最新临床基因扩增检验实验室的规范化设置及其管理
临床基因扩增(PCR)诊断实验室工作规范(试行)
附件2临床基因扩增（PCR）诊断实验室工作规范(试行）为使基因扩增诊断技术规范有效的用于临床，保证检测质量，更好地为临床疾病的诊疗服务,特制定本规范.1．临床基因扩增实验室的设置：和仪器设备临床PCR实验室应分为四个隔开的工作区域，每一区域都应有专用的仪器设备。
即1）试剂贮存和准备区；2)标本制备区;3）扩增反应混合物配制和扩增区和的扩增产物分析区.如使用扩增和产物检测同时完成的荧光定量PCR方法或全自动分析仪如Cobas－T(Anplicor)等，则3）和4)两个区可合并。
与上述特定实验区有关的各个房间必须有明确的标记，以避免不同工作区内的设备物品如加样器、试剂等的移出或不同的工作区间发生混淆。
进入各个工作区必须遵循一严格的）顺序，只能按单一方向进行，即从试剂贮存和准备区～标本制备区~扩增反应混合物配制和扩增区～扩增产物分析区。
不同的工作区必须使用不同的工作服，可以不同的颜色来区别.此外，当工作人员离开各工作区时，不得将各区特定的工作服带出。
1．l．试剂贮存和准备区本区用于贮存溶液的制条、溶液的分装和主反应混合液的制各。
本区仪器设备配置:（l) 4 冰箱和一20 冰柜；（2）混匀器；（3)微量加样器若干支（覆盖1～1000pl）；（5）专用工作服和工作鞋;（6）专用办公用品；（7）消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离.心管和加样器吸头(带滤心）；（8）可移动紫外灯（近工作台面）.1．2．标本制备区标本贮存、核酸提取及贮存均在本区内进行。
RNA测定时的单键。
cDNA合成也在本区进行。
本区仪器设备自己置：( l）4冰箱、－20 或-70 冰柜三( 2)高达台式冷冻离心机；（3)混匀器;（4）水浴箱或加热模块；（5）微量如排器若干支（覆盖l～1000μl）;(6）专用工作服和工作鞋;（7）专用办公用品；（8）消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的部心管和加样器吸头(带滤心）;（9)可移动紫外灯(近工作台面）；（10)超净工作台；（11)超声波水浴（处理大分子DNA适用）.1．3．扩增反应混合物配制和扩增区模板材料（来自标本制备区）和主反应混合液（来自试剂贮存和准备区）的加入以及扩增反应等专门在本二．作区内近行。
临床基因扩增实验室管理和质量保证
失控的可能原因
弱阳性质控样本 核酸提取过程中的随机误差 仪器 试剂
阴性质控样本 扩增产物的污染 核酸提取过程中标本间的交叉污染
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临床基因扩增检验的室内质量控制
分析前的质量控制
实验室的正确设置 仪器、设备的管理 试剂质量 人员培训 规范操作
分析中的质量控制
常规检测临床标本的同时，测定一份或连续 测定数份含一定浓度分析物的质控样本，用 统计学方法判断质控样本的检测结果是否偏 出允许范围，进而决定常规标本检测结果的 有效性。
必须注意空气流向（通过实验室的空气压力 而实现）缓冲室：负压源自用于更换工作衣和工作鞋) 实验室：常压
各功能区内设置相应的仪器和设备 模板制备区设生物安全柜 各功能区内的任何物品不可移至其它功能区
原则： 各功能区互相独立 设缓冲间, 保持区域间完全分隔 各区物品专用
临床基因扩增检验实验室必须经过国家有关 部门的验收认可
（稳定可靠的质控品 切实可行的统计方法）
稳定可靠的室内质控物
质控样本的基质与待测样本一致 所含待测物浓度应接近试验的决定性水平
定性检测：检测的阳性判断值 定量检测：检测浓度范围的下、上限 稳定性、生物安全性 已知靶值或预期结果 单批量大、廉价
每次扩增必须设置监测污染发生的阴性 质控
切实可行的统计方法
必须遵循申报程序
（扫描程序）
第二节 临床基因扩增实验室的质量保证
室内质量控制 （internal quality control, IQC）
室间质量评价 （external quality assessment, EQA）
标本的采集、运送、保存及其质量控制
按检测要求建立标准操作程序和质量控制 规则
临床基因扩增实验室的设置与人员资质要求
临床基因扩增实验室的设置与人员资质要求大家好，今天我们来聊聊临床基因扩增实验室的设置与人员资质要求。
我们要明确一点，这个实验室可不是随便设立的，它涉及到人类生命健康的问题，所以一定要严格把关。
那么，这个实验室到底需要什么样的设置和人员资质呢？咱们一一来分析。
