内
水体积的一部分，即Ve=V0+KdVi
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11
三、分配系数Kd
❖ 排阻系数：
❖
❖ 当Kd=1时，洗脱体积Ve=V0+Vi，为全渗入。 ❖ 当Kd=0时，洗脱体积Ve=V0，为全排阻。 ❖ 0＜Kd＜1时，洗脱体积Ve=Vo+KdVi，为部分渗
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层析柱装柱流程
层析柱装柱流程层析柱是一种用于分离、纯化化合物的重要工具，它具有操作简单、分离效果好、适用范围广等优点，因此在化学、生物等领域得到了广泛的应用。
在进行层析柱操作时，正确的装柱流程是非常重要的，它直接影响到实验结果的准确性和重现性。
下面将介绍层析柱的装柱流程。
首先，准备好所需的层析柱和填料。
层析柱通常由玻璃或塑料制成，填料的选择根据需要分离的化合物而定，可以是硅胶、纸浆、聚合物凝胶等。
填料的粒径和填充量也需要根据具体实验要求进行调整。
接着，将层析柱放置在支架上，并用适当的溶剂进行预洗。
预洗的目的是去除填料中的杂质和空隙中的气体，为样品的装柱做好准备。
预洗的溶剂通常是与样品相似的极性溶剂，如甲醇、乙醇等。
然后，将填料均匀地装入层析柱中。
填料的均匀性对于分离效果至关重要，因此在装填填料时需要轻轻振动层析柱，使填料能够均匀分布，并避免出现空隙或局部堆积的情况。
接下来，将样品溶液缓慢地加入层析柱中。
在加样的过程中，需要注意控制流速，避免填料被冲洗出来或样品在填料中发生混合。
通常情况下，可以使用移液枪或注射器来进行加样，以确保流速的均匀和稳定。
装柱完成后，可以开始进行层析操作。
根据需要，可以选择使用不同的洗脱溶剂来进行洗脱，以实现对样品的分离和纯化。
在洗脱的过程中，需要注意收集不同洗脱峰的组分，并记录下各个组分的出现时间和洗脱溶剂的类型，以便后续的分析和鉴定。
最后，对层析柱进行清洗和保存。
清洗时，可以用适当的溶剂将填料中残留的样品和杂质洗净，然后用干燥剂将层析柱中的水分去除干净。
清洗完成后，将层析柱放置在干燥通风的地方保存，避免受潮和受到污染。
总之，层析柱的装柱流程是一个关键的操作步骤，它直接影响到后续层析操作的效果和实验结果的准确性。
正确的装柱流程应该包括层析柱的预洗、填料的均匀装填、样品的缓慢加样、洗脱组分的收集和记录、以及层析柱的清洗和保存等步骤。
只有严格按照流程进行操作，才能保证层析柱操作的顺利进行和实验结果的准确可靠。
凝胶柱层析
凝胶过滤层析凝胶过滤层析(gel filtration chromatography)法又称排阻层析或分子筛方法，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。
层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖（如葡聚糖或琼脂糖）类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。
也叫做分子排阻层析（molecular-exclusion chromatography）。
一种利用带孔凝胶珠作基质，按照分子大小分离蛋白质或其它分子混合物的层析技术。
一般是大分子先流出来，小分子后流出来。
基本原理凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。
是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。
层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，小分子物质能进入其内部，流下时路程较长，而大分子物质却被排除在外部，下来的路程短，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。
优点它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。
