_从发酵液中高效提取L-缬氨酸的工艺研究

2 结果
2．1 L－缬氨酸提取工艺流程 本实验采用黄色短杆菌 XV0505 的发酵 液 ，该
菌株具有 L－亮氨酸和 L－异亮氨酸双缺陷标记，因 此发酵液中没有 L－亮氨酸和 L－异亮氨酸杂酸，主 要杂酸是 L－丙氨酸， 且丙氨酸的含量在 4 g ／ L 以 下，提取工艺中可以考虑先除去菌体蛋白，再进行 浓缩结晶，获得 L－缬氨酸产品，对结晶母液通过离
主要方法。 据报道 ， [1－2] 金属微滤膜处理 L－缬氨酸发 酵液时可有效除蛋白，简化了生产工艺流程，降低了 生产成本。但与同类型的有机膜相比，金属膜价格昂 贵。而有机微孔膜中常用的相对廉价的聚丙烯腈、聚 醚酮、聚偏氟乙烯等材质，已被广泛应用于石油、冶 金、化工、医药纺织等领域。我们采用有机微滤、超滤 膜系统分别去除 L－缬氨酸发酵液中的菌体蛋白和 色素等，主要控制参数为温度和压力。
图 1 L－缬氨酸提取工艺流程
图 2 温度对膜通量的影响
图 3 压力对膜通量的影响
李新涛等：从发酵液中高效提取 L－缬氨酸的工艺研究
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由图 2 可以看出，提高温度有利于膜通量的提 高，但是当温度 达 到 42℃以 后 ，膜 通 量 的 增 加 比 较 缓慢。 这是由于过高的温度会使菌体絮凝，而当菌 体浓度过高时，容易导致菌团阻塞流道；且限于有 机 膜 组 件 对 温 度 的 耐 受 性 （≤48℃ ）， 随 着 温 度 的 增 加，膜组件寿命将大大缩短。 因此，综合考虑有机膜 使用 寿 命 和 能 耗 等 因 素 ， 最 终 选 择 40℃为 操 作 温 度。 由图 3 可知，膜通量与压力成正比关系，但当压 力大于 0．6 MPa 时，膜通量的变化不大。 可见虽然 总体上膜通量随着操作压力增大而上升，但当压力 增大到一定值时，膜通量变化逐渐趋于稳定。 压力 的增大一方面将导致浓差极化现象加重，另一方面 膜面滤层受到挤压而变得更为紧密，失去了低压下 松散的滤层结构，从而使过滤阻力增大，膜通量减 小。 同时，该膜对压力的耐受力为 1．0 MPa。 因此，选 择 1．0 MPa 作 为 微 滤 膜 的 操 作 参 数 。 由 表 1 可 看 出，4 个批次的膜通量均在 70 L ／ （m2·h）以上，缬氨 酸的收率可达 92．1％以上， 蛋白去除率在 91．2％以 上，极大地方便了后续提取工序。
近 年 来 ，L－ 缬 氨 酸 作 为 必 需 氨 基 酸 ， 在 输 液 、 食 品、饲料、农药等方面的应用日益广泛，价格一直较 高，如有廉价高效的生产及提取方法，将可推进 L－ 缬氨酸的应用。 因此，研究 L－缬氨酸的提取方法很 有实用价值。
发酵法生产缬氨酸是一个复杂的生物化学反 应过程。 发酵液呈深黄色浆状，表面有少许泡沫，pH 值为 6．7～7．2，发酵液中的主要成分有培养基的残留 物、代谢产物和菌体。 因此，研究缬氨酸提取工艺、 寻求高效率低成本的提取方法，便成了需要解决的 首要问题。 膜分离技术在常温下操作无相态变化， 分离精度高，选择性强，污染小，因而逐步取代絮凝 法、离心法，成为分离提取氨基酸发酵液中产物的
生物技术通讯
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LETTERS IN BIOTECHNOLOGY Vol．22 No．2 Mar．, 2011
1 材料与方法
1．1 材料 L－缬氨酸发酵液由天津科技大学代谢工程研
究室提供。 752 紫外可见光分光光度计（上海菁华科 技仪器有限公司）；有机膜分离系统（安徽普朗膜技 术有限公司）；旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）； 蠕动泵，离子交换柱，PHSJ－4A 型 pH 计（上海盛 磁 仪器有限公司）。 1．2 有机膜分离技术提取缬氨酸
表 1 适宜操作条件下有机微滤膜过滤实验结果
批次
1 2 3 4
平均通量 ［L ／ （m2·h）］
