双外流连续培养系统用于瘤胃发酵的体外模拟_技术综述

双外流连续培养系统用于瘤胃
发酵的体外模拟:技术综述
孟庆翔
(中国农业大学动物科技学院,北京100094)
摘要:双外流连续培养系统是目前研究反刍动物瘤胃生理学、发酵生物化学和微生
物学的较为理想的模型。

本文综述了有关双外流连续培养系统的结构设计、系统运
行、缓冲液配方和一些基本概念及常用计算等方面的基本知识与进展。

关键词:双外流连续培养系统;瘤胃发酵;消化生理学;瘤胃微生物学
中图分类号:Q 482;S 826文献标识码:A
研究反刍动物瘤胃发酵的最好方法是利用目标动物如牛羊等进行活体内(in vivo )瘤胃发酵试验。

但是,由于活体内试验具有周期长、需要动物多、环境条件不易控制、成本高等问题,人们不断探索更为简单、经济、可靠的方法。

因此,各种活体外(in vitro )人工瘤胃法应运而生。

应用较广、影响较大的有两阶段法(Tille y 和Terr y ,1963)、产气法(Me nke 等,1979)和简单消化法(Goering 和Van Soest ,1970)等。

这些方法均属于批次培养法(batch culture ),即微生物接种物和发酵底物一次性加入,经一定时间培养后,在固定时间内结束培养。

由于产物抑制、p H 下降等原因,经一定时间培养后批次培养会有微生物的活力下降、组成变化等问题,所以,批次培养不能持续很长时间。

由于活体内瘤胃发酵是一种连续培养系统(Hun g ate ,1966),即有底物(饲料)和缓冲液的连续进入和食糜(固相和液相食糜)的连续排出,所以,批次培养不能完全代表活体内瘤胃发酵的全部情况。

活体外连续培养系统(co ntinuous culture s y stem ,CCS )是一种接近于活体内瘤胃发酵的系统,分为单外流(sing le -flow )和双外流(dual -flow )型连续培养两种系统。

所谓单外流型CCS 是指消化糜固相和液相均以相同速度外流的系统;而双外流CCS 是将消化糜固相和液相外流速度分别加以控制的系统。

在反刍动物体内,瘤胃液相外流速度和固相外流速度是不同的。

一般液相外流速度(4%/h ～10%/h )明显高于固相外流速度(2%/h ～7%/h ,Ow ens 和Goetsch ,1988)。

因此,双外流型连续培养系统更接近于活体内瘤胃发酵的情况。

目前世界上影响最大的双外流连续培养系统是以美国明尼苏达大学(Universit y of M innesota )和西弗基尼亚大学(West Vir g inia Universit y )的系统为基础而设计的各种系统。

中国农业大学在国家自然科学基金委的资助下,自行设计了一套双外流连续培养系统,其技术性能指标达到国外同类产品的先进水平,为定量研究瘤胃生理、发酵生物化学和微生物学等提供了一个较为理想的模型。

1双外流连续培养系统的结构组成
双外流连续培养系统一般包括5个主要部分:1.发酵培养系统,2.自动喂料系统,3.缓11卷增刊动物营养学报Vol .11,Supple .,45～501999年12月ACTA ZOON UT RIM ENTA SINICA Dec .1999
46动物营养学报第11卷
冲液输送系统,4.气体导入系统,5.食糜收集系统。