1. 实验室的设置(1)实验场地实验室的选址非常重要，最好选择在空气清新、环境优美的地方。
实验室的大小也要足够，以满足实验的需要。
实验室还要有良好的通风系统和排水设施，确保实验过程中的环境安全。
(2)实验设备实验室的核心设备就是基因扩增仪器了。
这些仪器的价格不菲，所以要选择性能稳定、操作简便的设备。
实验室还需要一些辅助设备，如离心机、PCR仪等。
这些设备的质量直接影响到实验结果的准确性。
(3)试剂和耗材试剂和耗材也是实验室必不可少的物品。
试剂包括引物、探针、荧光素等，而耗材则包括PCR管、离心管等。
这些物品的质量要过硬，否则可能会影响实验结果。
(4)实验操作人员实验室的操作人员是关键。
他们需要具备一定的生物学知识和实验技能，才能保证实验的顺利进行。
操作人员还要有一定的责任心，确保实验过程的安全。
2. 人员资质要求(1)学历要求实验室的操作人员至少要具有本科及以上学历，最好是生物学、生物技术等相关专业。
这样才能保证他们具备足够的专业知识，胜任实验工作。
(2)技能要求实验室的操作人员需要掌握一定的实验技能，如PCR扩增、凝胶电泳等。
他们还要熟悉实验室设备的使用方法，以便顺利完成实验任务。
(3)经验要求由于实验室的工作涉及到生命健康问题，所以操作人员最好有一定的实践经验。
这样他们在面对突发情况时，才能迅速作出判断，保障实验的安全进行。
(4)责任心要求实验室的操作人员要有强烈的责任心，确保实验过程的安全。
在实验过程中，他们要严格按照操作规程进行，不得擅自更改实验方案。
他们还要对实验结果负责，确保数据的准确性。
临床基因扩增实验室的设置与人员资质要求是非常严格的。
临床基因扩增检验实验室基本设置标准
临床基因扩增检验实验室基本设置标准一、临床基因扩增检验实验室区域设置原则（一）临床基因扩增检验实验室区域设置原则1、试剂储存和准备区2、标本制备区3、扩增反应混合物配制和扩增区4、扩增产物分析区如使用全自动分析仪，区域可适当合并。
（二）各工作区域必须有明确的标记，避免不同工作区域内的设备、物品混用。
（三）进入各工作区域必须严格按照单一方向进行，即试剂储存和准备区—>标本制备区—>扩增反应混合物配制和扩增区—>扩增产物分析区。
（四）不同的工作区域使用不同的工作服（例如不同的颜色）。
工作人员离开各工作区域时，不得将工作服带出。
二、工作区域仪器设备配置标准（一）试剂储存和准备区1、2-8C和-15C冰箱2、混匀器3、微量加样器（覆盖1-1000ul）4、移动紫外灯（近工作台面）5、消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心）6、专用工作服和工作鞋7、专用办公用品（二）标本制备区1、2-8C冰箱、-20C或-80C冰箱2、高速台式冷冻离心机3、混允器4、水浴箱或加热模块5、微量加样器（覆盖1-1000ul）6、可移动紫外灯（近工作台面）7、超净工作台8、消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心）9、专用工作服和工作鞋10、专用办公用品如需处理大分子DNA，应具有超声波水浴仪。
（三）扩增反应混合物配制和扩增区1、核酸扩增仪2、微量加样器（覆盖1-1000ul）3、可移动紫外灯（近工作台面）4、消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心）5、专用工作服和工作鞋6、专用办公用品(四)扩增产物分析区视检验方法不同而定。
基本仪器设备如下：1、微量加样器（覆盖1-1000ul）2、可移动紫外灯（近工作台面）3、消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、加样器吸头（带滤心）4、专用工作服和工作鞋5、专用办公用品临床标本接收区如果在标本接收区分离血清（浆）标本，有1台分离血清（浆）用离心机、1台生物安全柜、1台冰箱、加样器及相应一次性经高压处理的消耗品如带滤芯吸头、标本接收编号记录本以及记号笔等即可。
临床PCR实验室的设置及质量管理内容
什么样的临床基因扩增检验实验室 是最标准的？
临床基因扩增实验室设置的一般原则
各区独立
注意风向 因地制宜
“十六字口诀”
方便工作
基因扩增实验室 各区的功能和配置
试剂储存和准备区
储存试剂的制备 试剂的分装 主反应混合液的制备
冰箱 混匀器 微量加样器 可移动紫外灯 专用工作服和工作鞋 消耗品（带滤心吸头、
实验室管理要求：记录
实验室应有适合自身实际情况又符合现行规章 制度的记录管理制度；
记录应有参与标本收集、标本准备和处理、检 测的人员签字。
所有记录和报告都应安全贮存、妥善保管并保 密。