对于高分子物质有很好的分离效果。
使用方法⒈凝胶的选择根据实验目的不同选择不同型号的凝胶。
如果实验目的是将样品中的大分子物质和小分子物质分开，由于它们在分配系数上有显著差异，这种分离又称组别分离，一般可选用SephadexG-25和G-50，对于小肽和低分子量的物质（1000-5000）的脱盐可使用SephadexG-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4.如果实验目的是将样品中一些分子量比较近似的物质进行分离，这种分离又叫分级分离。
一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶，层析过程中这些物质都能不同程度地深入到凝胶内部，由于Kd不同，最后得到分离。
⒉柱的直径与长度根据经验，组别分离时，大多采用2-30cm长的层析柱，分级分离时，一般需要100cm左右长的层析柱，其直径在1-5cm范围内，小于1cm产生管壁效应，大于5cm则稀释现象严重。
层析柱知识
柱层析利用层析柱将混合物各组分分离开来的操作过程称为柱层析。
柱层析是层析技术中的一类，依据其作用原理又可分为吸附柱层析、分配柱层和离子交换柱层析等。
其中以吸附柱层析应用最广。
以下只介绍吸附柱层析的相关问题，其操作方法也可作为其他类型柱层析的参考。
1.吸附柱层析的器材(1)层析柱实验室中所用的玻璃层析柱有两种形式：一是下部带有活塞的玻璃管，活塞的芯最好是聚四氟乙烯制作的，这样可以不涂真空油脂，以免污染产品。
如果使用普通的玻璃活塞，则真空油脂要小心地涂薄涂匀。
另一种是将玻璃管下端拉细，套上一段弹性良好的管子。
这段管子必须是不能被淋洗剂溶解的，普通橡皮管一般不可充作此用，因为橡皮易被氯仿、苯、THF 等溶剂溶胀，而聚乙烯管子对大多数溶剂是惰性的，所以常常使用。
用一只螺旋夹控制流速，此外，薄膜塑料柱因使用方便、节省淋洗剂、减少蒸发量等优点，应用日趋广泛。
薄膜塑料柱总是以扁平成卷保存的，两侧常有很深的折痕。
使用前需将裁取的一段薄膜管一端扎紧，另一端套在一段玻璃管上并用棉线扎紧。
将这段玻璃管穿过一个单孔塞。
然后将薄膜管放进一根又粗又长，下端拉细了的玻璃管内，使塞子塞紧大玻璃管的口。
用水泵自大玻璃管下端抽气，薄膜柱即因内部压强大于外部而自行展圆。
待装入吸附剂后在其下部扎几个小孔即可使用。
层析柱的尺寸根据被分离物的量来确定，其直径与高度之比则根据被分离混合物的分离难易而定，一般在1∶8到1∶50之间。
柱身细长，分离效果好，但可分离的量小，且分离所需时间长；柱身短粗，分离效果较差，但一次可以分离较多的样品，且所需时间短。
如果待分离物各组分较难分离，宜选用细长的柱子，如果要处理大量的较易分离的或对分离纯度要求较低的混合物，则可选用粗而短的柱子。
最常使用的层析柱，直径与长度之比在1∶8 到1∶15 之间。
(2)吸附剂柱层析中最常使用的吸附剂是氧化铝或硅胶。
其用量为被分离样品的30～50倍，对于难以分离的混合物，吸附剂的用量可达100倍或更高。
层析柱使用方法
层析柱使用方法
哇塞，层析柱可是个很重要的实验工具呢！它在很多领域都有着广泛的应用。
那咱就来好好说说层析柱的使用方法哈。
首先得准备好层析柱，检查是否完好无损。
然后就是装柱啦，这可是关键步骤哦！要将填料慢慢倒入柱中，同时用适当的溶剂冲洗，注意不能有气泡产生呀，这就好比盖房子得根基牢固一样重要呢！接着就是上样啦，把样品小心地加到柱子上，可别弄撒了哦。
再进行洗脱，控制好洗脱液的流速，就像把握好节奏一样重要呢。
在整个过程中，要注意保持操作环境的清洁，不然杂质混入可就麻烦啦！还有呀，使用的溶剂要合适，不然也达不到好的效果呀。
在使用层析柱的过程中，安全性和稳定性那也是相当重要的呀！就像走钢丝一样，稍有不慎可能就前功尽弃啦。
要确保实验装置的稳固，避免倒塌啥的危险情况发生。
同时呢，操作过程要规范，可不能马虎大意，这是对自己和实验结果负责呀！只有这样，才能保证实验的顺利进行，得到可靠的结果呢。
层析柱的应用场景那可多了去了呀！在生物化学、制药、食品等领域都能看到它的身影呢。