74±0．3 75±0．3 73Fra Baidu bibliotek0．3 76±0．3
压力 （MPa） 0．6±0．02 0．6±0．02 0．6±0．02 0．6±0．02
温度 （℃） 40±0．3 40±0．3 40±0．3 40±0．3
［收稿日期］ 2010－10－15 ［基金项目］ 国家科技重大专项（2008ZX09401－05）；
天 津 市 科 技 支 撑 计 划 重 点 项 目 （08ZCKFSH01900） ［作者简介］ 李新涛（1975－ ），男，硕士研究生 ［通信作者］ 谢希贤，（E－mail）xixianxie＠tust．edu．cn
见参考文献[5]。
子交换法进一步去除杂酸，回收部分 L－缬氨酸。 综 合考虑， 我们提出 L－缬氨酸的提取工艺流程 （图 1）。 2．2 有机微滤膜分离法去除菌体蛋白
目前，常见的菌体分离方法主要是离心和膜过 滤方法。 离心方法能耗高，在工业化中已逐渐被膜 技术取代。 我们采用有机微滤膜系统，该膜系统具 有操作简单、易于控制、分离时间短、效果好的特 点。 通常情况下，提高温度，分子扩散系数变大，膜 通量提高。 在进膜压力为 0．4 MPa 时，选择 25～45℃ 范围考察温度对膜通量的影响，结果如图 2。 在温度 为 40℃、 过滤压力分别为 0．2、0．4、0．6、0．8、1．0 MPa 时进行有机膜过滤研究， 结果如图 3。 在温度为 40℃、 操作压力为 1．0 MPa 的操作条件下进行 4 批 膜过滤实验，实验前后用高效液相色谱法测定发酵 液与滤液中 L－缬氨酸的含量， 计算 L－缬氨酸过滤 收率，结果见表 1。
收率 蛋白去除率
（％）
（％）
92．1
92．2
93．5
93．5
95．0
91．7
95．2
91．2
2．3 有机超滤膜去除色素 传统去除色素的方法为活性炭脱色，该方法操
作繁琐、周期长、收率低。 我们则采用有机超滤膜系 统进行了 L－缬氨酸的脱色研究。 通常情况下，温度 的升高有利于膜通量的提高，但由于有机超滤膜的 最高操作温度为 42℃，因此在 1．0 MPa 的压力条件 下， 选择 20～40℃的范围考察了温度对膜通量的影 响， 结果如图 4。 在温度为 35℃， 过滤压力分别为 0．8、1．0、1．2、1．4、1．6 MPa 的 条 件 下 进 行 有 机 膜 研 究，结果如图 5。 在操作条件为温度 35℃、操作压力 为 1．4 MPa 的 条 件 下 ，进 行 4 批 膜 过 滤 实 验 ，实 验 前后用高效液相色谱法测定发酵液与滤液中 L－缬 氨酸的含量，计算 L－缬氨酸过滤收率，其结果见表 2。
［中图分类号］ TQ922; Q503
［文献标识码］ A
［文章编号］ 1009－0002(2011)02－0229－05
Study on L －Valine Efficient Extraction Technology from the Fermentation Broth
LI Xin－Tao, XU Qing－Yang, FENG Ning, XIE Xi－Xian, CHEN Ning
College of Biotechnology, Tianjin University of Science ＆ Technology, Tianjin 300457, China
［Abstract］ Objective: Using organic membrane filtration and ion exchange to extract L－valine from the fermentation broth． Methods: The bacteria and proteins in the fermentation broth were removed through organic membrane filtration, the filtrate was concentrated to obtain L－valine crystal products, the part of L－valine was further extracted from the crystal liquor by ion exchange． Results: The optimum conditions of organism membrane filtration, decolour and abstracton of L－valine were determined． 