发酵培养系统是此CCS的主要系统,主要由发酵罐组成。

美国广泛使用的发酵罐一般由玻璃或聚碳酸酯材料制成,体积2L左右,常见规格为100mm(直径)×215mm(高)。

罐体上1/3处有一直径为1.9cm的侧臂,用于固相消化糜的溢流(overflow)。

罐体上端安装有缓冲液、pH计电极、酸/碱液体、气体(CO2)、饲料等进入的插口。

罐内装有电热管、温控探头、酸碱度控制探头、磁力搅拌器转子以及用于区分固相和液相的滤网等。

系统使用的缓冲液通过蠕动泵定量输入。

饲料通过自动喂料系统定时定量喂给。

固相和液相食糜分别定量收集在自动控温(0～4℃)的收集瓶中。

中国农业大学设计的双外流CCS全部采用不锈钢材料制成。

除了没有自动喂料系统和酸碱度自动控制系统外,其它系统与美国的设备相似,并在许多方面进行了改进。

我们的发酵罐总体积为2.0L,溢流口下部的有效体积为1.76L。

该系统共有12个发酵罐。

每一罐内搅拌系统采用变速电机(27r/min)驱动2组叶轮的方式完成,并具有电子定时搅拌功能。

发酵罐的加热和控温采用集中加热的水浴箱和控温仪等设备来完成。

采用300目不锈钢网有效地分离出液相消化糜。

液相消化糜的流量由蠕动泵控制。

液相和固相消化糜均定量收集在装有自动控温(0～4℃)设备的收集瓶中。

系统的总成本相当于美国同类设备的1/10左右。

2系统的准备和运行
无论是国外还是中国农大的双外流CCS,系统的准备和运行程序基本上是一致的。

这些程序主要包括:
1.发酵罐的清洗和消毒每次试验结束后,发酵罐需经过加酶洗衣粉浸泡,沸水清洗并晾干,以防止杂菌污染下一批培养。

发酵罐顶盖安装有多种辅助装置,清洗时要防止进水,以免轴承生锈。

2.接种和输入缓冲液连续培养所用的接种物多为瘤胃内容物。

操作程序大体是:在保温(39℃)和厌氧条件下快速采取瘤胃液和内容物。

在CO2饱和和保温条件下,将固相内容物在振荡器中间歇振荡3～5次(每次10～15S,目的是使附着在饲料颗粒上的微生物进入液相),并通过一层纱布过滤。

将滤液直接(或与预热至39℃的厌氧缓冲液按2:1或1:1比例)放入已预热并经CO2饱和的发酵罐中,开启搅拌和通气(CO2)装置,并以蠕动泵按设定流量输入缓冲液,39℃下培养。

3.搅拌CCS的搅拌在国外多采用磁力搅拌系统。

该设备成本低,搅拌速度快,搅拌效果较好,但搅拌速度往往难以控制,经常在连续运转时会出现磁棒偏离中心而停止搅拌的情况,在填加颗粒饲料时问题尤为突出。

在瘤胃中,内容物的搅拌是通过瘤胃有规律的蠕动完成的,且表现出分层性(H ung ate,1966)。

中国农大的CCS采用了27r/m in调速电机控制转速,并进行间歇搅拌(通常搅拌25min,停止5m in)。

这种设备和程序的运行,使消化糜表现出间歇性分层特性,并达到十分理想的搅拌效果。

4.饲料加入通常在系统接通并运行2小时后开始加入饲料。

用于CCS的饲料最好是颗粒饲料。

其优点是饲料密度较大,加入后不至于因飘浮于液体表面或粘附于罐壁上而影响消化;另外,颗粒饲料的称量和加入均较粉状饲料方便易行。

在国外,采用自动喂料系统时,颗粒饲料的加入通常每一小时或每半小时一次。

在国内,我们通常按每4～6小时加一次饲料。

每日饲料干物质的加入量以参考动物瘤胃容积大小和满足维持需要量的50%为宜。

饲料
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加入量不宜过大的原因是,在连续培养系统中饲料发酵产生的有机酸(主要为乙、丙、丁、戊、异戊和异丁酸)不能象在活体内那样被瘤胃壁所吸收,因而会造成消化糜不规律性pH下降和渗透压升高问题。

在实践中,每日饲料干物质加入量通常按占发酵罐有效容积的4%～6%计算。

5.样本收集期和样本收集进行瘤胃发酵研究时所要测定的指标通常包括消化率、发酵参数(pH、氨态氮浓度、V FA等)、微生物(细菌、原虫、真菌等)计数、微生物蛋白质合成效率(每千克可发酵有机物或可消化碳水化合物合成微生物氮的克数)、消化酶活性等。

而这些指标的准确测定都有赖于瘤胃发酵达到稳定状态(stable state)时才能时行。

CCS在达到稳定状态前的时间称为适应期(ada p tational p e rio d)。

CCS的微生物发酵达到稳定状态前的适应期长短与稀释率和流通速度有直接关系。

据孟庆翔等(1998,1999)的试验,发酵液周转(turnover)达到4次以上时,微生物发酵一般可达到稳定状态。

在一般稀释率条件下,连续培养的适应期为7天,采样期为3天。

用于发酵参数测定的样本直接取自发酵罐,而其它样本采自流出发酵罐的食糜。

在样本采集后用于发酵参数测定的样本要立即测定pH;按5:1比例加入25%偏磷酸用于测定VFA 和直接冰冻样测定氨浓度。

测定消化率和微生物蛋白质合成效率的样本需要按2.5%比例加入37%甲醛,然后于4℃下保存。

用于微生物计数的样本需用甲醛生理盐水固定后保存。

所有用于测定消化率和微生物蛋白质合成效率的样本,均需进行冻干处理。

3缓冲液配方
在进行双外流连续培养系统操作时,缓冲液的选择是非常重要的内容。

当使用不同精料类型的日粮进行试验时,为了控制发酵p H的相对恒定,需要选用不同的缓冲液。

3.1常用缓冲液配方
(1)配方它是改进的M cDou g all缓冲液(S l y ter,1990),由60%M cDou g all浓缩缓冲液和40%自来水组成,其中含有尿素和半胱氨酸盐酸盐(Meng等,1999)。

