喀斯特石漠化区植被恢复不同阶段土壤真菌群落组成分析

生态环境学报 2019, 28(4): 669-675 Ecology and Environmental Sciences E-mail: editor@基金项目：“十三五”国家重点研发计划课题（2016YFC0502604）作者简介：刘雯雯（1994年生），女，硕士研究生，主要研究方向为恢复生态学。

E-mail: 719602115@*通信作者：喻理飞（1963年生），教授，博士研究生导师，从事喀斯特退化生态系统植被恢复研究。

E-mail: gdyulifei@收稿日期：2018-12-27喀斯特石漠化区植被恢复不同阶段土壤真菌群落组成分析刘雯雯1，喻理飞1, 2*，严令斌1，刘娜1，赵庆11. 贵州大学生命科学学院/农业生物工程研究院，贵州 贵阳 550025；2. 山地植物资源保护与种质创新教育部重点实验室/山地生态与农业生物工程协同创新中心，贵州 贵阳 550025摘要：为阐明西南喀斯特石漠化区植被恢复过程土壤真菌群落组成及优势关键类群，采集乔林、灌木林、灌草和草本群落4种不同植被恢复阶段不同小生境中（石面、石沟、石缝）的表层土壤，提取其DNA ，利用 Illumina HiSeq 平台对真菌ITS 区扩增进行高通量测序后注释鉴定，开展植被恢复不同阶段真菌群落组成结构分析。

结果表明，36个土壤样品中共获得2437541条有效序列，每个样品获得35911条有效序列，OTU 数目为5437，包含5个门、626个属。

乔林、灌木林阶段土壤真菌群落组成相近，由未分类真菌、Geminibasidium 、被孢霉属Mortierella 、蜡壳耳属Sebacina 、青霉属Penicillium 、子囊菌门Ascomycota 未定属等组成，其中木霉属Trichoderma （LDA=4.11）、青霉属（LDA=4.35）、小蔓毛壳科Herpotrichiellaceae （LDA=4.00）、革菌科Thelephoraceae （LDA=4.10）、未分类真菌（LDA=4.86）为该类型的关键优势真菌类群。

灌草过渡阶段与草本群落阶段各成一种类型，灌草过渡阶段包括蜡壳耳属、Geminibasidium 、被孢霉属等，其中，蜡壳耳属（LDA=5.30）、Geminibasidium （LDA=4.77）、煤炱目Capnodiales （LDA=4.15）、格孢菌目Pleosporales 未定属（LDA=4.28）为该类型的关键优势真菌类群。

草本群落阶段由未分类真菌、镰刀菌属Fusarium 、子囊菌门、被孢霉属、Archaeorhizomyces 等组成，镰刀菌属（LDA=4.78）、Archeaorhizomyces （LDA=4.48）、支顶孢属（LDA=4.22）、肉座菌科（LDA=4.54）、子囊菌门未定属（LDA=4.63）为该类型的关键优势真菌类群。

关键词：喀斯特；植被恢复阶段；土壤真菌；组成结构；高通量分析 DOI: 10.16258/ki.1674-5906.2019.04.004中图分类号：Q948; X171.1 文献标志码：A 文章编号：1674-5906（2019）04-0669-07引用格式：刘雯雯, 喻理飞, 严令斌, 刘娜, 赵庆, 2019. 喀斯特石漠化区植被恢复不同阶段土壤真菌群落组成分析[J]. 生态环境学报, 28(4): 669-675.LIU Wenwen, YU Lifei, YAN Lingbin, LIU Na, ZHAO Qing, 2019. Composition of soil fungi communities in different stages of vegetation restoration in Karst rocky desertification area [J]. Ecology and Environmental Sciences, 28(4): 669-675.以贵州为中心的西南地区是喀斯特连续分布最典型的区域（盛茂银等，2013），具有高度异质性和脆弱性，易发生石漠化。

植被退化是石漠化发展的重要原因和标志，退化喀斯特植被自然恢复一般有六个恢复阶段，即草本群落阶段、灌草过渡阶段、灌木灌丛阶段、灌乔过渡阶段、乔林阶段和顶极群落阶段（喻理飞等，2002），不同植被下小生境土壤分布及其理化性质、土壤微生物存在差异（廖洪凯等，2013；廖洪凯等，2012；刘方等，2008），且与植被特征相关（Sayer et al.，2017）。

高通量测序是研究微生物群落组成的一种可靠且有效的方法（Bengtsson-Palme et al.，2013）。

内转录间隔区（Internal transcribed spacer ，ITS ）扩增子测序是研究环境微生物多样性及群落组成差异的重要技术手段之一，已被广泛应用于真菌分类鉴定中（Bachy et al.，2013；Magoč et al.，2011）。

喀斯特区不同退化阶段土壤微生物类群数量、微生物群落功能多样性（胡芳等，2018；梁月明等，2010；宋敏等，2013；谭秋锦等，2014）等已有报道。

真菌群落被正式描述的群落不到10%，未确定的分类信息高。

本研究采用高通量测序、ITS 扩增子测序技术对喀斯特区植被恢复不同阶段小生境土壤真菌进行种类鉴定与分析，阐明退化喀斯特植被恢复过程土壤真菌群落组成及优势关键类群，对深入认识喀斯特石漠化区植被恢复过程中土壤微生物作用具有重要意义。