732 resin was the optimal resin for L－valine abstraction among the different kinds of resins． The optimal conditions of adsorption were as follow: dosage liquor pH3．0, and the elution of L－valine was carried out at the rate of 1．0 mL ／ min using 0．4 mol ／ L ammonia water as eluant． The recovery of L－valine was up to 89．2％． Conclution: L－valine extraction yield and product quality was improved by the way of organic membrane filtration and ion exchange． ［Key words］ L－valine; fermentation; extraction; ion exchange
将超滤液在 75℃下减压浓缩至原体积的 1 ／ 3～ 1 ／ 5，调 pH 值为 6．0，降温至 20℃以下，抽滤得到 L－
可溶性蛋白质的测定与色素去除率的测定参 见文献方法[3]； L－缬氨酸含量的测定采用高效液相 色 谱 法 [4]。
微滤－超滤过滤设备由储料罐、泵、微滤及超滤 膜组件、压力表、流量计组成。 所采用的有机微滤膜 分离系统，其截留相对分子质量为 5000，过 滤 面 积 为 0．15 m2，分离方式采用错流过滤方式，操作温度 为 0～50℃，操作压力为 0～1．0 MPa。有机超滤膜分离 系统， 截留相对分子质量 为 800， 过 滤 面 积 为 1．0 m2，操作温度为 0～42℃，操作压力为 0～1．7 MPa。 1．3 静态吸附实验、动态吸附和洗脱实验
生物技术通讯 LETTERS IN BIOTECHNOLOGY Vol．22 No．2 Mar．, 2011
doi: 10．3969 ／ j．issn．1009－0002．2011．02．019
从发酵液中高效提取 L－缬氨酸的工艺研究
229 研究报告
李新涛，徐庆阳，冯宁，谢希贤，陈宁 天津科技大学 生物工程学院，天津 300457
件：选择 732 强酸性阳离子树脂，料液 pH 值为 3．0 左右，用 0．4 mol ／ L 的氨水以 1．0 mL ／ min 的速度 洗 脱 ，L－缬 氨 酸
的收率为 89．2％。 结论：通过有机膜过滤和离子交换法分离提取发酵液中的 L－缬氨酸，可以提高提取收率和产品质
量。
［关键词］ L－缬氨酸；发酵；提取；离子交换
由图 4 可知，提高温度，膜通量提高，但当温 度≥35℃时膜通量趋于稳定。 综合考虑实验结果及 能耗、有机膜使 用 寿 命 等 因 素 ，最 终 选 择 35℃为 操 作温度。 由图 5 可以看出，随着压力的增加，膜通量 会逐渐变大，但是考虑到超滤系统的有机膜使用寿 命及其耐压力(≤1．7 MPa)，选择 1．4 MPa 作为操作 参数。 由表 2 可看出，4 个批次的膜通 量 均 在 69．3 L ／ （m2·h）以上，缬氨酸的收率可达 92．2％以上，色素 去除率在 95．2％以上。 2．4 超滤液浓缩结晶
［摘要］ 目的：利用有机膜过滤和离子交换法分离提取发酵液中的 L－缬氨酸。 方法：通过有机膜过滤，除去发酵液
中的菌体及蛋白，滤液浓缩结晶获得 L－缬氨酸产品，通过离子交换法从结晶母液中回收部分 L－缬氨酸。 结果：确定
了有机微滤膜和超滤膜去除发酵液中菌体蛋白和色素的操作条件；确定了采用离子交换法提取 L－缬氨酸的操作条