实验室管理要求：报告
检测结果的报告应准确、清晰和客观。定性测定报告“阴 性”或“阳性”；定量测定则以拷贝数/ml或IU/ml报告。
当临床科室或患者要求用电话、图文传真或其它电子和电 磁设备传送结果时，实验室应保证工作人员遵循文件化的 程序，并为对方保密。
怎样编写SOP？
实验室的日常工作管理
工作项目 水浴箱、微量恒温器（加热模块） 次氯酸钠溶液 生物安全柜 室内质控
弱阳性质控（定性） 低、中、高浓度质控（定量） 阴性质控：原样本
最主要的扩增产物污染 来源
有可能使用致突变和有 毒物质
微量加样器 可移动紫外灯 专用工作服和工作鞋 专用消耗品 专用办公用品等
实验室质量管理体系的建立
质量手册 质量体系程序文件 标准操作程序
实验室管理要求：设备管理
主要设备应有维护程序文件及维护记录；
(a)有问题的设备应立即停止使用，并加上明显标识，如可 能应将其贮存在规定的地方直至修复；(b)修复的设备必须 经校准、检定（验证）或检测满足要求后方能再次投入使 用；(c)实验室应检查由于上述缺陷对以前所进行的检测工 作的影响。
临床基因扩增检验实验室的设置、质量管理
实验室使用和管理：
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标本接受区
试剂准备区
样本制备区 扩增区
产物分析区
区域的适当合并： “由于测定技术总是在发展之中，
区域的合并应根据仪器的特点而定”
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小结：
从核心仪器特点、实验室的现状出发，综 合考虑管理要求
有关职责进行审核。
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管理要求（现场考核）：
送审的文件描述与实验室实际情况的一致 性
实际运行与文件规定的一致性 人员素质：对文件的认知、熟悉、灵活运
用程度
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现场考核的实际内涵： 认识到不到位 落实到不到位 符合性检查加指导性检查 有重点的全面检查
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标本制备区：
临床标本的保存
核酸提取、储存及
其加入至扩增反应 管
测定RNA时cDNA的合 成
不得在本区对样本进 行PCR扩增
冰箱 (2~8℃和-20℃或-80℃) 高速台式冷冻离心机
水浴箱和/或加热模块 生物安全柜 混匀器
微量加样器 可移动紫外灯 专用工作服和工作鞋
四个组成部分的关系：
关键：核心——过程（活动） 纽带——程序组织结构 Nhomakorabea程序
资源
过程
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过程
理解
“过程”的重要性 1、工作是通过过程来完成的。 2、质量管理是通过对各种过程的控制 来实现的。 3、质量管理本身也是一系列的过程
过程的分解、控制 过程的有机组合
临床基因扩增检验实验室工作规范
临床基因扩增检验实验室工作规范为使基因扩增检验技术有效地应用于临床，更好地为疾病的预防、诊断和治疗服务，保证检验质量，特制定本规范。
一、临床基因扩增检验实验室的规范化设置及其管理临床基因扩增检验实验室的规范化设置详见《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》(卫医发[2002]10号文)附件《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》。
为避免污染，必须严格遵循《临床基因扩增检验实验室设置标准》设置临床基因扩增检验实验室。
临床基因扩增检验实验室四个隔开的工作区域中每一区域都须有专用的仪器设备。
各区域都必须有明确的标记，以避免设备物品如加样器或试剂等从其各自的区域内移出从而造成不同的工作区域间设备物品发生混淆。
进入各个工作区域必须严格遵循单一方向顺序，即只能从试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区(简称扩增区)至产物分析区，避免发生交叉污染。
在不同的工作区域应使用不同颜色或有明显区别标志的工作服，以便于鉴别。
此外，当工作者离开工作区时，不得将各区特定的工作服带出。
清洁方法不当也是污染发生的一个主要原因，因此实验室的清洁应按试剂贮存和准备区至扩增产物分析区的方向进行。
不同的实验区域应有其各自的清洁用具以防止交叉污染。