它的优势也很明显呀，比如能高效分离混合物，让我们更清楚地看到各种成分呢。
这就好像是在一堆混乱中找出秩序一样神奇呀！而且它还可以重复使用，多经济实惠呀！
给你们讲个实际案例哈。
有一次在一个生物实验中，我们就是用层析柱来分离蛋白质的。
哇，效果那叫一个好呀！很清晰地就把不同的蛋白质分离开了，为后续的研究提供了重要的数据支持呢。
这就充分说明了层析柱在实际应用中的强大呀！
总之呢，层析柱真的是个超棒的实验工具呀，只要我们正确使用它，就能发挥出它巨大的作用呀！。
第五章-凝胶过滤层析
复习
根据凝胶床的组成，总柱床体积等于外水体积、内水体积 与凝胶体积之和：
Vt=V0+Vi+Vg
凝胶柱体积参数示意图
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复习
凝胶过滤洗脱曲线示意图 （组分A为全排阻分子，组分B为部分渗透分子，组分C为全渗透分子）
洗脱体积Ve定义为自样品加至层析柱上部开始，至洗脱组分达到最 大浓度（对映洗脱峰峰顶）时流经层析柱的洗脱液的体积.
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第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
一、凝胶过滤的概念
不同的溶质因不同程度进入介质而在液相中停留的时间不同, 凝胶的孔径和溶质分子大小的关系决定了层析时该溶质在层 析柱中的保留时间，不同的物质因保留时间不同而分离.
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第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
凝胶色谱分离原理
5பைடு நூலகம்
第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
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第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
凝胶过滤洗脱曲线示意图 （组分A为全排阻分子，组分B为部分渗透分子，组分C为全渗透分子）
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第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
所示层析图谱中，样品由三种组分组成。 组分A为全排阻分子，分子量大于凝胶分级范围上限，不能进入 凝胶网孔，经凝胶颗粒间隙被洗脱，该组分的洗脱体积Ve等于外 水体积V0（Ve=V0）。 组分C为全渗透分子，分子量小于凝胶分级范围下限，完全渗透 进入凝胶网孔内，在正常洗脱条件下，与凝胶间不存在吸附作用 时，此类组分的洗脱体积是最大的，等于外水体积V0与内水体积 Vi之和（Ve=V0+Vi）。 组分B为部分渗透分子，分子量处于凝胶分级范围内，是此类凝 胶能有效分离的物质。根据组分B的分子量，该组分能以一定程 度进入凝胶网孔之中，其洗脱体积Ve处于组分A与组分C之间 （V0<Ve<V0+Vi）。
凝胶过滤层析的基本操作
凝胶过滤层析的基本操作①凝胶介质的选择根据待分离蛋白质的分子量选择具有相应分离范围的凝胶。
对于未知蛋白，应选用分离范围较宽的凝胶，如用Sephacryl S-300。
对于分子量在3~5kDa的蛋白质，脱盐时应选用Sephadex G 50或G 25；而对于小分子量多肽物质（1~5kDa），脱盐则应选用Sephadex G 10或Sephadex G 15。
②凝胶介质的处理和装柱商品凝胶一般是干粉，使用前应用水溶胀。
一般情况下，1份凝胶加十份水，自然溶胀至少24小时。
溶胀后，将上清中细小的凝胶碎块弃除，重新搅拌悬起，待凝胶沉淀后，再次弃去凝胶碎块，重复数次，直到液相澄清为止。
为加速溶胀，可将凝胶煮沸一小时，该法同时具有灭菌的作用。