1 材料与方法1.1 研究区域概况贵州省安顺市镇宁布依族苗族自治县大山镇670 生态环境学报第28卷第4期（2019年4月）位于贵州省西南部珠江水系与长江水系分水岭之间（东经105°35′－106°1′，北纬25°25′－26°11′）。

海拔356－1678 m，岩溶地貌分布广，占全县面积60%以上；属北亚热带季风湿润气候，全年气候温和，雨量充沛；年平均气温16.2 ℃，年平均日照时数为1142 h，年平均降水量1277 mm。

研究区森林于1958－1960年被采伐后，植被逐渐恢复，因存在不同干扰，研究区内出现草本群落阶段、灌草过渡阶段、灌木林阶段和乔林阶段群落，植被下发育有典型的石面、石沟、石缝等小生境。

乔林阶段以化香（Platycarya strobilacea）、黄连木（Pistacia chinensis）、海金子（Pittosporum illicioides）、朴树（Celtis sinensis）为优势种，灌木林主要有化香（Platycarya strobilacea）、针齿铁仔（Myrsine semiserrata），灌草过渡阶段主要有化香（Platycarya strobilacea）、异叶鼠李（Rhamnus heterophylla）、安顺润楠（Machilus cavaleriei），草本群落阶段主要有白茅（Imperata cylindrica）、地果（Ficus tikoua）、沿阶草（Ophiopogon bodinieri）、荩草（Arthraxon hispidus）。

区域内岩石裸露率为10%－60%，成土母岩为石灰岩，土壤为石灰土，土壤pH 介于6.9－7.9之间。

1.2 方法1.2.1 样品采集在典型的乔林阶段（F）、灌木林阶段（S）、灌草过渡阶段（B）、草本群落阶段（G）4个不同恢复阶段分别设置样地，在乔林阶段设置20 m×20 m样地，灌木林阶段样地、灌草过渡阶段设置4 m×10 m样地，草本群落阶段样地为2 m×5 m，每个阶段设置3个样地，共12个。

每个样地内分别在石面（U）、石沟（D）、石缝（C）3种小生境内采集0－10 cm表层土壤样品，共36个。

每个土样除去石块和动植物残体，混合均匀后，装于密封袋中并编号，立刻放入液氮罐中速冻，带回实验室放入−70 ℃冰箱中保存，用于DNA提取。

样品保存在干冰中送上海美吉生物医药科技有限公司进行高通量测序。

1.2.2 DNA抽提和PCR扩增根据土壤DNA提取试剂盒（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）说明书进行总DNA抽提，DNA浓度和纯度利用NanoDrop 2000进行检测，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量；选用引物ITS1F：CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA；ITS2R：GCTGCGTTCTTCATCGATGC进行PCR 扩增。

使用ABI GeneAmp® 9700型的PCR仪，扩增体系为20 μL，2 μL 10×FastPfu缓冲液，2 μL 2.5 mmol∙L−1 dNTPs，0.8 μL引物（5 μM），0.2 μL rTaq聚合酶；10 ng DNA模板。

扩增程序为：95 ℃预变性3 min，35个循环（95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），最后72 ℃延伸10 min。

PCR产物利用IlluminaMiseq PE 300平台进行测序。

1.2.3 OTU聚类和注释根据Barcode序列和PCR扩增引物序列从下机数据中拆分出各样品数据，截去Barcode和引物序列后使用FLASH（Su et al.，2012）对每个样品的Reads进行拼接，得到原始Tags数据；参照QIIME 的Tags质量控制流程，经过Tags截取、过滤及嵌合体去除等处理后得到高质量的有效Tags数据。

利用UPARSE软件，按照97%的相似度将序列聚类为OTUs（Operational Taxonomic Units），使用UCHIME 软件剔除嵌合体。

利用RDP classifier对每条序列进行物种分类注释。

1.2.4 统计分析利用R语言vegan包根据丰度排名前50的类群绘制热图，从物种和样品两个层面进行聚类，分析各植被恢复阶段的优势真菌类群。

通过LEfSe （LDA Effect Size）系统分析植被不同恢复阶段具有显著差异的物种。

2 结果与分析2.1 测序结果样本的物种多样性随测序量的变化情况可由Shanon-Winner指数曲线反映，如图1所示，曲线趋向平坦且文库覆盖率高于0.99，说明测序数据量足够大，足以全面反映样本中的微生物信息。

36个土壤样品通过高通量测序及分析共获得2437541条有效序列（表1），每个样品获得35911条有效序列，OTU数目为5437，分属于6个门、31个纲、106个目、244个科及626个属。

图1Shanon-Winner指数曲线Fig. 1 Shannon-Winner index curvesF: Forest; S: Shrubland; B: Brushwood; G: Grassland刘雯雯等：喀斯特石漠化区植被恢复不同阶段土壤真菌群落组成分析 671 2.2 土壤真菌群落组成2.2.1 门分类水平上组成喀斯特植被下土壤真菌群落在门分类水平上主要由4类真菌组成，分别为子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、接合菌门（Zygomycota）和未分类真菌（Others/Unclassified fungi），占比分别为53.39%、25.08%、6.91%、14.20%，其中子囊菌门高于30%，为优势菌群，担子菌门与接合菌门占比不高但在所有样品中均有出现，为常见菌群。