(一)试剂贮存和准备区下述操作在该区进行：贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。
贮存试剂和用于标本制备的材料应直接运送至试剂贮存和准备区，不能经过产物分析区。
在打开含有反应混合液的离心管或试管前，应将其快速离心数秒。
试剂原材料必须贮存在本区内，并在本区内制备成所需的贮存试剂。
当贮存试剂溶液经检查可用后，应将其分装贮存备用，避免由于经常打开反应管吸液而造成污染。
含反应混合液的离心管或试管在冰冻前都应快速离心数秒。
大多数用于扩增的试剂都应冰冻贮存。
为避免因单次反应取液而频繁的冻融主贮存试剂，应分装冰冻贮存试剂溶液。
贮存试剂的分装体积根据通常在实验室内一次测定所需的扩增反应数来决定。
临床基因扩增检验实验室管理制度
临床基因扩增检验实验室管理制度
一、目的：
强调严格按照卫生部临检中心关于基因扩增检验实验室的规定进行实验室管理和实验操作，确保检验的质量，实施实验室标准化管理制度。
二、适用范围：
临床基因扩增检验实验室。
三、职责：
由临床基因扩增检验实验室专业技术人员制定程序文件，实验室负责人审核，科室主任批准实施。
四、要求：
1、临床基因扩增检验实验室工作人员应具备医学检验、微
生物学检验及分子生物学基本知识、大中专以上学历、并受过临床基因扩增实验的基本知识和技能培训。
2、临床基因扩增检验实验室的各区应有专用的实验设备（含
工作服、加样器、试管架、吸头、记录纸、笔等），不得混用，须贴上标签予以区别。
3、实验室工作人员必须严格按照临床基因扩增实验操作程
序进行，包括实验室擦洗、台面消毒，离心管、吸头的无菌灭活准备，仪器使用和废弃物处理等。
4、进入实验室后区的物品不许带回实验室前区。
5、每天实验开始前，必须清洁地面和消毒实验台面。
6、定期校准和维护核酸扩增仪、加样器、水浴箱等仪器设备。
7、进入实验室的工作人员必须遵守实验室的唯一流向规定，
严禁反向流动。
8、进入实验室，必须更换本室各区专用的工作服、拖鞋，
每周两次换洗工作服。
9、实验室不得饮食、吸烟、会客。
10、实验结束后开紫外灯消毒实验室及台面30～60分钟。
11、每天下班前处理好废弃物品，关好水、电、和门窗。
临床基因扩增检验实验室的设置及质量管理体系的建立(PPT 35页)
注意风向 “十六字口诀”
因地制宜 方便工作
产物分析区
扩增区
标本制备区 试剂准备区
传递窗
传递窗
传递窗
空气流向
空气流向
空气流向
空气流向
缓冲间
缓冲间
缓冲间
专用走廊
工作流向
实验室质量管理体系的建立
质量手册 质量体系程序文件 标准操作程序
(相关记录表格)
质量管理的内涵
阳性室内质控物来源：
浓度及批号：
扩增位置：
阴性室内质控物来源：
批号：
扩增位置：
所取理的标本（对应标本接收的唯一编号）及拟扩增位置：
1
9
17
25
2
10
18
26
3
11
19
27
4
12
20
28
5
13
21
29
6
14
22
30
7
15
23
31
8
16
24
32
核酸提取及加样过程：按XXX（列出编号）SOP进行。
仪器设备使用： 生物安全柜： 正常 不正常 恒温仪温度校准： ℃
实验室的日常工作管理
工作项目
水浴箱、微量恒温器（加热模块） 次氯酸钠溶液 生物安全柜 室内质控
弱阳性质控（定性） 低、中、高浓度质控（定量） 阴性质控：原样本
经历提取过程的空管 仅含扩增反应混合液管 实验台面
加样器、离心机
实验室各区
核查点
□校准及记录温度 □新鲜配制 □先起动运行30分钟后再开始工作
□有 □有
□有 □有 □有
□使用后用次氯酸钠溶液消毒， 再用70%乙醇清洁
临床基因扩增检验实验的设置、管理和技术验收(新)
卫生部临床检验中心 李金明
临床基因扩增检验实验室的设置
依据：卫生部颁发的《临床基因扩
增检验实验室管理暂行办法》（卫 医发[2002]10号）
临床标本的接收
通常的工作流程：标本采集
编号 保存或检测
血清分离
应在四个测定区域之外的地方或区域内 接收 接收的标本应收集在原始容器中 在核酸提取时带入至标本制备区
记
录
本章包括三条。 有记录管理制度：适合自身实际情况，符 合现行规章制度；（由谁管、在何处管、 保存多长时间） 原始记录、计算和导出数据应归档并保存； 记录应有有关人员的签字； 所有记录和报告都要妥善保管并保密。
报
告
检测结果的报告应准确、清晰和客观； 定性测定报告“阴性”或“阳性”；定量测定则 以拷贝数/ml或IU/ ml报告；避免二者之间的混 淆； 每份报告应包括以下信息：标题、唯一标识、检 测标本说明、标本特性和状态、标本接收日期和 检测日期、检测方法、检测和校核人员签字及发 出日期、参考结果或范围； 如对报告有效性有疑问，实验室应立即通知临床 相关科室予以改正的程序； 有报告的发放程序：用电话、传真、电子邮件报