凝胶过滤层析柱的长与直径的比例应为50~100:1。
装柱时柱体要垂直，先在柱内加入约1/3柱床体积的水或缓冲液，然后沿柱一侧将缓冲液中的凝胶（凝胶：缓冲液=3：1）搅拌均匀，缓慢并连续地一次性注入柱内。
装柱过程中，要避免柱内缓冲液流干，注意保持柱体凝胶均匀无气泡和裂缝。
装完后，可用2 ml蓝色葡聚糖溶液检查柱体的均匀性。
如柱体均匀，可见蓝色区带均匀平稳地通过凝胶，不留任何条纹。
要保持凝胶和缓冲液温度一致，以减少气泡的产生。
③上样凝胶过滤柱层析对于样品的体积有严格的要求。
样品体积不应超过柱床体积的1~5 %，如超过5 %，则会导致分离效率降低，低于1 %则分离效率也不会提高，所以蛋白质样品应尽可能浓缩至10~20 mg/ml。
样品本身对洗脱液的相对粘度不能超过2，样品粘度过高，会使层析区带不稳定，或流速不规律，区带变宽或扭曲。
上样前样品应经0.2 μm 孔径滤膜过滤或10，000 g离心5 min，去除残渣，加样时避免破坏柱体表面，保持其表面均匀平整。
④洗脱洗脱液应保持一定的离子强度以消除凝胶中含有的游离羧基和硫酸根等与蛋白质的结合作用。
Sephadex和Sepharose CL凝胶层析所用的洗脱液的离子强度至少应为0.02 mol/L；Sephacryl凝胶应为0.05 mol/L。
凝胶过滤层析技术z
测定分子量
当Kd=1时，洗脱体积Ve=V0+Vi，为全渗入。 当Kd=0时，洗脱体积Ve=V0，为全排阻。
0＜Kd＜1时，洗脱体积Ve=Vo+KdVi，为部分渗入。
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|分类与性质
凝胶
分类性质
凝 胶 含大量液体的具三维网状开孔弹性结构的多聚体结构
，一般制成球状颗粒。
性
能 多孔、亲水、惰性、稳定、不带电荷、色谱性能好
层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼
脂糖)类物质，小分子物质能进入其内部，流下时路程较长，而大分子物
质却被排除在外部，下来的路程短，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱 时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。
|基本原理
原理
分子
洗脱体积
分配系数
Services
凝胶过滤层析过程示意图
se)
结 构
制
备
|分类与性质
凝胶
分类性质
琼脂糖凝胶 (Sepharose)
稳定性
色谱性
|分类与性质
凝胶
分类性质
交联琼脂糖 (Sepharose)
结 构
稳定性
色谱性
|分类与性质
凝胶
分类性质
新型凝胶
superose
superdex
| 基本操作
|基本原理
原理
分子
洗脱体积
分配系数
我们将要分离的分子分为三类
Services
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|基本原理
原理
分子
洗脱体积
分配系数
1、外水体积：指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，即凝胶颗粒间液体流动相的 体积。（Vo） 2、内水体积：指凝胶颗粒中孔穴的体积，即凝胶层析中固定相体积。（Vi） 3、基质体积：指凝胶颗粒实际骨架体积。（Vg） 4、柱床体积：指凝胶柱所能容纳的总体积。（Vt） 5、洗脱体积：指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。（Ve ）
柱效测定
柱效测定是一项经常使用的操作，对于定量表征层析柱的工作状态是否良好，工艺的验证具有重要的意义。
但是实际工作中很多朋友都遇到不会测柱效或者测出来注销过低的状况，不知道如何解决。
所以今天我就给大家详细介绍一下柱效的正确测定方法，以及经常遇到的问题如何解决。
本方法适用于所有GE公司中低压液相色谱的预装柱及自己填装的层析柱。