在此配方中,尿素的作用类似于活体内的内源氮;而半胱氨酸盐酸盐的作用是降低缓冲液的氧化还原电位。

A.标准缓冲液组分g/L(5倍浓缩液,以蒸馏水配制)
NaHCO349.0
Na2HPO418.5
B.矿物盐溶液g/L(100倍浓缩液,以蒸馏水配制)
NaCl47.0
KCl57.0
M gCl2·6H2O12.8
CaCl2·2H2O5.3
C.尿素溶液尿素250.0(g/L)
D.半胱氨酸盐酸盐以结晶形式添加,用量占缓冲液的0.025%(W/V)。

(2)配制程序CCS中缓冲液需要量大,通常以按20L为一配制单位。

取标准缓冲液A 2400m l加入到25L容器中,加入17435m l自来水,然后加入矿物盐溶液B120ml、尿素溶液C 40ml,搅拌均匀并以无氧CO2饱和,使用前加入结晶半胱氨酸盐酸盐5g备用。

此溶液配制后
48动物营养学报第11卷有轻微浑浊,但经CO2饱和后会变为澄清。

3.2高缓冲容量缓冲液配方
在高精料饲粮情况下,以双外流连续培养系统模拟瘤胃发酵时,由于产生有机酸造成p H 下降,常规缓冲液配方的使用往往具有很大的局限性。

这时需使用改进的高缓冲容量缓冲液配方,而矿物盐溶液、尿素溶液和半胱氨酸盐酸盐配方与添加量不变。

(1)用于高精料和淀粉型纯合饲粮情况的3个缓冲液配方(g/L,5倍浓缩液):
a.NaHCO324.5
KHCO329.0
NaH2PO49.0
KH2PO410.2
b.NaH2PO4·H2O49.4
KH2PO456.0
c.Na2CO331.0
K2CO340.2
N a2H PO49.2
K2HPO411.3
(2)用于全精料饲粮的情况超高缓冲容量配方(g/L,5倍浓缩液):
Na2CO331.0
K2CO340.2
Na3PO4·12H2O24.7
K3PO413.8
4有关计算
4.1固、液相稀释率(dilution rate)的计算
稀释率是指单位时间内瘤胃或发酵罐容积被固相或液相消化糜所替代的比例,即固相或液相消化糜的流速与瘤胃或发酵罐容积之比,结果常以%/h表示,如15%/h等,也可以表示为0.15/h。

在连续培养系统中,固相外流速度是指通过溢流口流出发酵罐的发酵液流速与发酵罐体积之比,而液相外流速度是进入发酵罐的缓冲液流速与发酵罐体积之比。

固相稀释率的倒数即为固相存留时间。

例如,固相稀释率为5%/h,则固相存留时间为1/0.05=20(h)。

瘤胃翻转率或替代率为每日或每小时替代发酵罐或瘤胃体积的次数,如发酵罐有效体积为1L,液相稀释率为0.1/h,则每日替代率为0.1×24h=2.4(turnov er/d)。

(1)液相稀释率(li q uid dilutio n rate,LDR)
LDR(%/h)=[进入发酵罐的缓冲液流速(ml/h)/发酵罐体积(ml)]×100
=狖[流过滤网的液相流速(m l/h)+流出溢流口的固相流速(m l/h)]/发酵罐体积(ml)狚×100如发酵罐体积为1000m l,为获得10%/h的LDR,则:
0.1×1000m l=100(m l/h),100/60=1.67(ml/min)
即将输入缓冲液的蠕动泵流速精确设定为1.67m l/min即可。

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(2)固相外流速度(solid dilutio n rate,SDR)
当发酵罐体积为1000m l时,为获得4%/h的SDR,则通过溢流口的固相流速为:
0.04×1000=40(m l/h);或通过滤网的液相流速为0.06×l000=60(ml/h)或60/60=1(m l/min)。

在实际操作中,将流过滤网的液相蠕动泵流速设定为1m l/min即可。

4.2干物质(DM)或有机物质(OM)消化率(D)的计算
本文以有机物质消化率(OM D)的计算为例,列举有关计算公式。

表观OM D(%)=狖[饲料OM(g)-流出物OM(g)+缓冲液OM(g)]/饲料OM(g)狚×100真OM D(%)=狖[饲料OM(g)-流出物OM(g)+缓冲液OM(g)+微生物OM(g)]/
饲料OM(g)狚×100
4.3微生物蛋白质合成效率(MOEFF)计算
M OEFF=流出物OM中微生物N(g)/真消化饲料OM(g)
其中,微生物N测定采用嘌呤法测定。