实验室的日常工作管理
工作项目
水浴箱、微量恒温器（加热模块） 次氯酸钠溶液 生物安全柜 室内质控 弱阳性质控（定性） 低、中、高浓度质控（定量） 阴性质控：原样本 经历提取过程的空管 仅含扩增反应混合液管 实验台面
核查点
□校准及记录温度 □新鲜配制 □先起动运行30分钟后再开始工作 □有 □有 □有 □有 □有 □使用后用次氯酸钠溶液消毒， 再用70%乙醇清洁 □紫外照射 □使用后用次氯酸钠溶液消毒， 再用70%乙醇清洁 □遵循单一工作流向 □紫外照射
2.基因扩增实验室管理制度
基因扩增实验室管理制度1．目的：规范基因扩增实验管理2．适用范围：基因扩增实验室的管理3．操作步骤：3.1 基因扩增室分试剂准备、标本制备、基因扩增分析三个区，样品接受区独立于三区之外。
各区实验物品应有明显的标示，严禁混用。
3.2 实验室工作人员须有卫生部临检中心或其授权机构颁发的培训上岗证方能进行基因扩增检测工作。
3.3 实验室工作人员必须严格按照基因扩增实验操作程序进行。
实验开始前必须先做好实验室内和工作台的清洁消毒。
3.4 工作人员应遵循单项走动的原则：试剂准备到标本制备区到基因扩增分析。
进入每一个区前必须更换隔离衣和鞋套。
3.5 严格遵守室内质控，每批标本进行检测时都必须附上阴、阳性对照，必要时绘制质控图。
实验结束后若对照品结果出现异常时应立即暂扣本次结果，及时寻找原因并加以纠正后，才能发出报告。
3.6 非本室工作人员未经允许不得进入基因扩增实验室，工作人员在工作时也不能随意进出，以免造成不应有的污染。
3.7 实验结束后应用10%次氯酸钠溶液消毒液消毒实验台面，并以紫外线照射实验室。
试验中使用过的吸头、离心管等应置于10%次氯酸钠溶液中浸泡消毒后集中焚毁。
3.8 每天工作必须填写好日常工作核查表，下班前处理好废弃物品，关好水、电和门窗。
3.9实验室工作人员必须严格遵守本室一切制度，保证实验室的安全。
4．试剂准备区管理制度4.1 实验人员进入该区须穿隔离衣，戴手套，戴帽子，穿鞋套。
4.2 每天实验开始前用10%次氯酸钠溶液清洁实验台。
4.3 取出当天实验需配制和使用的试剂，其余试剂应立即放回冰箱保存好。
4.4 试验中使用的离心管、吸头均在有效期内使用。
4.5 每日工作结束后必须立即清洁本区。
实验台以10%次氯酸钠消毒后，再以紫外灯照射2小时；加样器用75%酒精擦洗；房间开紫外灯照射。
4.6 实验记录使用本室专用的记录本、笔和纸，不得将其它区的用品带入本区。
5．标本制备区管理制度5.1 实验人员进入该区须穿隔离衣，戴手套，戴帽子，穿鞋套。
临床基因扩增检验实验室基本设置标准
临床基因扩增检验实验室基本设置标准根据《临床检验扩增检验实验室管理暂行办法》，制定本标准一、临床基因扩增检验实验室区域设置原则（一）临床基因扩增检验实验室区域设置原则1、试剂储存和准备区2、标本制备区3、扩增反应混合物配制和扩增区4、扩增产物分析区如使用全自动分析仪,区域可适当合并。
(二) 各工作区域必须有明确的标记，避免不同工作区域内的设备、物品混用。
(三) 进入各工作区域必须严格按照单一方向进行，即试剂储存和准备区—>标本制备区-〉扩增反应混合物配制和扩增区—>扩增产物分析区。
（四) 不同的工作区域使用不同的工作服（例如不同的颜色）.工作人员离开各工作区域时，不得将工作服带出。
二、工作区域仪器设备配置标准（一）试剂储存和准备区1、2—8C和—15C冰箱2、混匀器3、微量加样器（覆盖1—1000ul)4、移动紫外灯（近工作台面）5、消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头(带滤心）6、专用工作服和工作鞋7、专用办公用品（二）标本制备区1、2-8C冰箱、—20C或—80C冰箱2、高速台式冷冻离心机3、混允器4、水浴箱或加热模块5、微量加样器(覆盖1—1000ul）6、可移动紫外灯（近工作台面）7、超净工作台8、消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心）9、专用工作服和工作鞋10、专用办公用品如需处理大分子DNA,应具有超声波水浴仪。
(三）扩增反应混合物配制和扩增区1、核酸扩增仪2、微量加样器（覆盖1—1000ul)3、可移动紫外灯(近工作台面)4、消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心）5、专用工作服和工作鞋6、专用办公用品(四）扩增产物分析区视检验方法不同而定。
