人二倍体细胞

人二倍体细胞（2BS株）生产终末细胞特异性病毒检测

对人二倍体细胞（2BS株）生产终末细胞进行外源性特异性病毒检测。方法运用实时荧光PCR法检测人二倍体细胞（2BS株）的生产终末细胞的细胞样本—细胞裂解上清液的人鼻咽癌病毒、人巨细胞病毒、人逆转录病毒（HIV）、人乙型肝炎病毒、人丙型肝炎病毒、人乳头瘤病毒、腺病毒及人单纯疱疹病毒核酸。结果人二倍体细胞（2BS株）生产终末细胞的细胞样本中未检测到8种外源性特异性病毒核酸。结论人二倍体细胞（2BS株）生产终末细胞的细胞样本的外源性特异性病毒检测项目合格。

《中国药典》（2010年版三部）收载的《生物制品生产检定用动物细胞基质制备及检定规程》首次规定：每次从主细胞库建立一个新的工作细胞库，该工作细胞库的生产终末细胞需进行外源性种属特异性病毒检测[1]。对特殊外源病毒因子检测的技术方法没有做明确规定，只是提及“可采用适当的体外检测技术”。本研究为运用实时荧光PCR法对人二倍体细胞（2BS株）的生产终末细胞的细胞样本—细胞裂解上清液进行8种特异性病毒包括人鼻咽癌病毒、人巨细胞病毒、人逆转录病毒（HIV）、人乙型肝炎病毒、人丙型肝炎病毒、人乳头瘤病毒、腺病毒及人单纯疱疹病毒核酸检测。结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要设备二级生物安全柜、实时荧光PCR仪、核酸提取仪等由四川省疾病预防控制中

心微生物检验所提供。所有实验用仪器、设备、耗材均在其验证、校验及使用有效期内使用。

1.1.2 试剂核酸提取试剂和8种人种属特异性病毒核酸检测试剂分别购自Promeaga公司和上海之江生物科技有限公司。所有试剂均在其有效期内使用。

1.1.3细胞样本人二倍体细胞（2BS株）的生产终末细胞的细胞裂解上清液，来源于成都生物制品研究所病毒性疫苗二室。

1.2 试验方法及步骤样本及对照品的核酸裂解处理、试剂配制、加样、PCR扩增、阈值设定、校准程序、质量控制、试验结果的判断及参考值范围均参照试剂盒说明书进行。

2 结果

2.1 试剂阳性标准品核酸扩增结果以乙型肝炎核酸检测为例，使用试剂盒中不同浓度乙型肝炎病毒DNA标准品扩增，扩增曲线显示随着DNA含量降低，曲线Ct值增大，检测灵敏度

为5×103 IU/ml，达到试剂盒要求(图1).

注：ⅠHBA DNA 标准品5×106 IU/ml，ⅡHBA DNA 标准品5×105 IU/ml，ⅢHBA DNA 标准品5×104 IU/ml，ⅣHBA DNA 标准品5×103 IU/ml，Ⅴ阴性

图1 乙型肝炎病毒DNA标准品核酸扩增曲线

2.2 样本核酸检测结果细胞样本的8种种属特异性病毒核酸检测结果均无特异性扩增曲线，即未检测到种属特异性病毒核酸(表1)。

表1 细胞样本的核酸检测结果

检测项目检测结果

人鼻咽癌病毒阴性

人巨细胞病毒阴性

人逆转录病毒（HIV）阴性

人乙型肝炎病毒阴性

人丙型肝炎病毒阴性

人乳头瘤病毒阴性

腺病毒阴性

人单纯疱疹病毒阴性

3 讨论

人二倍体细胞（2BS株）常被用来作为病毒性疫苗的生产用细胞，是病毒性疫苗生产所需的重要生物材料，同时又是疫苗生产用毒种和细胞的病毒外源因子检测用细胞。而人二倍体细胞（2BS株）的制备和贮存过程中易受各种外源因子污染，势必给病毒性疫苗的质量带来极大的安全风险。因此，加强人二倍体细胞（2BS株）的质量控制，尤其对人二倍体细胞（2BS 株）的外源性病毒因子的严格控制，对于提高和保证病毒性疫苗质量的安全性、稳定性和有效性具有重要意义。

《中国药典》（2010年版三部）规定：人源的细胞系/株，应检测如人鼻咽癌病毒、人巨细胞病毒、人逆转录病毒、人乙型肝炎病毒、人丙型肝炎病毒、人乳头瘤病毒、腺病毒及人单纯疱疹病毒，但对检测技术方法没有做明确规定[1]。因此，探索了应用实时荧光PCR检测上述特异性病毒，通过乙肝病毒DNA定量检测实验，灵敏度为5×103 IU/ml，达到试剂说明书要求，说明实时荧光PCR用于乙肝病毒核酸检测是可行的。实时荧光PCR检测技术是近年发展起来的分子生物学诊断技术,已广泛应用于病毒核酸检测[2-6]，与传统检测方法比较，具有特异性强、灵敏度高、线性关系好且线性范围宽、操作安全、简便、自动化程度高、能有效控制污染、样本需求量小及检测结果直观等优点，能保证检测的准确性和可靠性，可以推广应用于人二倍体细胞（2BS株）的生产终末细胞的特殊外源病毒因子（即外源性特异性病毒）的检测。

本试验过程中，为了保证检测结果的可靠性，减小因检测操作因素带来的误差，均设立阴性对照和阳性对照。当阴性对照无特异性扩增曲线，阳性对照有特异性扩增曲线时，则该检测试验成立，进而若细胞样本无特异性扩增曲线，则该细胞样本未检出此特异性病毒，即核酸检测结果为阴性。

本试验的细胞样本—细胞裂解上清液未检测到8种外源病毒因子核酸，提示人二倍体细胞（2BS株）生产终末细胞的细胞样本的种属特异性病毒检测合格。