玉米19 kD醇溶蛋白启动子克隆与植物表达载体构建

玉米19 kD醇溶蛋白启动子克隆与植物表达载体构建

摘要:从玉米自交系9801基因组DNA中克隆了玉米19 kD醇溶蛋白基因(ze19)启动子,将其连接到pMD18-T载体上｡测序结果表明该序列与已报道序列同源性为94%,包含TATAbox､CAATbox启动子基本元件以及GCN4､skn-1､prolamin box ､-300 element等参与调节玉米醇溶蛋白表达及活性的顺式元件｡将克隆的ze19启动子取代质粒pBI121中的35 S启动子,成功构建了由ze19启动子驱动gus报告基因的植物表达载体pBIze19｡利用土壤杆菌介导法将构建好的重组质粒pBIze19转入烟草中,为进一步研究该启动子组织特异性表达奠定了基础｡

关键词:ze19启动子;土壤杆菌介导法;植物表达载体

Cloning of 19 kD Zein Promoter from Maize and Construction of Plant Expression Vector

Abstract: The 19 kD zein(ze19)promoter was amplified from the genomic DNA of maize inbred line 9801, and the sequence was linked to vector pMD18-T. Sequence analysis indicated that the cloned sequence shared 94% homology with the published sequence. The cloned promoter contains the two basic promoter element, TATA box and CAAT box, and several cis-regulatory elements, such as GCN4 motif, skn-1 motif, prolamin box,-300 element, which were necessity for mediating endosperm expression of maize zein. By replacing the 35 S promoter, ze19 promoter was inserted upstream of the β-glucuronidase (gus) reporter gene in plasmid pBI121; and the plant expression vector pBIze19 was constructed.Then tobacco were transformed via Agrobacterium tumefacients mediated procedure, thus a foundation for further research about tissue-specific expression of ze19 promoter was laid.

Key words: ze19 promoter; Agrobaterium tumefacients mediated procedure; plant expression vector

随着植物基因工程的不断完善,人们需要目的基因准确高效地在受体植物特定部位表达,但组成型启动子使基因表达分散而造成目标部位表达量不足,难以满足要求,因此克隆专一的组织特异性启动子成为目前植物基因工程研究的重点[1]｡玉米醇溶蛋白是玉米种子贮藏蛋白的主要成分,占总蛋白的50%~60%｡根据醇溶蛋白一级结构的相似性可分为α､β､γ､δ 4种,其中α-醇溶蛋白由25~50个基因组成的基因家族编码,包括19 kD和22 kD的醇溶蛋白｡由于玉米醇溶蛋白基因的表达具有严格的时空特异性,在种子发育过程中,其表达严格限定在胚乳组织中,一般授粉后10~12 d开始表达[2],因此本实验从玉米基因组中克隆了19 kD醇溶蛋白基因(ze19)的启动子序列,对其结构和功能进行分析,以期构建种子特异性启动子,为玉米种子生物反应器的研究奠定基础｡

1材料与方法

1.1材料和试剂

玉米自交系9801､烟草(Nicotiana tabacum,WT)均来自山东省农业科学院高新技术中心｡大肠杆菌TOP10､土壤杆菌LBA440､植物表达载体pBI121均由山东省科学院中日友好生物技术研究中心保存,克隆载体pMD18-T､各种限制性内切酶和T4 DNA连接酶购自Takara公司,其他化学试剂为国产分析纯,PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成｡

1.2启动子的PCR扩增与克隆

以玉米自交系品种9801幼苗为材料,利用CTAB法[3]提取玉米基因组DNA｡根据Giovinazzo等[4]发表的ze19启动子序列(GenBank登录号为x63667),设计一对特异引物P1:5′ACGAAGCTTAA

CAGACCCGCCTCA3′(划线部分为引入的Hin d Ⅲ酶切位点);P2:5′ACGGGATCCATTGTTGGTACACT

A 3′(划线部分为引入的Bam HⅠ酶切位点)｡以9801玉米基因组DNA为模板,扩增该基因起始密码子上游约 1 400 bp的调控序列｡PCR体系为50 μL,包括10×Buffer 5 μL,10 μmol/L P1 2 μL,10 μmol/L P2 2 μL,10 mmol/L dNTPs 1.2 μL,基因组DNA模板 1 μL,Taq酶0.5 μL,ddH2O 38.3 μL｡PCR反应程序为:94 ℃预变性,5 min;94 ℃变性1 min,50 ℃退火50 s,72 ℃延伸90 s,30个循环;72 ℃延伸10 min｡

扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后,与克隆载体pMD18-T在T4 DNA 连接酶作用下16 ℃保温过夜,构建重组质粒pMD18-ze19｡将连接反应产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞,提取质粒,经PCR､酶切鉴定后,将阳性转化子送上海生工生物工程技术服务有限公司测序,并保存菌种｡

1.3ze19-gus融合表达载体的构建

将重组质粒pMD18-ze19和pBI121-gus分别用Hin dⅢ和Bam HⅠ进行双酶切,在T4 DNA连接酶作用下,16 ℃连接反应过夜,连接反应产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞,利用PCR及酶切方法筛选阳性转化子,并进行测序鉴定,得到植物表达载体pBI ze19-gus,表达载体构建过程如图1所示｡

1.4土壤p

挑取土壤杆菌阳性重组子于含抗生素(50 mg/L Kan,50 mg/L Str)的2 mL YEB液体培养基中,28 ℃过夜培养,转接到20 mL YEB培养基中,28 ℃继续培养至OD600为0.6左右,用刀片将烟草无菌苗叶片边缘部分切去并弃中脉,切成约1 cm2大小作为土壤杆菌侵染外植体,在土壤杆菌菌液中侵染5~10 min,其间不断摇动,侵染