介绍分为5个部分，测前准备、试剂选择、测柱效操作、测试结果积分、经常发生的问题。
1. 测前准备：⑴ÄKTA层析设备。
要求设备的型号与层析柱大小匹配，从上样阀门到紫外和电导检测器之间的体积要做到最小（管路内径尽量细，管路尽量短），这对于准确测量实验室小层析柱的柱效非常重要。
⑵测试平衡溶液及样品。
这个部分在试剂选择中单独细说。
⑶装填好的层析柱。
使用平衡缓冲液在测柱效的流速下至少平衡1.5 CV（柱体积），平衡方向与测柱效方向必须一致⑷样品环。
容积大于1%柱体积。
2. 试剂选择测柱效主要有两种测试系统：1 NaCl 测试系统；2 丙酮测试系统。
只要操作正确，两个系统测出来的结果是基本一致的。
但是要注意：各试剂的浓度不能随意改变，否则影响测试结果。
⑴NaCl测试系统对于所有种类的柱子和填料，都可以使用氯化钠系统测柱效平衡液：0.4 MNaCl水溶液样品：0.8 M NaCl水溶液⑵丙酮测试系统对于亲和、离子交换和凝胶过滤技术的层析柱和填料平衡液：水样品：1%丙酮的水溶液对于反相和疏水层析柱和填料平衡液：20%乙醇样品：1%丙酮溶于20%乙醇3. 测柱效操作测柱效全程使用30 cm/h线性流速。
平衡层析柱至少1.5 CV，将1% CV的样品（NaCl或丙酮）注射进入层析柱，使用平衡液冲洗直至电导或紫外280nm出现响应峰。
4. 测试结果积分以UNICORN6版本为例演示给大家看如何操作（各UNICORN版本操作基本一致）。
以NaCl系统测柱效的所有操作针对电导曲线，以丙酮系统测柱效的所有操作针对UV 280曲线（手头没有测柱效结果，所以随便找了一个图，里面有两个峰。
层析柱装填及柱效测定及凝胶过滤层析基础知识
层析柱装填及柱效测定及凝胶过滤层析基础知识一、实验目的和内容目的：1. 掌握凝胶过滤层析的原理，掌握凝胶柱柱效测定方法；2. 熟悉凝胶层析的一般过程；3. 了解凝胶介质的选择原则和应用领域。
内容：1. Sephadex G-50凝胶柱的装填；2. 凝胶柱柱效测定；3．凝胶再生的方法。
二、实验仪器和试剂1. 实验仪器层析柱（1×40 cm），砝码天平，玻璃棒，分部收集器，核酸蛋白质检测仪，记录仪，滴头吸管2. 实验材料和试剂Sephadex G-50，0.02mol/L pH8.0的PBS缓冲液，5％丙酮（PBS缓冲液作为溶剂）三、实验步骤清洗层析柱测定层析柱的内径、高度，计算所需凝胶的体积根据Sephadex G-50的膨胀体积，计算所需干凝胶的质量称取相应质量的干凝胶，加入其总吸液量10倍的0.02 mol/L PBS在100℃水浴中加热溶胀1小时以上，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将凝胶上面过多的溶液倾出关闭层析柱出水口，向柱管内加入约1/4柱容积的洗脱液（重复使用的填料，从此步开始）边搅拌，边将薄浆状的凝胶液连续倾入柱中，使其自然沉降等凝胶沉降约2-3cm后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉积待沉积的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭出水口通过2-3倍柱床体积的洗脱液使柱床稳定(流速0.5～1 mL/min)始终保护凝胶上端有一段液体准备好恒流泵、分部收集器、核酸蛋白检测仪及记录仪打开柱上端的螺丝帽塞子，吸出层析柱中多余液体直至与胶面相切沿管壁将5%丙酮溶液0.6 mL小心加到凝胶床面上，应避免将床面凝胶冲起（参考完成时间11：30）打开下口夹子，使样品溶液流入柱内，同时收集流出液，当样品溶液流至与胶面相切时，夹紧下口夹子按加样操作，用1 mL洗脱液冲洗管壁2次加入3－4 mL洗脱液于凝胶上，旋紧上口螺丝帽将层析柱进水口连通恒流泵，柱出水口与核酸蛋白质检测仪比色池进液口相连，比色池出液口再与自动部分收集器相连，用两根导线将检测仪与记录仪连接起来，设置好基线的位置洗脱时，打开上、下进出口夹子，用0.02mol/LpH8.0的PBS，以0.5～1 mL/min 流速洗脱，记录tr(记录仪纸速设为12cm/h，电压200mv；核酸蛋白监测仪检测波长254nm，灵敏度为0.1A)，计算单位高度的柱效（参考完成时间16：00）柱效计算公式：N = 5.54?［θr/( W 1/2)］2其中，θr为平均洗脱时间，W 1/2为半峰宽。
