赤芍中赤芍总苷的提取与纯化

赤芍中赤芍总苷的提取与纯化

一、项目概述：

赤芍为毛莨科植物芍药(Paeonia lactiflora Pall．)或川赤芍(Paeonia veitchii Lynch)的干燥根，赤芍总苷(totalpaeony glycoside，TPG)是其主要活性成分，主要包括芍药苷、芍药内酯苷、羟基芍药苷、苯甲酰芍药苷等单萜类化合物，其中芍药苷、芍药内酯苷含量较高。现代药理研究表明，赤芍总苷具有广泛的药理作用，主要表现在抑制血小板聚集、抗凝血、抗血栓、抗动脉粥样硬化等作用。本实验采用高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)法对工艺过程中芍药苷、芍药内酯苷的含量同时进行测定，对赤芍的提取纯化工艺进行考察，进而为进一步控制赤芍总苷的质量提供实验依据。

二、实验目的：

1.掌握赤芍总苷的提取分离工艺；

2.掌握高效液相色谱仪的使用原理及操作方法；

3.掌握大孔吸附树脂分离的原理及操作方法。

三、实验器材

(一)仪器

高效液相色谱仪，玻璃柱，旋转蒸发仪，真空干燥器、电子分析天平，高效液相色谱仪，旋转蒸发仪，超声仪1000ml圆底烧瓶，冷凝管，烧杯、铁架台，橡胶软管、HPLC、容量瓶

(二)试剂

大孔吸附树脂D10l, AB-8；分析纯；95％乙醇、70％乙醇、30％乙醇、芍药苷对照品、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、甲酸、5％香草醛硫酸溶液、0.05mol/L 磷酸二氢钾溶液、硅胶G；赤芍药材粉末（川芍），柱层析硅胶，正丁醇，2%乙酸铅，盐酸，淀粉，碘滴定液，蒸馏水

四、实验内容：

（一）赤芍药材的质量检查

根据《中华人民共和国药典》2015年版一部赤芍项下的项目对赤芍药材进行

质量检查。

1.性状

本品呈圆柱形，稍弯曲，长5—40cm，直径0.5—3cm。表面棕褐色，粗糙，有纵沟和皱纹，并有须根痕和横长的皮孔样突起，有的外皮易脱落。质硬而脆，易折断，断面粉白色或粉红色，皮部窄，木部放

射线纹理明显，有的有裂隙，气微香，味微苦，酸涩。

2.鉴别

1）本品横切面：木栓层为数列棕色细胞。栓内层薄壁细胞切向延长。韧皮部较窄，形成层成环，木质部射线较宽，导管群作放射状排列，导

管旁有木纤维。薄壁细胞含草酸钙簇晶，并含淀粉粒。

2）取本品粉末0.5g，加乙醇10ml，振摇5分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙

醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取芍药苷对照品，加乙醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述两种溶液各4µl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40：5：10：0.2）

为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色

清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝紫色

斑点。

3.检查

1）水分：按《中国药典》2015年版项下操作,取本品粉末约1g,平铺于恒重

的扁形称量瓶中,厚度<5mm,精密称定,打开瓶盖100~105℃烘5小时,盖好,移至

干燥器中冷却30分钟,精密称定,同样温度下在烘1小时移至干燥器中冷却30分钟,精密称定。直至连续两次称定重量之差<5mg为止。按减失重量和称样量计算

供试样品中水分含量(%)。

2）总灰分：取本品粉末约1g,置已炽灼至恒重的坩埚中,精密称定,缓缓炽灼至

完全炭化,放冷至室温;加硫酸0.5ml使湿润,低温加热至硫酸蒸汽除尽后,在

500-600℃炽灼使完全灰化,移置干燥器内,放冷至室温,精密称定后,再在500~600℃炽灼至恒重。

3）重金属检查：取本品1.0g，按《中国药典》2015年版重金属检查法二法炽

灼破坏,检查10批样品,并同时做空白试验,标准管含Pb10ppm。

4）砷盐检查：取本品1g,精密称定,置坩埚内,按炽灼残渣法操作,使样品完全灰化,加盐酸5ml与水21ml,溶解残渣,收集溶解液,按砷盐检查法第一法(《中国药典》

2015年版)检查,标准管含砷2μg。

4.含量测定：

照高效液相色谱法（通则0512）测定。

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

以甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液（40：65）为流动相；检测波长为230nm。理论板数按芍药苷峰计算应不低于3000。

对照品溶液的制备：取经五氧化二磷减压干燥器中干燥36小时的芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：取本品粗粉约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，浸泡4小时，超声处理20分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl注入液相色谱仪，测定，即得。

本品含芍药苷（C23H28O11）不得少于1.8%。

（二）赤芍总苷的提取

赤芍粗粉100g

加入8倍量70﹪乙醇，三次，

药渣滤液

回收乙醇

减压浓缩

浸膏

1.提取方法：赤芍中所含丰富的苷类成分总称赤芍总苷，为赤芍的主要活性部

位，其中以芍药苷的含量最高，选择芍药苷作为含量测定的指标成分。因此通常采用正交试验设计法。分别取药材若干（通常800g），以不同的提取液（水、乙醇）分别按正交试验设计表试验，滤过，合并滤液，量取体积，即得正交试验各试验的提取液。本实验以乙醇为提取液提取赤芍总苷。

2.影响因素筛选：

1）溶媒的选择

赤芍中所含苷类成分极性较大，在水、乙醇等亲水性溶剂中溶解度较好。本实验以芍药苷的含量为评价指标，考察水和不同浓度的乙醇对芍药苷的提取效率，筛选赤芍药材的最佳提取溶媒，见表1

表1 不同提取溶媒芍药苷含量

实验结果显示，以70％乙醇作为提取溶媒时，提取液中芍药苷含量最高，

故确定70％乙醇为提取川赤芍药材的溶媒，并进一步以正交试验考察提取工艺

条件。

2）正交试验设计优化提取工艺

中药有效成分的提取是中药生产的关键工艺之一。提取工艺首先要考虑有效成分的收率，并缩短操作周期，保证产品质量和经济使实用。因此合理设计提取工艺条件至关重要。在选择了适当的提取溶媒的基础上，以影响活性成分提取率的因素，如溶媒用量、提取时间及提取次数等进行正交设计试验。

a)因素-水平设置

溶剂法提取中影响提取效率的因素主要有溶媒用量、提取时间及提取次数等。根据实际情况，设置醇用量、提取时间及提取次数为3个考察因素，因素-水平设置见表2。

表2 因素-水平表