基本仪器设备如下：1、微量加样器（覆盖1—1000ul）2、可移动紫外灯（近工作台面）3、消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、加样器吸头（带滤心）4、专用工作服和工作鞋5、专用办公用品。
最新临床基因扩增检验实验室工作规范
临床基因扩增检验实验室工作规范为使基因扩增检验技术有效地应用于临床，更好地为疾病的预防、诊断和治疗服务，保证检验质量，特制定本规范。
一、临床基因扩增检验实验室的规范化设置及其管理临床基因扩增检验实验室的规范化设置详见《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》(卫医发[2002]10号文)附件《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》。
为避免污染，必须严格遵循《临床基因扩增检验实验室设置标准》设置临床基因扩增检验实验室。
临床基因扩增检验实验室四个隔开的工作区域中每一区域都须有专用的仪器设备。
各区域都必须有明确的标记，以避免设备物品如加样器或试剂等从其各自的区域内移出从而造成不同的工作区域间设备物品发生混淆。
进入各个工作区域必须严格遵循单一方向顺序，即只能从试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区(简称扩增区)至产物分析区，避免发生交叉污染。
在不同的工作区域应使用不同颜色或有明显区别标志的工作服，以便于鉴别。
此外，当工作者离开工作区时，不得将各区特定的工作服带出。
清洁方法不当也是污染发生的一个主要原因，因此实验室的清洁应按试剂贮存和准备区至扩增产物分析区的方向进行。
不同的实验区域应有其各自的清洁用具以防止交叉污染。
(一)试剂贮存和准备区下述操作在该区进行：贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。
贮存试剂和用于标本制备的材料应直接运送至试剂贮存和准备区，不能经过产物分析区。
在打开含有反应混合液的离心管或试管前，应将其快速离心数秒。
试剂原材料必须贮存在本区内，并在本区内制备成所需的贮存试剂。
当贮存试剂溶液经检查可用后，应将其分装贮存备用，避免由于经常打开反应管吸液而造成污染。
含反应混合液的离心管或试管在冰冻前都应快速离心数秒。
大多数用于扩增的试剂都应冰冻贮存。
为避免因单次反应取液而频繁的冻融主贮存试剂，应分装冰冻贮存试剂溶液。
贮存试剂的分装体积根据通常在实验室内一次测定所需的扩增反应数来决定。
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临床基因扩增检验实验室的规范化设置及其管理使基因扩增检验技术有效地应用于临床，更好地为疾病的预防、诊断和治疗服务，保证检验质量，特制定本规范。
一、临床基因扩增检验实验室的规范化设置及其管理临床基因扩增检验实验室的规范化设置详见《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》(卫医发[2002]10号文附件《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》。
为避免污染，必须严格遵循《临床基因扩增检验实验室设置标准》设置临床基因扩增检验实验室。
临床基因扩增检验实验室四个隔开的工作区域中每一区域都须有专用的仪器设备。
各区域都必须有明确的标记，以避免设备物品如加样器或试剂等从其各自的区域内移出从而造成不同的工作区域间设备物品发生混淆。
进入各个工作区域必须严格遵循单一方向顺序，即只能从试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区(简称扩增区至产物分析区，避免发生交叉污染。
在不同的工作区域应使用不同颜色或有明显区别标志的工作服，以便于鉴别。
此外，当工作者离开工作区时，不得将各区特定的工作服带出。
清洁方法不当也是污染发生的一个主要原因，因此实验室的清洁应按试剂贮存和准备区至扩增产物分析区的方向进行。
不同的实验区域应有其各自的清洁用具以防止交叉污染。
(一)<试剂贮存和准备区下述操作在该区进行：贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。
贮存试剂和用于标本制备的材料应直接运送至试剂贮存和准备区，不能经过产物分析区。
在打开含有反应混合液的离心管或试管前，应将其快速离心数秒。
试剂原材料必须贮存在本区内，并在本区内制备成所需的贮存试剂。