凝胶柱层析操作要点
凝胶柱层析操作要点(一) 基本原理凝胶是一种不带电荷的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，象筛子，直径大于孔径的分子将不能迸入凝胶内部，便直接沿凝胶颗粒的间隙流出，称为全排出。
较小的分子在容纳它的空隙内，自由出入，造成在柱内保留时间长。
这样，较大的分子先被洗脱下来，而较小的分子后被洗脱下来，从而达到相互分离的目的。
洗脱时峰的位置和该物质相对分子质量有直接的定量关系。
在一根凝胶柱中，颗粒间自由空间所含溶液的体积为外水体积V。
不能进入凝胶孔径的那些大分子，当洗脱体积为V。
时，出现洗脱峰。
凝胶颗粒内部孔穴的总体积称为内水体积Vi ，能全部渗入凝胶的那些小分子，当洗脱体积为V。
+ Vi 时出现洗脱峰。
(二)凝胶的类型及性质1.交联葡聚糖凝胶交联葡聚糖凝胶的商品名称为Sephadex，由葡聚糖和3-氯-1.2-环氧丙烷(交联剂)以醚键相互交联而形成具有三维空间多孔网状结构的高分子化合物。
交联葡聚糖凝胶，按其交联度大小分成8种型号(表6–2)。
交联度越大，网状结构越紧密，孔径越小，吸水膨胀就愈小，故只能分离相对分子质量较小的物质;而交联度越小，孔径就越大，吸水膨胀大，则可分离相对分子质量较大的物质。
各种型号是以其吸水量(每g干胶所吸收的水的质量)的10倍命名，如，Sephadex G–25表示该凝胶的吸水量为每g干胶能吸2.5克水。
在SephadexG–25及G–50中分别引入羟丙基基团，即可构成LH型烷基化葡聚糖凝胶。
交联葡聚糖凝胶在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液和有机溶剂中较稳定，但当暴露于强酸或氧化剂溶液中，则易使糖甘键水解断裂。
在中性条件下，交联葡聚糖凝胶悬浮液能耐高温，用120?消毒10分钟而不改变其性质。
如要在室温下长期保存，应加入适量防腐剂，如氯仿、叠氮钠等，以免微生物生长。
交联葡聚糖凝胶由于有羧基基团，故能与分离物质中的电荷基团(如碱性蛋白质)发生吸附作用，但可借助提高洗脱液的离子强度得以克服。
层析凝胶层析装层析柱的过程及装柱要求等特制教育
▪ 因此分子的正常Kd值0~1之间,这种由小到 大的Kd值顺序决定了物质流出的顺序。
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Ve与MW的关系
对同一类型的化合物,洗脱特性与组分 的分子量有关,流过凝胶柱时,按分子量(MW) 大小顺序流出,MW大的走在前面,Ve与MW 的关系可用下式表示: Ve = K1 - K2lgMW K1 K2 为常数, MW为分子量
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二.层析技术的分类
1. 按两相所处的状态分类
以液体作为流动相的层析称为液相层 析，以气体作为流动相的称为气相层析。
其固定相也可有两种状态，一种是以 固体作为吸附剂的固定相，另一种是以涂 布在固体载体表面的液体作为固定相。
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层析
气相层析（gaschromatography）
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三.层析的一般原理
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1.分配系数
(Partition chromatography)
混合物在层析过程中不管层析技术采 用哪两种状态的相(流动相和固定相)都能达 到分配平衡，用来叙述一种物质在两种特 定相中的分配程度是用分配系数表示的。