有关微生物N计算公式为:
流出物干物质(DM)中微生物N(g)=流出物总N量(g)×流出物总N中微生物N(%)流出物总N中微生物N(%)=狖[流出物DM中嘌呤(m g)/流出物DM中总N(g)]
/[微生物DM中嘌呤(m g)/微生物DM中含总N(g)]狚×100 [流出物DM中嘌呤(m g)/流出物DM中总N(g)]
=[流出物DM中嘌呤(m g)/流出物DM(g)]/流出物DM含N量(%) [微生物DM中嘌呤(m g)/微生物DM中总N(g)]
=[微生物DM中嘌呤(m g)/微生物DM(g)]/微生物DM含N量(%) 5双外流连续培养系统用于模拟瘤胃发酵的效果评价
评价双外流连续培养系统往往从消化率、发酵参数和微生物数量等方面与活体内结果进行比较。

国外在此方面已进行了许多工作。

一般来说,当日粮相同的情况下,CCS的营养物质消化率和发酵参数等与活体内结果十分接近,但CCS的原虫数量往往较低。

在一些试验中, CCS的总VFA数量高于活体内结果,这可能与CCS不存在类似活体内瘤胃壁的VFA吸收有关。

CCS考虑了类似于瘤胃发酵过程的固液相外流、蠕动、饲料定时摄入、唾液有规律分泌以及发酵产物的持续排出等一些重要生理因素的作用,在瘤胃发酵模拟方面无疑具有明显的优越性,可以作为目前人们研究瘤胃发酵及相关生理、生化和微生物学研究的较理想模型。

但是,无论如何,CCS终究是一种活体外方法,其测定结果的实践应用,仍需活体内试验结果的验证。

6结论
双外流连续培养系统可以作为模拟和研究反刍动物瘤胃生理学、发酵生物化学、微生物学和营养学等的较为理想的模型。

由于双外流连续培养系统在结构和功能设计上考虑了饲料及缓冲液的连续注入、发酵产物的连续排出、固相和液相消化糜流速定量控制、定时匀速搅拌,以及厌氧和控温等诸多生理因素的影响,它在模拟瘤胃发酵方面具有任何单外流连续培养系统和批次培养系统所不可比拟的优越性。

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参考文献
孟庆翔,高仲元,M S Kerley,R L Belyea.1999.稀释率对于活体外瘤胃发酵和微生物生长效率的影响.动物营养学报,11:10～16
孟庆翔,M S Kerley.1998.瘤胃稀释率对蛋白质发酵和微生物生长效率的影响.中国农业科学,31:72～78 Goerin g H K,P J Van Soest.1970.Fora g e Fiber Anal y ese(A pp aratus,Rea g ents,Procedures,and Some
A pp lications).A g ric.H andbook No.379.A RS-USDA,Washinton,DC
Hun g ate R E.1966.The Rumen and its Microbes.Academic Press.New York
Meng Q M,S Kerley,P A Ludden,R L Belyea.1999.Fermentation substrate and dilution rate interact to affect microbial grow th and efficiency.J Anim.Sci.,77:206～214
Menke K H,L Raab,A S alew ski,H Steingass,D Fritz,W S chneider.1979.The estim ation of digestibility and m etabolizable ener gy content of ruminent feedstuf fs f rom g as p roduction when the y are incubated w ith rum en li q uor in vitro.J A g r ic Sci.,193:217～225
Owens F N,A L Goetch.1988.Ruminal Fermentation.in T he Ruminant Animal Di g estive Ph y siolo gy and Nut rition.D C C hurch(Ed.).Prentice H all.New Jersey.P.145～171.
Sly ter L L.1990.Fermentation Frustration.1990.Meeting of the Northeast ADSA-ASAS.W H Miner Agric.Res.Inst.July8.P.1～13.
Stern M D,M I E ndres.1991.The Dual Flow Con tinuous Culture S y etem.in Laborator y Manual:Reseach Techni q ues in Ruminant Nut rition.U niversit y of Minnesota,P.121～136
Tille y J M S,R A Terr y.1963.A tw o-sta g e techni q ue for the in vitro di g estion of g ora g e cro p s.J Br it.
Grassl Soc.,18:104～111.
USE OF A DUAL-FLOW CONTINUOUS CULTURE SYSTEM FOR SIMULATING RUMINAL FERMENTATION IN VITRO:A TECHNICAL REVIEW
MENG Q in g-xian g
(Col le g e o f Anim al S cience and Technolo gy,China A g r icu ltural U niversi t y,
Bei j in g,100094,Ch ina)
ABSTRACT
A dual-flo w co ntinuo us culture s y stem p rovides a relativel y ideal m odel fo r sim ula tin g rumen fermentatio n,includin g p h y siolo gy,biochemistr y and microbiolo gy.The structure de-sig n,sy stem operatio n,artificial siliv a form ulation,and gene ral calculation concerning run o f the continuous culture sy stem we re presented in this paper.
Ke y words:dual-flow continuous culture s y stem;ruminal fermentatio n;di g estive p h y sio lo gy;ruminal microbio lo gy。