当贮存试剂溶液经检查可用后，应将其分装贮存备用，避免由于经常打开反应管吸液而造成污染。
含反应混合液的离心管或试管在冰冻前都应快速离心数秒。
大多数用于扩增的试剂都应冰冻贮存。
为避免因单次反应取液而频繁的冻融主贮存试剂，应分装冰冻贮存试剂溶液。
贮存试剂的分装体积根据通常在实验室内一次测定所需的扩增反应数来决定。
主反应混合液的组成成份尤其是聚合酶的适用性和稳定性通过预试验来检查，评价结果必须有书面报告。
对于"热启动"技术(在第一个高温变性步骤后加入酶 )，聚合酶也可不包含在主反应混合液中。
在整个本区的实验操作过程中，操作者必须戴手套，并经常更换。
此外，操作中使用一次性帽子也是一个有效地防止污染的措施。
严禁用嘴吸取液体，加样器和吸头等必须经高压处理。
工作结束后必须立即对工作区进行清洁。
本工作区的实验台表面应可耐受诸如次氯酸钠的化学物质的消毒清洁作用。
实验台表面的紫外照射应方便有效。
由于紫外照射的距离和能量对去污染的效果非常关键，因此可使用可移动紫外灯(254nm波长)，在工作完成后调至实验台上60～90cm内照射。
由于扩增产物仅几百bp，对紫外线损伤不敏感，因此紫外照射扩增片段必须延长照射时间，最好是照射过夜。
实验室及其设备的使用必须有日常记录。
(二)标本制备区下述操作在该区进行：临床标本的保存，核酸(RNA、DNA)提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定RNA时cDNA的合成。
要正确使用加样器。
由于在加样操作中可能会发生气溶胶所致的污染，所以应避免在本区内不必要的走动。
可通过在本区内设立正压条件避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。
为避免样本间的交叉污染，加入待测核酸后，必须盖好含反应混合液的反应管。
对具有潜在传染危险性的材料，必须有明确的样本处理和灭活程序。
用过的加样器吸头必须放入专门的消毒(例如含次氯酸钠溶液)容器内。
实验室桌椅表面每次工作后都要清洁，实验材料(原始血标本、血清标本、提取中的标本与试剂的混合液等)如出现外溅，则必须分别处理并作出记录。
对实验台适当的紫外照射(254nm波长，与工作台面近距离)适合于灭活去污染。
可移动紫外线管灯可用来确保工作后对实验台面的充分照射。
样本处理对核酸扩增有很大影响，必须使用有效的核酸提取方法，可在开展临床标本检测前对提取方法进行评价。
用于RNA扩增检测样本制备好以后，应立即进行cDNA合成，因为cDNA链较RNA稳定，保存相对容易。
为保证逆转录反应的需要，应在标本制备区设置一个以上的温育装置。
cDNA合成的理想温度依所使用的酶而定，倾向于使用一步法：即使用在扩增反应缓冲液条件下具有逆转录活性的热稳定的DNA聚合酶进行逆转录，其较cDNA合成后再开盖以调节缓冲液或加入聚合酶进行扩增发生污染的可能性降低。
待测RNA的cDNA拷贝须保存在标本制备区，不得在本区对样本进行PCR扩增。
(三)扩增区下述工作在本区内进行：DNA或cDNA扩增。
此外，已制备的DNA模板和合成的cD NA(来自样本制备区)的加入和主反应混合液(来自试剂贮存和制备区)制备成反应混合液等也可在本区内进行。
在巢式PCR测定中，通常在第一轮扩增后必须打开反应管，因此巢式扩增有较高的污染危险性，第二次加样必须在本区内进行。
不能从本区再进入任何"上游"区域，可降低本区的气压以避免气溶胶从本区漏出。
为避免气溶胶所致的污染，应尽量减少在本区内的走动。
如有加样则应在超净台内进行。
打开预处理过的反应混合液时必须防止液体溅出，尤其是在巢式扩增步骤之间。
一个简单的方法是在打开反应管前快速离心数秒。
可使用体积较小的离心机，因其所占实验台面小，易于用一只手操作，适合于大多数超净台。
防潮屏障如石蜡油或轻矿物油也具有防污染作用，但必须注意的是，矿物油本身也可能成为一种持续性的污染源。
用过的加样器必须注意清洁消毒。
完成操作及每天工作后都必须对实验室台面进行清洁和消毒，紫外照射方法与前面区域相同。
如有溶液溅出，必须处理并作出记录。
(四)扩增产物分析区下述操作在本区内进行：扩增片段的测定。
核酸扩增后产物的分析方法多种多样，如膜上或微孔板上探针杂交方法(同位素标记或非同位素标记)、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、Southern转移、核酸测序方法等。
目前国内的商品试剂盒绝大部分均采用非同位素标记的微孔板上探针杂交方法，即P CR-ELISA方法，也有膜上探针杂交方法。
本区是最主要的扩增产物污染来源，因此必须注意避免通过本区的物品及工作服将扩增产物带出。