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分配系数----是一种物质在两种特定相中分配，
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一、定义
凝胶层析…是按照被分离物质分子大 小,经过具有一定孔径的多孔物质进行分离 的一种方法。其又称为凝胶过滤或分子筛 过滤或排阻层析。
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主要机理是分子筛效应,当被分离物质 流经凝胶柱时,因各组份的分子大小不同,在 凝胶受到的阻滞作用有差异,从而造成各组 分在凝胶柱中的迁移速度不同得到分离。
Sephadex的化学性质稳定,不溶于水、盐、弱酸和碱, 耐热耐碱不耐酸。
凝胶过滤层析时柱床高度
凝胶过滤层析时柱床高度
凝胶过滤层析是一种常用的色谱技术，广泛应用于生物医药、食品、环境等领域。
柱床高度是凝胶层析中一个重要的参数，对层析分离的效果有着直接的影响。
柱床高度是指填充在柱子中的凝胶层析材料的高度。
柱床高度的选择应根据具体实验需求和样品特性来确定。
一般来说，柱床高度越高，样品分离效果越好，但同时也会导致分离时间变长。
柱床高度的选择与样品的复杂程度有关。
对于复杂的样品，为了获得更好的分离效果，可以选择较高的柱床高度。
而对于相对简单的样品，为了节省时间和提高分析效率，可以选择较低的柱床高度。
柱床高度的选择还与所使用的凝胶材料和柱径有关。
不同的凝胶材料具有不同的分离性能，柱床高度的选择应根据凝胶材料的性质来确定。
柱径越大，柱床高度相应可以选择较高，以增加分离效果。
柱床高度还会影响样品在柱床中的流动速度。
柱床高度越高，流动速度越慢，分离效果越好。
但同时，流动速度的减慢也会增加分离时间。
因此，在选择柱床高度时需要综合考虑实验时间和样品分离效果。
在实际操作中，选择合适的柱床高度还需要考虑实验室的设备条件和操作经验。
柱床高度较高时，柱子中的压力也会增加，需要确保设备能够承受这种压力。
同时，较高的柱床高度也需要较长的时间
来平衡和稳定，操作人员需要有一定的经验和耐心。
柱床高度是凝胶过滤层析中一个重要的参数，对层析分离效果有着直接的影响。
在选择柱床高度时需要考虑样品的复杂程度、凝胶材料的性质、柱径以及实验室设备和操作经验等因素。
合理选择柱床高度可以提高分离效果，缩短实验时间，提高实验效率。
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层析柱装填及柱效测定及凝胶过滤层析基础知识
一、实验目的和内容
目的：1. 掌握凝胶过滤层析的原理，掌握凝胶柱柱效测定方法；
2. 熟悉凝胶层析的一般过程；
3. 了解凝胶介质的选择原则和应用领域。
内容：1. Sephadex G-50凝胶柱的装填；
2. 凝胶柱柱效测定；
3．凝胶再生的方法。
二、实验仪器和试剂
1. 实验仪器
层析柱（1×40 cm），砝码天平，玻璃棒，分部收集器，核酸蛋白质检测仪，记录仪，滴头吸管
2. 实验材料和试剂
Sephadex G-50，0.02mol/L pH8.0的PBS缓冲液，5％丙酮（PBS缓冲液作为溶剂）
三、实验步骤
清洗层析柱
测定层析柱的内径、高度，计算所需凝胶的体积
根据Sephadex G-50的膨胀体积，计算所需干凝胶的质量
称取相应质量的干凝胶，加入其总吸液量10倍的0.02 mol/L PBS
在100℃水浴中加热溶胀1小时以上，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去
用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将凝胶上面过多的溶液倾出
关闭层析柱出水口，向柱管内加入约1/4柱容积的洗脱液
（重复使用的填料，从此步开始）
边搅拌，边将薄浆状的凝胶液连续倾入柱中，使其自然沉降
等凝胶沉降约2-3cm后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉积
