双外流连续培养系统用于瘤胃发酵的体外模拟_技术综述

双外流连续培养系统用于瘤胃

发酵的体外模拟:技术综述

孟庆翔

(中国农业大学动物科技学院,北京100094)

摘要:双外流连续培养系统是目前研究反刍动物瘤胃生理学、发酵生物化学和微生

物学的较为理想的模型。本文综述了有关双外流连续培养系统的结构设计、系统运

行、缓冲液配方和一些基本概念及常用计算等方面的基本知识与进展。

关键词:双外流连续培养系统;瘤胃发酵;消化生理学;瘤胃微生物学

中图分类号:Q 482;S 826文献标识码:A

研究反刍动物瘤胃发酵的最好方法是利用目标动物如牛羊等进行活体内(in vivo )瘤胃发酵试验。但是,由于活体内试验具有周期长、需要动物多、环境条件不易控制、成本高等问题,人们不断探索更为简单、经济、可靠的方法。因此,各种活体外(in vitro )人工瘤胃法应运而生。应用较广、影响较大的有两阶段法(Tille y 和Terr y ,1963)、产气法(Me nke 等,1979)和简单消化法(Goering 和Van Soest ,1970)等。这些方法均属于批次培养法(batch culture ),即微生物接种物和发酵底物一次性加入,经一定时间培养后,在固定时间内结束培养。由于产物抑制、p H 下降等原因,经一定时间培养后批次培养会有微生物的活力下降、组成变化等问题,所以,批次培养不能持续很长时间。由于活体内瘤胃发酵是一种连续培养系统(Hun g ate ,1966),即有底物(饲料)和缓冲液的连续进入和食糜(固相和液相食糜)的连续排出,所以,批次培养不能完全代表活体内瘤胃发酵的全部情况。

活体外连续培养系统(co ntinuous culture s y stem ,CCS )是一种接近于活体内瘤胃发酵的系统,分为单外流(sing le -flow )和双外流(dual -flow )型连续培养两种系统。所谓单外流型CCS 是指消化糜固相和液相均以相同速度外流的系统;而双外流CCS 是将消化糜固相和液相外流速度分别加以控制的系统。在反刍动物体内,瘤胃液相外流速度和固相外流速度是不同的。一般液相外流速度(4%/h ～10%/h )明显高于固相外流速度(2%/h ～7%/h ,Ow ens 和Goetsch ,1988)。因此,双外流型连续培养系统更接近于活体内瘤胃发酵的情况。目前世界上影响最大的双外流连续培养系统是以美国明尼苏达大学(Universit y of M innesota )和西弗基尼亚大学(West Vir g inia Universit y )的系统为基础而设计的各种系统。中国农业大学在国家自然科学基金委的资助下,自行设计了一套双外流连续培养系统,其技术性能指标达到国外同类产品的先进水平,为定量研究瘤胃生理、发酵生物化学和微生物学等提供了一个较为理想的模型。1双外流连续培养系统的结构组成

双外流连续培养系统一般包括5个主要部分:1.发酵培养系统,2.自动喂料系统,3.缓11卷增刊动物营养学报Vol .11,Supple .,45～501999年12月ACTA ZOON UT RIM ENTA SINICA Dec .1999

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冲液输送系统,4.气体导入系统,5.食糜收集系统。发酵培养系统是此CCS的主要系统,主要由发酵罐组成。美国广泛使用的发酵罐一般由玻璃或聚碳酸酯材料制成,体积2L左右,常见规格为100mm(直径)×215mm(高)。罐体上1/3处有一直径为1.9cm的侧臂,用于固相消化糜的溢流(overflow)。罐体上端安装有缓冲液、pH计电极、酸/碱液体、气体(CO2)、饲料等进入的插口。罐内装有电热管、温控探头、酸碱度控制探头、磁力搅拌器转子以及用于区分固相和液相的滤网等。系统使用的缓冲液通过蠕动泵定量输入。饲料通过自动喂料系统定时定量喂给。固相和液相食糜分别定量收集在自动控温(0～4℃)的收集瓶中。

中国农业大学设计的双外流CCS全部采用不锈钢材料制成。除了没有自动喂料系统和酸碱度自动控制系统外,其它系统与美国的设备相似,并在许多方面进行了改进。我们的发酵罐总体积为2.0L,溢流口下部的有效体积为1.76L。该系统共有12个发酵罐。每一罐内搅拌系统采用变速电机(27r/min)驱动2组叶轮的方式完成,并具有电子定时搅拌功能。发酵罐的加热和控温采用集中加热的水浴箱和控温仪等设备来完成。采用300目不锈钢网有效地分离出液相消化糜。液相消化糜的流量由蠕动泵控制。液相和固相消化糜均定量收集在装有自动控温(0～4℃)设备的收集瓶中。系统的总成本相当于美国同类设备的1/10左右。

2系统的准备和运行

无论是国外还是中国农大的双外流CCS,系统的准备和运行程序基本上是一致的。这些程序主要包括:

1.发酵罐的清洗和消毒每次试验结束后,发酵罐需经过加酶洗衣粉浸泡,沸水清洗并晾干,以防止杂菌污染下一批培养。发酵罐顶盖安装有多种辅助装置,清洗时要防止进水,以免轴承生锈。

2.接种和输入缓冲液连续培养所用的接种物多为瘤胃内容物。操作程序大体是:在保温(39℃)和厌氧条件下快速采取瘤胃液和内容物。在CO2饱和和保温条件下,将固相内容物在振荡器中间歇振荡3～5次(每次10～15S,目的是使附着在饲料颗粒上的微生物进入液相),并通过一层纱布过滤。将滤液直接(或与预热至39℃的厌氧缓冲液按2:1或1:1比例)放入已预热并经CO2饱和的发酵罐中,开启搅拌和通气(CO2)装置,并以蠕动泵按设定流量输入缓冲液,39℃下培养。

3.搅拌CCS的搅拌在国外多采用磁力搅拌系统。该设备成本低,搅拌速度快,搅拌效果较好,但搅拌速度往往难以控制,经常在连续运转时会出现磁棒偏离中心而停止搅拌的情况,在填加颗粒饲料时问题尤为突出。在瘤胃中,内容物的搅拌是通过瘤胃有规律的蠕动完成的,且表现出分层性(H ung ate,1966)。中国农大的CCS采用了27r/m in调速电机控制转速,并进行间歇搅拌(通常搅拌25min,停止5m in)。这种设备和程序的运行,使消化糜表现出间歇性分层特性,并达到十分理想的搅拌效果。

4.饲料加入通常在系统接通并运行2小时后开始加入饲料。用于CCS的饲料最好是颗粒饲料。其优点是饲料密度较大,加入后不至于因飘浮于液体表面或粘附于罐壁上而影响消化;另外,颗粒饲料的称量和加入均较粉状饲料方便易行。在国外,采用自动喂料系统时,颗粒饲料的加入通常每一小时或每半小时一次。在国内,我们通常按每4～6小时加一次饲料。

每日饲料干物质的加入量以参考动物瘤胃容积大小和满足维持需要量的50%为宜。饲料