在使用 PCR-ELISA方法检测扩增产物时，必须使用洗板机洗板，废液必须收集至1mol/L HC1中，并且不能在实验室内倾倒，而应至远离PCR实验室的地方弃掉。
用过的吸头也必须放至1mol/L HCl中浸泡后再放到垃圾袋中按程序处理，如焚烧。
由于本区有可能会用到某些可致基因突变和有毒物质如溴化乙锭、丙烯酰胺、甲醛或同位素等，故应注意实验人员的安全防护。
本区的清洁消毒和紫外照射方法同前面区域。
本区如采用负压条件或减压情况下(如安装排风扇)可减少扩增产物从本区扩散至前面区域的可能性。
二、临床基因扩增检验实验室质量保证临床基因扩增检验实验室质量保证涉及到整个基因扩增检验的所有阶段，即测定分析前的标本采集处理、测定中的核酸提取、扩增和产物分析以及测定后的结果报告等。
(一)标本的采集;常用于基因扩增检测的临床标本包括EDTA或枸橼酸钠抗凝全血或骨髓、血清或血浆、痰、脑脊液、尿及分泌物等。
采血液等样本时，应使用一次性密闭容器，如真空采血管。
当使用非密闭采样系统时，如尿、分泌物和骨髓的采样，必须注意防止来自采样者的皮屑或分泌物的污染。
采样时必须戴一次性手套。
玻璃器皿在使用前应高压处理，因为玻璃器皿常含有不易失活的RNA酶。
最好是热灭菌，250℃烘烤4小时以上可使RNA酶永久性失活。
全血和骨髓标本必须进行抗凝处理。
EDTA和枸橼酸盐是首选的抗凝剂。
不能使用肝素抗凝，因为肝素是Taq酶的强抑制剂，而且在其后的核酸提取步骤中很难去除。
临床用于RNA(如HCV RNA)扩增检测的血标本建议进行抗凝处理，并尽快(3小时以内)分离血浆，以避免RNA的降解。
如未作抗凝处理，则抽血后，必须在1小时内分离血清。
(二)标本的稳定化处理用于DNA扩增检测的标本，采集后一般不需要特殊的稳定化处理，但标本应及时送至实验室。
由于RNA易受RNA酶的降解，因此用于RNA测定的标本有时必须进行稳定化处理，如流行病学调查的现场采样。
异硫氰酸胍盐(Guanidine thiocyanate,GITC)可使DNA酶和R NA酶立即失活，因此在采集标本时，可将标本材料如血清或血浆按1:4的比例加至含有5m ol/L GITC的试管中，从而使血清(浆)中的RNA酶不可逆失活。
经上述稳定化处理后，标本一般不需要冷藏即可邮寄。
对于特定的检测项目，上述稳定化处理方法的效果究竟如何，要使用相应的逆转录PCR测定方法来评价。
(三)标本的运送标本采集后必须尽快送至实验室。
经过适当稳定化处理的标本可在常温下通过邮寄运送。
如用于DNA扩增检测的EDTA抗凝全血标本及用于RNA扩增检测的经GITC稳定化处理的标本。
通常在运送时，应采用不易破碎的容器装载标本。
用于RNA检测的标本，如果未经稳定化处理，则必须速冻后，放在干冰中运送。
(四)标本的贮存临床体液标本如血清/血浆等可于-70℃下长时间贮存。
用于DNA测定的已纯化核酸样本可在10mmol/LTris-1 mmol/L EDTA缓冲液(pH 7.5-8.0)中4℃保存。
用于RNA测定的已纯化核酸样本应在缓冲液中-80℃或液氮中贮存。
用乙醇沉淀的核酸样本贮存在-20℃即可。
用GITC处理的RN A标本在室温可保存7天。
(五)标本的处理(核酸提取)标本处理即核酸提取纯化是决定扩增检测成败的关键性步骤，在使用商品核酸提取试剂提取临床标本中的核酸模板前，应对其进行充分评价以验证其提取的有效性。
通常，核酸制备质量不高是由于抑制物去除不完全所致，抑制物可能来源于标本本身(如血红素及其前体或降解产物)或核酸提取过程中残留的有机溶剂(如酚、氯仿等)，这些物质对其后的 T aq酶扩增反应步骤具有强烈的抑制作用，从而影响靶核酸的扩增测定。
当标本为痰时，则必须先进行液化处理，再提取核酸。
需注意的是，液化时不能加热，液化时间不能过长。
此外，当靶核酸为RNA时，逆转录PCR测定失败的常见原因是标本在运送前未经充分的稳定化处理及核酸提取试剂的RNA酶的污染。
对于前者，要核查测定分析前的步骤，如果发现有R NA降解的证据，实验室则应拒绝接受标本，要求重新采取标本，并对运送者给以详细的指导。
对于后者，建议使用高质量的商品核酸提取试剂。
(六)靶核酸的逆转录(RT)和扩增1、靶RNA的逆转录cDNA合成为逆转录PCR中的第一个酶反应步骤，所产生的cDNA为靶RNA的反向互补链，为后面扩增的模板。
下述因素通常影响cDNA合成的效率：(1)逆转录效率的降低或完全缺乏。
其可能的原因有逆转录酶质量不高、试剂降解变质或加样错误等;(2)用于逆转录的标本中存在逆转录或Taq酶的抑制物(如酚、氯仿、血红素等);(3)RNA酶的存在导致RNA的降解。