待沉积的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭出水口
通过2-3倍柱床体积的洗脱液使柱床稳定(流速0.5～1 mL/min)
始终保护凝胶上端有一段液体
准备好恒流泵、分部收集器、核酸蛋白检测仪及记录仪
打开柱上端的螺丝帽塞子，吸出层析柱中多余液体直至与胶面相切
沿管壁将5%丙酮溶液0.6 mL小心加到凝胶床面上，应避免
将床面凝胶冲起（参考完成时间11：30）
打开下口夹子，使样品溶液流入柱内，同时收集流出液，当样品溶液流至与胶面相切时，夹紧下口夹子
按加样操作，用1 mL洗脱液冲洗管壁2次
加入3－4 mL洗脱液于凝胶上，旋紧上口螺丝帽
将层析柱进水口连通恒流泵，柱出水口与核酸蛋白质检测仪比色池进液口相连，比色池出液口再与自动部分收集器相连，用两根导线将检测仪与记录仪连接起来，设置好基线的位置
洗脱时，打开上、下进出口夹子，用0.02mol/LpH8.0的PBS，以0.5～1 mL/min流速洗脱，记录t r(记录仪纸速设为12cm/h，电压200mv；核酸蛋白监测仪检测波长254nm，灵敏度为
0.1A)，计算单位高度的柱效（参考完成时间16：00）
柱效计算公式：N = 5.54•［θr/( W 1/2)］2
其中，θr为平均洗脱时间，W 1/2为半峰宽。
均为无因次特性值，测量时精确到1mm。
[Sephadex G-100每米理论塔板数为3000～6000]
四、注意事项
1. 各接头不能漏气，连接用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。
2. 装柱要均匀，既不过松，也不过紧，最好在要求的操作压下装柱，流速不宜过快，避免因此压紧凝胶。
3. 始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分蒸发，凝胶变干。
也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动。
4. 所用凝胶比较昂贵，需小心操作，实验后回收，尽量避免浪费和损失。
五、演示
（一）核酸蛋白检测仪及记录仪操作方法
1. 在仪器使用前，首先检查检测器，电源和记录仪三部份电路连接是否正确，插上电源插头。
2. 接通记录仪电源开关，使电源开关拔到“通”指示灯亮。
可根据需要调换不同的走纸速度。
记录仪量程调在10mV档上。
3. 将检测仪波长旋钮旋到所需波长刻度上，把量程旋钮拔到100％T档。
4. 按下检测仪电源箱面板上的电源开关，此时记录仪指针从零点开始向右移动某一刻度，调节“光量”旋钮使指针停留在记录仪大约中间位置5mV左右数字显示为50左右。
仪器开机稳定时间大约在1小时左右，待基线平直后，可加样测试。
5. 把检测器进样口塑料胶管接到部份收集器上，使层析柱中的洗脱液通过。
透光率为“0”厂家巳调好，光密度A要调零，量程开关拔到100％T，调节光量旋钮，使记录仪指针在10mV 数字显示为100，即透光率为100%。
把量程开关拔到“A”挡，缓慢调节A调零旋钮，使检测仪数字显示为“0” ，同时调节记录仪零位旋纽使记录仪指示在"0"位。
6. 上述5个步骤结束后，就可以在层析柱上加样。
当样品经层析柱分离，通过检测后，就能通过记录仪给出所需样品吸收的图谱。
7. 测试完毕，必须切断电源，并用蒸馏水清洗样品池和尼龙管。
记录仪光吸收A读数
当采用l0mV量程记录仪时，记录仪的满量程读数对应于A量程开关所对应的A读数范围。
如A量程开关选定在0-0.5A时，则记录仪满量程光吸收A读数为0.5，当记录笔指示在记录纸一半(50%刻度)位置时即为0.25A。
数字显示光吸收A读数(可变量程读数模式)
当A量程开关选定在0-1.0A档时，此时数显板上显示和读数即为光吸收A的实际读数，如显示为080即表示为0.80A。
当A量程开关切换在其它量程位置时，则数显光吸收A读数为:
A量程选定在0-2.0档时，数显读数×2=实际光吸收读数A
A量程选定在0-1.0档肘，数显读数×1=实际光吸收读数A。